泡沫控制方法

2023-09-14 04:23:55

泡沫控制方法
【專利摘要】本發明涉及降低泡沫形成以及使生物表面活性劑在微生物中的表達最大化的方法。所述方法涵蓋從微生物沉澱生物表面活性劑，這導致泡沫形成減少。
【專利說明】泡沬控制方法
[0001]相關申請及引用併入本文
[0002]本申請要求2011年3月29日提交的美國臨時專利申請系列號61/469，067和2012年3月28日提交的美國專利申請系列號13/433，036的優先權。參考在2009年6月9日提交的國際專利申請系列號PCT/US2009/046783，其在2009年12月17日公開為PCT公開第W02009/152176號，並參考在2010年8月10日提交的國際專利申請系列號PCT/US2010/044964，其在 2011 年 2 月 17 日公開為 PCT 公開第 W02011/019686 號。
[0003] 前述申請案，及在其中或者在其審查期間所引證的所有文件(「申請案引證文件」)及在「申請案引證文件」中所引證或者參考的所有文件，及本文中所引證或者參考的所有文件(「本文中引證文件」)及在「本文中引證文件」中所引證或者參考的所有文件，連同用於任何本文中所提及的產品或者在任何以引用方式併入的文件中的任何生產商指示、說明、產品規格和產品介紹，都以引用方式併入本文，並可在本發明的實施中採用。更具體而言，所有參考文件被以引用方式併入至如同每一單獨文件被具體且單獨地指明以引用方式併入的程度。
【技術領域】
[0004]本發明涉及一種控制生物表面活性劑發泡的方法，該生物表面活性劑在以下情況下發泡:在發酵培養基中通過宿主細胞生產該生物表面活性劑期間，當宿主細胞胞外分泌該生物表面活性劑並且該生物表面活性劑可溶於發酵培養基時。該方法包括以下步驟或者基本上由以下步驟組成:在通過宿主細胞生產該生物表面活性劑的同時，使該生物表面活性劑不溶解化。以此方式，發泡受到控制，因為該不溶解化的生物表面活性劑不會發泡。通過這個方法，泡沫減少指數大於1，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3。同樣，另外或者作為另一種選擇，通過這個方法，發酵培養基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg。另外或者作為另一種選擇；和/或至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化。另外或者作為另一種選擇，該方法在不添加消泡劑的情況下進行；或者使得能夠減少在不使該生物表面活性劑不溶解化的情況下所要使用的消泡劑的量，如在不使該生物表面活性劑不溶解化的情況下所要使用的消泡劑的量減少25%或者30%或者40%50%或者60%或者65%或者70%或者75%或者80%或者85%或者90%或者95%或者更多。並且另外或者作為另一種選擇，雖然本發明可以以分批方式或者補料分批方式進行，但本發明有利地涉及連續的方法。本發明還有利地涉及其中該生物表面活性劑為疏水蛋白如疏水蛋白II的方法。本發明還有利地涉及其中該生物表面活性劑為糖脂如鼠李糖脂和槐糖脂或者脂肽如表面活性肽的方法。甚至另外地，本發明涉及用於進行本發明的方法特別是本發明的連續方法的裝置。還另外地，本發明涉及其中通過添加沉澱劑如鹽、醇、水混溶性有機溶劑、水溶性聚合物或者陽離子聚合物，或者通過改變PH，或者通過改變溫度來引起該生物表面活性劑的不溶解化的本發明方法。
【背景技術】[0005]表面活性劑是廣泛用於各種工業的化學品，並且主要是化學合成的。通過多種微生物生產的表面活性劑因其獨特性質而正受到關注，如與合成的對等物相比，生物可降解性更高且毒性譜更低。但是，這種生物法生產的表面活性劑的可供量(available)和成本有限，這部分地因為缺乏有效的生產方法。
[0006]一種用於工業規模生產蛋白質或者酶的有效系統是，進行好氧深層發酵，然後進行水基回收步驟以分離目的產物。但是，泡沫控制對於實現效率是關鍵的。
[0007]在化學工業中，發泡是一個嚴重問題，尤其是對於生化工藝而言。在多種物質如表面活性劑和蛋白質的製造中，特別是在靠近氣液界面處涉及明顯的剪切力的工藝中，如涉及通氣、泵送或者攪拌的那些工藝中，常常有泡沫產生，這是一種不想要的結果。好氧深層發酵依靠足夠的通氣來供應微生物生長和產生目的產物所需要的氧。向發酵液引入空氣以提供微生物所需要的氧會產生泡沫。發酵過程中泡沫的存在通常對發酵的性能有負面影響，包括發酵罐工作體積或者生產率降低，存在與「泡沫溢出」相關的汙染風險，所述「泡沫溢出」例如是液態發酵液上方產生泡沫柱或者泡沫頭達到足夠的高度，以至於它通過通風孔或者管道排出發酵容器。
[0008]常常使用添加劑如消泡劑或者除泡劑來減少發酵期間的泡沫形成。消泡劑按需在回收步驟期間進行添加以控制泡沫。一些回收工藝因消泡劑的存在而受到負面影響，尤其是基於膜的分離工藝。取決於蛋白質或者酶的最終應用，在其生產過程中採用的消泡劑可能需要或者不需要移除。
[0009]但是，化學類的泡沫控制方法由於其可能引起的問題(即汙染、傳質下降)，並不總是合乎需要的，尤其是在產品質量非常重要的食品、飼料和藥品行業中。因為消泡劑通常是疏水的，它們難以進行滅菌，這在食品和藥品行業中會造成問題。此外，這些行業中的監管要求限制了可容許用於消泡劑和除泡劑的化學品。
[0010]可惜的是，用於工業規模生產蛋白質或者酶的常規深層好氧發酵和回收工藝不能有效地應用於該生物表面活性劑(即生物法生產的表面活性劑分子)的生產。在相同的培養條件下，這些分子的表面活性在發酵液中產生的泡沫將比不表達該生物表面活性劑分子的相同微生物會產生的泡沫多得多。
[0011]添加消泡劑並不總是這個問題的令人滿意的解決方案。不僅需要大量的消泡劑來防止過量的泡沫形成，而且通常也需要移除消泡劑以便該表面活性劑如所預期在目標應用中起作用。在一些情況中，即使添加大量的消泡劑並在相對較低工作百分比的發酵罐體積中操作，也不能有效控制發泡。與過量發泡和不受控制的發泡相關的、因消泡劑的使用所致的挑戰，在下遊回收步驟中繼續存在。由於人們需求的是表面活性劑的去汙力，因此在生產步驟中添加的消泡劑通常必須移除。
[0012]在本申請中引證或者確認任何文件並不是承認這種文件可作為本發明的現有技術利用。

【發明內容】

[0013]本發明部分地基於 申請人:出乎意料的發現，即向發酵液添加沉澱劑能使生物表達的表面活性劑沉澱而且發泡減少，其中泡沫不會復發。
[0014]本發明描述與在含水溶液的生產中控制泡沫有關的方法和/或用途，所述含水溶液可包含一種或者多種由微生物表達的表面活性劑。這可通過對溶液進行適當調理(conditioning)而使能發泡的表面活性劑變得不可溶來實現。適當的調理可包括沉澱、結晶和/或任何其他能使表面活性劑不可溶或者減少臨界膠束濃度的操作。
[0015]本發明涵蓋一種控制生物表面活性劑的發泡的方法和/或用途，該生物表面活性劑在以下情況下發泡:在發酵培養基中通過宿主細胞生產該生物表面活性劑期間，當宿主細胞胞外分泌該生物表面活性劑並且該生物表面活性劑可溶於發酵培養基時，所述方法和/或用途可包括在通過宿主細胞生產該生物表面活性劑的同時使該生物表面活性劑不溶解化，由此發泡受到控制，因為該不溶解化的生物表面活性劑不會發泡。
[0016]本發明還涵蓋一種控制生物表面活性劑的發泡的方法和/或用途，該生物表面活性劑在以下情況下發泡:在發酵培養基中通過宿主細胞生產該生物表面活性劑期間，當宿主細胞胞外分泌該生物表面活性劑並且該生物表面活性劑可溶於發酵培養基時，所述方法和/或用途可包括在通過宿主細胞生產該生物表面活性劑的同時使該生物表面活性劑不溶解化，由此發泡受到控制，因為該不溶解化的生物表面活性劑不會發泡，其中泡沫減少指數大於1，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3 ;和/或發酵培養基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進行；和/或與不使該生物表面活性劑不溶解化而進行的方法相比，所述方法用數量減低的消泡劑來進行。
[0017]本發明提供一種通過適當選擇工藝條件而降低生物表面活性劑的可溶性濃度，從而減少或者消除該生物表面活性劑在處於溶液中時所引起的泡沫形成的方法和/或用途。導致該生物表面活性劑的溶解度降低的工藝條件取決於該生物表面活性劑的性質。這種工藝條件可涵蓋物理條件如溫度和/或壓力的適當選擇。這種工藝條件還可涵蓋其中存在該生物表面活性劑的液體介質的化學組成。這種組成的可能選擇是眾多的，並且是生物加工領域技術人員公知的。調節溶解度條件的化學方法涵蓋使用能使該生物表面活性劑不可溶的添加劑，包括pH緩衝化學品、無機或者有機酸或者鹼的鹽、醇、有機溶劑、聚合物、多元醇、蛋白質、吸附劑、核酸、脂質。這個溶解度調節化學品名單不旨在是排他性的或者限制性的。
[0018]本發明還涵蓋製備生物表面活性劑的方法和/或用途，所述方法和/或用途包括本文所提供的泡沫控制或者其(某個或某些)方面。
[0019]本發明因此涉及例如由微生物表達的表面活性劑(或者說生物表面活性劑)的原位不溶解化或者在表達的同時原位不溶解化，包括製備生物表面活性劑的分批工藝或者連續工藝在內，所述工藝包括該生物表面活性劑的原位不溶解化或者在表達的同時原位不溶解化。不溶解化可通過沉澱、結晶[因為EP1320595Yoneda等人；Syldatk等人/1984 ；Desai等人/1993]和/或任何其他能使該表面活性劑不可溶或者降低臨界膠束濃度的操作。有利地，不溶解化包括添加沉澱劑或者基本上由添加沉澱劑組成，所述沉澱劑例如鹽、醇、水混溶性有機溶劑、水溶性聚合物或者陽離子聚合物(如但不限於C581)，或者不溶解化包括PH調節或者基本上由pH調節組成，所述pH調節例如降低pH。不溶解化可包括調節溫度和/或壓力，或者由調節溫度和/或壓力組成，所述調節溫度例如提高溫度或者加熱。在特別有利的實施例中，消泡劑在生物表面活性劑製備中的使用得到減少或者完全避免。在有利的實施例中，生物表面活性劑例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)以小於約0.lg/kg的濃度存在於溶液中。
[0020]本發明還涉及一種控制在生產過程中會發泡的生物表面活性劑在溶液中的發泡的方法和/或用途，所述方法和/或用途可包括在該生物表面活性劑的生產過程中在條件可能會引起泡沫形成的時候，與此同時將該生物表面活性劑進行不溶解化，由此發泡受到控制，因為該不溶解化的生物表面活性劑不會發泡。
[0021]在另一個實施例中，本發明還涉及一種控制在生產過程中會發泡的生物表面活性劑的發泡的方法和/或用途，所述方法和/或用途可包括在通過宿主細胞在溶液中生產生物表面活性劑的同時將該生物表面活性劑進行不溶解化，控制發泡使得:泡沫減少指數大於1，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3 ;和/或溶液中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進行；和/或與不加以不溶解化而進行的方法相t匕，所述方法用數量減低的消泡劑來進行。
[0022]在又另一個實施例中，本發明涉及一種控制生物表面活性劑在生產過程中的發泡的方法和/或用途，所述方法和/或用途可包括在生物表面活性劑的生產過程中控制組合物的條件以減少泡沫，這可包括調節該組合物中的條件以減少發泡，使得泡沫減少指數大於1，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3 ;和/或發酵培養基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進行；和/或與不加以不溶解化而進行的方法相比，所述方法用數量減低的消泡劑來進行；和/或所述方法在約4.0的pH下進行。
[0023]本發明的有益效果適用於生物表面活性劑處理的所有階段，包括發酵、回收、配製、保藏、裝卸和運輸。 具體地講，有益效果尤其適用於涉及通氣的生物表面活性劑處理階段，如但不限於混合、泵送和排氣。
[0024]本發明還涵蓋本文所描述的裝置，包括在本文描述的方法或者工藝或者它們的(某個或者某些)方面的實施中採用在內。
[0025]因此，本發明的一個目標是不將任何之前知道的產品、製造該產品的工藝或者使用該產品的方法涵蓋在本發明內，從而本 申請人:保留權利並據此公開對任何之前知道的產品、工藝或者方法的棄權。要進一步指出的是，本發明不旨在將任何不符合美國專利商標局(USPT0，35U.S.C.§ 112，第一段)和歐洲專利局(ΕΡ0，歐洲專利公約(EPC)的第83條)的書面說明和可實施性要求的產品、工藝或者該產品的製造或者使用該產品的方法涵蓋在本發明內，從而本 申請人:保留權利並據此公開對任何之前描述的產品、製造該產品的工藝或者使用該產品的方法的棄權。
[0026]應指出，在本公開說明書中特別是在權利要求書和/或段落中，術語「包含」(各種語法形式)可具有美國專利法中賦予它的含義；例如，它可以意指「包括」(各種語法形式);而術語「實質上由…組成」(各種語法形式)具有美國專利法中賦予它的含義，例如它允許沒有明確敘及的要素，但排除在現有技術中存在的要素或者影響本發明的基本特徵或者新特徵的要素。
[0027]要特別一提的是，「基本上由……組成」的使用是為了在技術可達的任何程度上區分美國專利公開第20100151525號及與其等同的任何文件，例如在主題上和/或專利法上(例如，通過作為EP08171868或者要求EP08171868的優先權或者與EP08171868同族)區分。例如，在本發明中，卡拉膠的任何使用不需伴隨著降低pH (特別是例如低於3.0或者
3.5)和/或調節離子強度；並且，pH的任何降低不需伴隨著使用卡拉膠和/或調節離子強度，並且離子強度的任何調節不需伴隨著降低PH和/或使用卡拉膠。因此，「基本上由……組成」排除現有技術的要素，如加入卡拉膠並使PH低於3.5或者3，或者加入卡拉膠、使pH低於3.5或者3並調節離子強度。
[0028]還要一提的是，某些術語也特別意在排除在任何可能屬現有技術的文件中的要素。例如，術語「生物表面活性劑」特別意在排除PCT公開第W02009/152176號的酶主題。類似地，在沒有或者不存在添加的消泡劑的情況下實施，這種說法是為了區分允許消泡劑存在或者添加的文件，例如美國專利公開第20100291630號及其任何等同文件。
[0029]這些和其他的實施例被以下「【具體實施方式】」公開，或者由以下「【具體實施方式】」顯而易見並被其所涵蓋。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]以下「【具體實施方式】」是以舉例方式給出，並不旨在使本發明僅限於所描述的具體實施例；結合附圖可更好地理解以下「【具體實施方式】」。
[0031]圖1不出混合後的疏水蛋白溶液(左)和混合併熱處理後的疏水蛋白溶液(右)。
[0032]圖2示出用改進的發酵法生產的疏水蛋白的MALD1-T0F譜圖。7180處的峰對應於全長疏水蛋白分子。
[0033]圖3A和3B示出代表性的生物反應器。細胞、培養基和/或營養物可通過輸入部件102提供到反應器100。輸入部件102可包括閥門104，該閥門用來控制生物體和/或培養基向該容器的遞送。細胞和培養基可通過輸入部件102提供。多個傳感器106可設置在反應器100當中的各個位置。`傳感器106給控制器108，110提供數據。控制器108，110能夠控制細胞、培養基、營養物、沉澱劑和/或其他組分的量。沉澱的組分可用傳感器106檢測。在一些實施例中，在反應器100中可存在窗口 116以便使用者觀察反應器中的狀況。控制器108與輸出閥門112連接。控制器110可指導閥門112打開以讓沉澱物通過輸出部件114離開該罐。在一些實施例中，使用者的輸入可讓控制器指導閥門112按需打開和/或關閉。營養物可用輸入部件118提供到反應器。輸入部件118可連接到遞送裝置120以給反應器100提供營養物。一些實施例包括混合器122以促進反應器中的各組分的混合。
[0034]圖4顯示如實例20中所描述在氯化鈣處理後測得，含有表面活性肽的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發酵液中的泡沫形成減少。
【具體實施方式】
[0035]除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常所理解的含義。為了清楚起見，定義了以下縮寫和/或術語。
[0036]本文所用的「生物表面活性劑」或者「生物法產生的表面活性劑」屬於會引起發泡的物質。生物表面活性劑或者生物法產生的表面活性劑可降低表面張力，如水和疏水液體或者水和空氣之間的界面張力，其可從生物系統產生或者獲得。生物表面活性劑或者生物法產生的表面活性劑可以是蛋白質、糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂、中性脂質或者脂肪酸。生物表面活性劑包括疏水蛋白。生物表面活性劑包括脂肽和脂蛋白，如表面活性肽、肽-脂質、沙雷溼潤素(serrawettin)、黏液菌素、枯草桿菌蛋白酶、短桿菌肽、多粘菌素。生物表面活性劑包括糖脂如鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂和纖維二糖脂。生物表面活性劑包括聚合物如乳化膠(emulsan)、biodispersan、甘露聚糖-脂質-蛋白質、脂乳化劑(Iiposan)、碳水化合物-蛋白質-脂質、蛋白質PA。生物表面活性劑包括顆粒物如泡囊、菌毛和全細胞。生物表面活性劑包括糖苷如皂苷類。生物表面活性劑包括纖維狀蛋白質如絲心蛋白。生物表面活性劑可自然產生，或者它可以是自然界中不存在的經誘變或者遺傳工程改造的變體。這包括為了降低溶解度已進行了工程改造，以便有助於通過根據本發明降低生物表面活性劑溶解度而控制發泡的生物表面活性劑變體。生物表面活性劑包括但不限於本文所描述的相關生物表面活性劑、衍生生物表面活性劑、變體生物表面活性劑和同源生物表面活性劑。
[0037]本文所用的「生物系統」包含活生物或者衍生自活生物，所述活生物如微生物、植物、真菌、昆蟲、脊椎動物或者通過合成生物學產生的生命形式。活生物可以是通過經典育種、克隆選擇、誘變和類似的用以產生遺傳多樣性的方法所獲得的、自然界中不存在的變體，或者它可以是通過重組DNA技術獲得的遺傳工程生物體。活生物可以整體使用，或者它可以是諸如器官培養物、植物栽培種、混懸細胞培養物、貼壁細胞培養物或者無細胞製劑的組分的來源。
[0038]生物系統當隔離(sequester)生物表面活性劑時可含有或者不含有活細胞。生物系統可從自然來源找到並採集，它可進行耕種、培養，或者它可在工業條件下栽培。生物系統可從所供應的前體或者營養物合成生物表面活性劑，或者它可從它的環境富集生物表面活性劑。
[0039]本文所用的「生產」涉及用於生產化學品和生物製品的製造方法，包括但不限於收穫、採集、壓縮、放血、浸潰、均質、糖化、釀造、發酵、回收、固液分離、細胞分離、離心、過濾(如真空過濾)、配製、保藏或者運輸`。
[0040]本文所用的「工藝條件」指涉及本發明方法的溶劑和/或物理參數選擇(如但不限於溫度、壓力、混合或者pH)。
[0041]本文所用的「溶劑」或者「溶液」涉及可含有不溶性生物表面活性劑之外的懸浮顆粒的液體，所述懸浮顆粒如但不限於身體部分、植物片段、活細胞或者死細胞[因為EP1320595Yoneda 等人；Syldatk 等人 /1984 ；Desai 等人 /1993]。
[0042]本文所用的「可溶性」涉及溶解在溶劑或者溶液中的物質。
[0043]本文所用的「泡沫」涉及通過將氣泡截留在液體中、凝膠中或者半固體中而形成的物質。
[0044]本文所用的「膨脹度(overrun) 」是一種計算值,涉及發泡溶液的體積減去起始體積再除以起始體積，以分數或者百分數報告。膨脹度為零意味著溶液不含泡沫。數值接近於零意味著溶液具有極少的泡沫。在初始樣品已經含有泡沫的情況中，在計算中用初始重量替代初始體積。
[0045]本文所用的「泡沫減少指數」或者「泡沫控制指數」或者「泡沫打破指數」是某種處理在控制泡沫方面的有效性的度量。它是未處理的溶液與經處理的溶液的膨脹度之比。泡沫減少指數等於約I意味著未處理的和經處理的生物表面活性劑溶液具有相同的膨脹度，換句話說，該處理沒有帶來改進。任何大於I的數值意味著泡沫減少，該處理帶來改進。
[0046]本文所用的「泡沫控制」、「泡沫減少」或者「泡沫打破」涉及通過防止或者阻礙或者摧毀或者破壞泡沫來減少溶液中的泡沫的行動。
[0047]如本文所用，術語「多肽」和「蛋白質」可互換使用，是指通過肽鍵連接的包含胺基酸殘基的任意長度的聚合物。本文使用胺基酸殘基的常規單字母密碼或三字母密碼。聚合物可為直鏈或支鏈的，其可包含經修飾的胺基酸，並且其可被非胺基酸隔斷。所述術語還涵蓋天然改性或通過幹預改性的胺基酸聚合物；所述幹預例如是二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或改性，如與標記組分綴合。在所述定義中還包括(例如)包含胺基酸的一種或者多種類似物(包括，例如非天然胺基酸、D-胺基酸等)的多肽，以及本領域中已知的其他修改形式。
[0048]本文所用的「培養物溶液」是包含目的生物表面活性劑和其他可溶性或者不溶性組分的液體。這種組分包括其他蛋白質、非蛋白質類雜質如細胞和細胞碎片、核酸、多糖、月旨質、化學品如消泡劑、絮凝劑、鹽、糖、維生素、生長因子、沉澱劑等。「培養物溶液」還可以被稱為「蛋白質溶液」、「液體培養基」、「滲濾培養液」、「澄清培養液」、「濃縮物」、「經調理的培養基」、「發酵培養液」、「裂解培養液」、「裂解物」、「細胞培養液」或者簡稱「培養液(broth)」。如果存在細胞的話，細胞可以是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、人細胞、昆蟲細胞、合成細胞等。
[0049]本文所用的術語「回收」指這麼一種過程，在該過程中使包含生物表面活性劑和一種或者多種不想要的組分的液體培養物經歷一些工藝，以將生物表面活性劑與不想要的組分中的至少一些分離開來，所述不想要的組分例如水、細胞和細胞碎片、其他蛋白質、胺基酸、多糖、糖、多元醇、無機或者有機鹽、酸和鹼、以及顆粒材料。
[0050]本文所用的「生物表面活性劑產品」指適合提供給最終用戶如消費者的生物表面活性劑製品。生物表面活性劑產品可包括細胞、細胞碎片、培養基組分、配製賦形劑如緩衝齊?、鹽、防腐劑、還原劑、糖、多元醇、表面活性劑等，添加或者保留所述配製賦形劑是為了延長生物表面活性劑的功能貨架期或者有利於生物表面活性劑的最終應用。
[0051]本文所用的功能上和/或結構上類似的生物表面活性劑被認為是「相關生物表面活性劑」。這種生物表面活性劑可衍生自不同屬和/或種的生物，或者甚至不同類別的生物(例如細菌和真菌)。相關生物表面活性劑還涵蓋通過一級序列分析確定的、通過三級結構分析確定的或者通過免疫交叉反應性確定的同源物。
[0052]本文所用的術語「衍生生物表面活性劑」可指這樣的蛋白質基生物表面活性劑，其是通過將一個或多個胺基酸添加到C端和/或N端、在胺基酸序列中的一個或多個不同位點處置換一個或多個胺基酸、和/或在該蛋白質的一端或兩端或胺基酸序列中的一個或多個位點處缺失一個或多個胺基酸、和/或在該胺基酸序列中的一個或多個位點處插入一個或多個胺基酸而衍生自某種生物表面活性劑。生物表面活性劑衍生物的製備可通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列、將該DNA序列轉化到合適的宿主中以及表達該經修飾的DNA序列以形成該衍生蛋白質來實現。「衍生生物表面活性劑」還可涵蓋其中脂質部分或者碳水化合物部分已在合成過程中或者合成之後連接到蛋白質主鏈的生物表面活性劑衍生物。
[0053]本文所用的術語「衍生生物表面活性劑」或者「變體生物表面活性劑」可指這樣的脂質基和/或糖基生物表面活性劑，其是通過添加一個或者多個脂質和/或糖、在一個或者多個不同的位點處置換一個或者多個脂質和/或糖、和/或在分子的一端或者兩端或者在結構內的一個或者多個位點處缺失一個或者多個脂質和/或糖、和/或在結構的一個或者多個位點處插入一個或者多個脂質和/或糖而衍生自某種生物表面活性劑。
[0054]相關(和衍生)生物表面活性劑包括「變體生物表面活性劑」。變體蛋白質基生物表面活性劑與參考/親本生物表面活性劑(例如野生型生物表面活性劑)差別在於少數胺基酸殘基處的置換、缺失和/或插入。不同的胺基酸殘基的數量可以為一個或多個胺基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多個胺基酸殘基。變體生物表面活性劑與野生型生物表面活性劑共有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或者甚至至少約99%或者更高的胺基酸序列同一性。變體生物表面活性劑與參考生物表面活性劑的差異還可在於選定的模體、結構域、表位、保守區等。
[0055]本文所用的術語「類似序列」是指蛋白質基生物表面活性劑內的提供與生物表面活性劑相似的功能、三級結構和/或保守殘基的序列。例如，在包含α-螺旋或β-片層結構的表位區域中，類似序列中的置換胺基酸優選地保持相同的特定結構。所述術語還指核苷酸序列以及胺基酸序列。在一些實施例中，開發了類似序列，使得置換胺基酸導致變體酶顯示相似或改進的功能。在一些實施例中，生物表面活性劑中的胺基酸三級結構和/或保守殘基位於目的區段或者片段之處或者附近。因此，在目的區段或片段包含(例如)α-螺旋或β -片層結構的情況下，置換胺基酸優選地保持該特定結構。
[0056]本文所用的術語「同源生物表面活性劑」指具有與參考生物表面活性劑相似的活性和/或結構的生物表面活性劑。這並不意味著各同源物一定在進化上相關。因此，意圖的是該術語涵蓋從不同生物體獲得相同、相似或者相應的生物表面活性劑(即，就結構和功能而言)。在一些實施例中，希望鑑定具有與參考生物表面活性劑相似的四級、三級和/或一級結構的同源物。
[0057]序列之間同源性的程度可使用本領域中已知的任何合適的方法確定(參見如Smith 和 Waterman, (198 1)，《應用數學進展》(Adv.Appl.Math.) ,2:482 ；Needleman 和ffunsch, (1970),《分子生物學雜誌》(J.Mol.Biol.), 48:443 ;Pearson 和 Lipman, (1988),《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444 ;程序，諸如在威斯康星遺傳學軟體包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麥迪遜市遺傳學計算機小組(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux 等人,(1984),《核酸研究》(NucleicAcids Res.), 12:387-395。
[0058]例如，PILEUP是可用於測定序列同源程度的程序。PILEUP使用漸進式逐對比對從一組相關序列產生多個序列對比。其還能夠繪製顯示聚類關係(用於產生比對)的樹形圖。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進式比對方法(Feng和Doolittle, (1987)，《分子進化雜誌》(J.Mol.Evol.) ,35:351-360)。所述方法與Higgins和Sharp描述的方法類似(Higgins和Sharp，(1989)，《計算機在生物科學中的應用》(CABIOS)，5:151-153)。可用的PILEUP參數包括:默認間隙權重3.00、默認間隙長度權重0.10，以及加權末端間隙。可用的算法的另一個例子為Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，(1990)，《分子生物學雜誌》(J.Mol.Biol.),215:403-410 ;以及Karlin等人，(1993)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，90:5873-5787)。一種特別有用的 BLAST 程序為 WU-BLAST-2 程序(參見 Altschul 等人，(1996)，《酶學方法》(Meth.Enzymol.),266:460-480)。參數 「W」、「T」和「X」確定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認值:字長(W) 1UBL0SUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，(1989)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915)比對⑶50次、預期(E) 10、if 5、N' _4，對兩條鏈進行比較。[0059]如本文所用，在至少兩條核酸或多肽的情況下，短語「基本上類似」和「基本上相同」通常意味著多核苷酸或多肽包含的序列與參考(即，野生型)序列相比具有至少約70%的同一性、至少約75%的同一性、至少約80%的同一性、至少約85%的同一性、至少約90%的同一性、至少約91%的同一性、至少約92%的同一性、至少約93%的同一性、至少約94%的同一性、至少約95%的同一性、至少約96%的同一性、至少約97%的同一性、至少約98%的同一性、或甚至至少約99%的同一性或更高的同一性。序列同一性可使用諸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類的已知程序，使用標準參數測定。(參見例如Altschul等人，(1990)，《分子生物學雜誌》(J.Mol.Biol.),215:403-410 ;Henikoff等人，(1989)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915 ；Karin 等人，(1993)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，90:5873 ;以及 Higgins 等人，(1988)，《基因》(Gene)，73:237-244)。進行BLAST分析的軟體可通過美國國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information)公開獲得。另外，可使用FASTA對資料庫進行搜索(Pearson等人，(1988)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444-2448)。兩條多肽實質上相同的一個指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應性的。通常，因保守胺基酸置換而不同的多肽是免疫交叉反應性的。因此，一種多肽與第二多肽實質上一致，例如，在此情況下兩個多肽僅因保守置換而不同。兩種核酸序列實質上一致的另一個指示是兩種分子在嚴格的條件(如，在中至高嚴格度的範圍內)下彼此雜交。
[0060]本文所用的「野生型」和「天然」生物表面活性劑是自然界中存在的那些生物表面活性劑。術語「野生型序列」和「野生型基因」在本文中互換使用，是指天然的或天然存在於宿主細胞內的序列。在一些實施例中，野生型序列是指為蛋白質工程項目的起始點的目的序列。編碼天然形成的蛋白質的基因可依據本領域內的技術人員已知的一般方法獲得。所述方法一般包括合成出具有編碼生物表面活性劑的區域的推定序列的標記探針，從表達該蛋白質的生物體製備基因組文庫，並通過與探針的雜交對文庫篩選目的基因。然後對陽性雜交克隆進行定位和測序。
[0061 ] 本文所用的「不溶性」或者「不溶解化的」涉及難溶或者極其難溶的化合物。可通過對Iml樣品在14，000 X g下進行高速離心10分鐘，使化合物的不溶性級分與可溶性級分分離。作為另一種選擇，可通過濾過0.45 μ m膜過濾器(例如Millipore DuraporelL瓶頂過濾器)，使不溶性級分與可溶性級分分離。不溶性級分在離心後會在沉澱中，或者在過濾後保留在過濾器上。作為另一種選擇，可通過濁度或者混濁的出現檢測之前澄清的溶液的不溶解化。作為另一種選擇，可通過光學顯微鏡術檢測不溶性顆粒如晶體或者沉澱物。
[0062]本文所用的「沉澱」涉及通過化學反應或者通過物理條件的改變造成從化合物的溶液中形成該化合物的不可溶形式。本文所用的「沉澱劑」涉及造成沉澱的物質。
[0063]本文所用的「CMC」涉及臨界膠束濃度，其可指表面活性劑的這麼一個濃度，在該濃度以上會形成膠束，幾乎所有加到該系統的額外表面活性劑都進入膠束。CMC是表面活性劑的重要特徵。在達到CMC之前，表面張力隨著表面活性劑濃度的變化而劇烈變化。在達到CMC之後，表面張力保持相對恆定或者以較小的斜率變化。特定分散劑在特定介質中的CMC的數值取決於溫度、壓力，並且(有時強烈地)取決於其他表面活性物質和電解質的存在和濃度。膠束僅在臨界膠束溫度以上才形成。本文所用的「減低CMC」具有與降低生物表面活性劑的溶解度相同的作用，因為它降低表面活性劑在溶液中的濃度，從而減少泡沫形成。[0064] 本文所用的「宿主細胞」可以是任何在其中產生生物表面活性劑的細胞，無論是天然產生還是通過重組方法產生。宿主細胞可包括但不限於傘菌屬(Agaricus spp.)(例如雙孢蘑燕(Agaricus bisporus))、田頭燕屬(Agrocybe spp.)(例如楊樹燕(Agrocybeaegerita))、阿耶羅菌屬(Ajellomyces spp.)(例如莢膜阿耶羅菌(Ajellomycescapsulatus)、皮炎阿耶羅菌(Ajellomyces dermatitidis))、麴黴屬(Aspergillus spp.)(例如 Aspergillus arvi1、短柄麴黴(Aspergillus brevipes)、棒麴黴(Aspergillusclavatus)、硬柄麴黴(Aspergillus duricaulis)、捕圓麴黴(Aspergillus ellipticus)、黃麴黴(Aspergillus flavus)、煙麴黴(Aspergillus fumigatus)、煙束麴黴(Aspergillusfumisynnematus)、遲緩麴黴(Aspergillus lentulus)、黑麴黴(Aspergillus niger)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、單側麴黴(Aspergillus unilateralis)、綠垂麴黴(Aspergillus viridinutans))、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)(例如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或者枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、白僵菌屬(Beauveria spp.)(例如球抱白僵菌(Beauveria bassiana))、假絲酵母屬(Candidaspp.)(例如 Candida bogoriensis、Candida bombicola)、麥角菌屬(Claviceps spp.)(例如紡錘麥角菌(Claviceps fusiformis))、球抱子菌屬(Coccidioides spp.)(例如 Coccidioides posadasii)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus spp.)(例如異旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus))、毛皮傘屬(Crinipellis spp.)(例如 Crinipellisperniciosa)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria spp.)(例如寄生隱叢赤殼菌(Cryphonectriaparasitica) )、Davidiella 屬(Davidiella spp.)(例如 Davidiella tassiana)、網筆石屬(Dictyonema spp.)(例如光葉網筆石(Dictyonema glabratum))、裸胞殼屬(Emericella spp.)(例 如構巢裸抱殼(Emericella nidulans)、埃希氏菌屬(Escherichiaspp.)(例如大腸桿菌(Escher ichia coli))、小火焰菌屬(Flammulina spp.)(例如金針燕(Flammulina velutipes))、德刀菌屬(Fusarium spp.)(例如黃色德刀菌(Fusariumcu Imorum))、赤黴屬(Gib berella spp.)(例如串珠狀赤黴(Gibberella moniliformis))、小叢殼屬(Glomerella spp.)(例如禾生小叢殼(Glomerella graminicola))、樹花菌屬(Grifola spp.)(例如灰樹花(Grifola frondosa))、漢遜酵母屬(Hansenula spp.)(例如多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))、異擔子屬(Heterobasidionspp.)(例如松根異擔子(Heterobasidion annosum))、肉座菌屬(Hypocreaspp.)(例如紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina) )、Hypocrea lixi1、綠色肉座菌(Hypocrea virens))、克魯維酵母屬(Kluyveromyces spp.)(例如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis))、錯蘑屬(Laccaria spp.)(例如雙色錯蘑(Laccaria bicolor))、香燕屬(Lentinulaspp.)(例如香燕(Lentinula edodes))、巨座殼屬(Magnaporthe spp.)(例如稻痕病菌(Magnaporthe oryzae))、小皮傘屬(Marasmius spp.)(例如 Marasmius cladophyllus)、Moniliophthora 屬(Moniliophthora spp.)(例如 Moniliophthora perniciosa)、新薩託菌屬(Neosartorya spp.)(例如淺黃新薩託菌(Neosartorya aureola)、芬尼新薩託菌(Neosartorya fennelliae)、費希新薩託菌(Neosartorya fischeri)、光滑新薩託菌(Neosartorya glabra)、平土冢新薩託菌(Neosartoryahiratsukae)、NeosartoryanishimuraeλNeosartorya otani1、假費希新薩託菌(Neosartorya pseudof ischeri)、四繞新薩託菌(Neosartorya quadricincta)、匙囊新薩託菌(Neosartorya spathulata)、剌抱新薩託菌(Neosartorya spinosa)、寬脊新薩託菌(Neosartorya stramenia)、Neosartoryaudagawae)、脈抱菌屬(Neurospora spp.)(例如粗糖脈胞菌(Neurospora crassa)、陷脈抱菌(Neurospora discreta)、間型脈抱菌(Neurospora intermedia)、好食脈抱菌(Neurospora sitophila)、四抱脈抱菌(Neurospora tetrasperma))、裡予村菌屬(Nomuraeaspp.)(例如萊氏野村菌(Nomuraea rileyi))、長_殼屬(Ophiostoma spp.)(例如新榆枯萎病菌(Ophiostoma novo-ulmi)、Ophiostomaquercus)、副球抱子菌屬(Paracoccidioidesspp.)(例如巴西副球抱子菌(Paracoccidioides brasiliensis))、釘抱屬(Passaloraspp.)(例如 Passalora fulva)、粧燕菌屬(Paxillus spp.)(例如長絲粧燕(Paxillusfilamentosus)、卷邊粧燕(Paxillus involutus))、青黴屬(Penicillium spp.)(例如沙門桕乾酪青黴(Penicillium camemberti)、產黃青黴(Penicillium chrysogenum)、馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei) )、Phlebiopsis 屬(Phlebiopsis spp.)(例如大伏革菌(Phlebiopsis gigantea))、畢赤酵母屬(Pichia spp.)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、豆馬勃屬(Pisolithus)(例如彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius))、側耳屬(Pleurotus spp.)(例如平燕(Pleurotus ostreatus))、足抱蟲屬(Podospora spp.)(例如 柄孢殼菌(Podospora anserina))、泊氏孔菌屬(Postiaspp.)(例如臥孔菌(Postia placenta))、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)(例如銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosam)、焚光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas pyocyanea)、核腔菌屬(Pyrenophora spp.)(例如偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis))、酵母菌屬(Saccharomyces spp.)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces spp.)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、裂糟菌屬(Schizophyllum spp.)(例如裂糟菌(Schizophyllum commune)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp.)(例如變鉛青鏈黴菌(Streptomyces Iividans))、籃狀菌屬(Talaromyces spp.)(例如柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus))、球擬酵母屬(Torulopsis spp.)、木黴屬(Trichodermaspp.)(例如棘抱木黴(Trichoderma asperellum)、深綠木黴(Trichoderma atroviride)、綠色木黴(Trichoderma viride)、裡`氏木黴(Trichoderma reesii)[以前稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)])、口蘑屬(Tricholoma spp.)(例如掠灰口蘑(Tricholomaterreum) )、Uncinocarpus 屬(Uncinocarpus spp.)(例如 Uncinocarpus reesii)、輪枝抱屬(Verticillium spp.)(例如大_輪枝抱(Verticillium dahliae) )、Xanthodactylon 屬(Xanthodactylon spp.)(例如(Xanthodactylon flammeum)、石黃衣屬(Xanthoria spp.)(例如 Xanthoria calcicola、Xanthoria capensis、Xanthoria ectaneoides、XanthoriaflammeaλXanthoria karrooensis、Xanthoria ligulata、石黃衣(Xanthoria parietina)、Xanthoria turbinata)或者亞羅酵母屬(Yarrowia spp.)(例如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica))。
[0065] 本發明的方法可應用於任何生物表面活性劑從培養液的分離。有利地，生物表面活性劑是由微生物分泌的可溶性胞外生物表面活性劑。一組示例性的生物表面活性劑是疏水蛋白，其是由絲狀真菌表達和/或衍生自絲狀真菌的一類富含半胱氨酸的多肽。疏水蛋白是小的(約100個胺基酸)多肽，因其在物體(包括細胞和人造材料)的表面上形成疏水覆層的能力而知名。疏水蛋白最初於1991年在裂糟菌(Schizophyllum commune)中發現，現已在多種絲狀真菌中確認。基於親水性(hydropathy)和其他生物物理性質的差異，疏水蛋白被歸類為I類和II類。基於保守胱氨酸殘基的特徵性間距和疏水性模式，疏水蛋白被分為兩個不同的類別(I類和II類)(Kershaw和Talbot，1998，《真菌遺傳生物學》(Fungal Genet Biol)，23:18 - 23 ;以及，2001，《微生物學年度評論》(Annu
RevMicrobiol)，55:625 - 646)。II類疏水蛋白的例子參見例如Linder等人，(2005)，《歐洲微生物學會聯合會微生物學評論》(FEMS Microbiologyreviews)，29:877-96 ；以及Kubicek等人，(2008)，《BMC 進化生物學》(BMC Evolutionary Biology)，8: 4。
[0066]疏水蛋白的表達通常需要在發酵過程中添加大量的一種或者多種消泡劑。否則，疏水蛋白多肽所產生的泡沫會使通氣裝置過濾器飽和，汙染放氣孔，造成壓力積聚和降低蛋白質產率。結果，疏水蛋白的粗濃縮物常常含有殘餘量的消泡劑以及宿主細胞汙染物，這在疏水蛋白製品中是不合需要的，尤其是當疏水蛋白要作為食品添加劑時。
[0067]疏水蛋白可以可逆地以具有比其實際分子量大的表觀分子量的形式存在，這使得疏水蛋白很適合用本發明方法進行回收。含有疏水蛋白的液體或者泡沫可如所描述連續地或者定期地從發酵罐收穫以進行蛋白質回收，或者在發酵操作結束時批式收穫。
[0068]疏水蛋白可以是本領域知道的任何I類和II類疏水蛋白，例如來自以下生物的疏水蛋白:傘菌屬(Agaricus spp.)(例如雙孢蘑燕(Agaricus bisporus))、田頭燕屬(Agrocybe spp.)(例如楊樹燕(Agrocybe aegerita))、阿耶羅菌屬(Ajellomycesspp.)(例如莢膜阿耶羅菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎阿耶羅菌(Ajellomycesdermatitidis))、麴黴屬(Aspergillus spp.)(例如 Aspergillus arvi1、短柄麴黴(Aspergillus brevipes)、棒麴黴(Aspergillus clavatus)、硬柄麴黴(Aspergillusduricaulis)、捕圓麴黴(Aspergillus ellipticus)、黃麴黴(Aspergillus flavus)、煙麴黴(Aspergillus fu`migatus)、煙束麴黴(Aspergillus fumisynnematus)、遲緩麴黴(Aspergillus lentulus)、黑麴黴(Aspergillus niger)、單側麴黴(Aspergillusunilateralis)、綠垂麴黴(Aspergillus viridinutans))、白僵菌屬(Beauveria spp.)(例如球孢白僵菌(Beauveria bassiana))、麥角菌屬(Claviceps spp.)(例如紡錘麥角菌(Claviceps fusiformis))、球抱子菌屬(Coccidioides spp.)(例如 Coccidioidesposadasii)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus spp.)(例如異旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus))、毛皮傘屬(Crinipellis spp.)(例如 Crinipellis perniciosa)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria spp.)(例如寄生隱叢赤殼菌(Cryphonectria parasitica))、Davidiella 屬(Davidiella spp.)(例如 Davidiella tassiana)、網筆石屬(Dictyonemaspp.)(例如光葉網筆石(Dictyonema glabratum))、裸胞殼屬(Emericella spp.)(例如構巢裸胞殼構巢裸孢殼(Emericella nidulans))、小火焰菌屬(Flammulina spp.)(例如金針燕(Flammulina velutipes))、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)(例如黃色鐮刀菌(Fusariumcu Imorum))、赤黴屬(Gibberella spp.)(例如串珠狀赤黴(Gibberella moniliformis))、小叢殼屬(Glomerella spp.)(例如禾生小叢殼(Glomerella graminicola))、樹花菌屬(Grifola spp.)(例如灰樹花(Grifola frondosa))、異擔子屬(Heterobasidionspp.)(例如松根異擔子(Heterobasidion annosum))、肉座菌屬(Hypocrea spp.)(例如紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、Hypocrea lixi1、綠色肉座菌(Hypocrea virens))、錯蘑屬(Laccaria spp.)(例如雙色錯蘑(Laccaria bicolor))、香燕屬(Lentinulaspp.)(例如香燕(Lentinula edodes))、巨座殼屬(Magnaporthe spp.)(例如稻痕病菌(Magnaporthe oryzae))、小皮傘屬(Marasmius spp.)(例如 Marasmius cladophyllus)、Moniliophthora 屬(Moniliophthora spp.)(例如 Moniliophthora perniciosa)、新薩託菌屬(Neosartorya spp.)(例如淺黃新薩託菌(Neosartorya aureola)、芬尼新薩託菌(Neosartorya fennelliae)、費希新薩託菌(Neosartorya fischeri)、光滑新薩託菌(Neosartorya glabra)、平土冢新薩託菌(Neosartorya hiratsukae)、Neosartoryanishimurae、Neosartoryaotani1、假費希新薩託菌(Neosartorya pseudof ischeri)、四繞新薩託菌(Neosartorya quadricincta)、匙囊新薩託菌(Neosartorya spathulata)、剌抱新薩託菌(Neosartorya spinosa)、寬脊新薩託菌(Neosartorya stramenia)、Neosartoryaudagawae)、脈抱菌屬(Neurospora spp.)(例如粗糖脈胞菌(Neurospora crassa)、陷脈抱菌(Neurospora discreta)、間型脈抱菌(Neurospora intermedia)、好食脈抱菌(Neurospora sitophila)、四抱脈抱菌(Neurospora tetrasperma))、裡予村菌屬(Nomuraeaspp.)(例如萊氏野村菌(Nomuraea rileyi))、長_殼屬(Ophiostoma spp.)(例如新榆枯萎病菌(Ophiostoma novo-ulmi) Λ Ophiostoma quercus)、副球抱子菌屬(Paracoccidioidesspp.)(例如巴西副球抱子菌(Paracoccidioides brasiliensis))、釘抱屬(Passaloraspp.)(例如 Passalora fulva)、粧燕菌屬(Paxillus spp.)(例如長絲粧燕(Paxillusfilamentosus)、卷邊粧燕(Paxillus involutus))、青黴屬(Penicillium spp.)(例如沙門桕乾酪青黴(Penicillium camemberti)、產黃青黴(Penicillium chrysogenum)、馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei) )、Phlebiopsis 屬(Phlebiopsis spp.)(例如大伏革菌(Phlebiopsis gigantea))、豆馬勃屬(Pisolithus)(例如彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius))、側耳屬(Pleurotus spp.)(例如平燕(Pleurotus ostreatus))、足抱蟲屬(Podospora spp.)(例如柄孢殼菌(Podospora anserina))、泊氏孔菌屬(Postiaspp.)(例如鮭色泊氏孔菌(Postia placenta))、核腔菌屬(Pyrenophora spp.)(例如偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis))、裂糟菌屬(Schizophyllum spp.)(例如裂糟菌(Schizophyllum commune))、籃狀菌屬(Talaromyces spp.)(例如柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus))、木黴屬(Trichoderma spp.)(例如棘抱木黴(Trichodermaasperellum)、深綠木黴(Trichoderma atroviride)、綠色木黴(Trichoderma viride)、裡氏木黴(Trichoderma reesii)[以前稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)])、口蘑屬(Tricholoma spp.)(例如掠灰口蘑(Tricholoma terreum) )、Uncinocarpus 屬 (Uncinocarpus spp.)(例如 Uncinocarpus reesii)、輪枝抱屬(Verticillium spp.)(例如大 I? 花輪枝抱(Verticillium dahliae) )、Xanthodactylon 屬(Xanthodactylonspp.)(例如 Xanthodactylon f lammeum)、石黃衣屬(Xanthoria spp.)(例如 Xanthoriacalcicola、 Xanthoria capensis、 Xanthoria ectaneoides、 Xanthoria flammea、Xanthoria karrooensisΛXanthoria ligulata、石黃衣(Xanthoria parietina)'Xanthoriaturbinata)等。在例如以下文獻中對疏水蛋白進行了綜述:Sunde，M等人，(2008) ,Micron,39:773-84 ；Linder, Μ.等人，(2005)，《歐洲微生物學會聯合會微生物學評論》(FEMSMicrobiol Rev.),29:877-96 ；以及 WdsteHi H.等人，(2001)，《微生物學年鑑》(Ann.Rev.Microbiol.55:625-46。
[0069]在一個特別有利的實施例中，疏水蛋白來自木黴屬(Trichoderma spp.)(例如棘抱木黴(Trichoderma asperellum)、深綠木黴(Trichoderma atroviride)、綠色木黴(Trichoderma viride)、裡氏木黴(Trichoderma reesii)[以前稱紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)]，有利地，裡氏木黴(Trichodermareseei)。
[0070]I類和II類疏水蛋白都已在真菌中被鑑定為分泌蛋白，這種分泌蛋白在疏水界面處自組裝成兩性膜。I類疏水蛋白的聚集體一般相對不可溶，而II類疏水蛋白的聚集體容易溶解於多種溶劑中。有利地，疏水蛋白可溶於水，所謂可溶於水是指至少0.1%可溶於水，優選至少0.5%。所謂至少0.1%可溶是指當將99.9mL水中的0.1g疏水蛋白在20°C下進行30，OOOg離心30分鐘時，沒有疏水蛋白沉澱出來。
[0071]本 申請人:已觀察到，通過其他方法產生的疏水蛋白II會導致C末端的一個或者多個胺基酸切除。從本發明的方法，特別是如果使疏水蛋白沉澱或者不可溶的話，沒有觀察到切除。
[0072]還在絲狀細菌如放線菌(Actinomycete)和鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)中鑑定了疏水蛋白樣蛋白質(例如「chaplins」)(W001/74864 ;Talbot，2003，《當代生物學》(Curr.Biol)，13:R696-R698)。與真菌疏水蛋白形成對比的是，這些細菌蛋白質僅可形成最多一個二硫鍵，因為它們可能僅具有兩個半胱氨酸殘基。這種蛋白質是疏水蛋白的功能等同物的一個例子，並且是落入本文方法的生物表面活性劑範圍內的另一類分子。
[0073]鼠李糖脂是由銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)產生和/或衍生的一類糖脂，常常被引證為細菌表面活性劑當中得到最好地表徵的細菌表面活性劑。主要有兩類鼠李糖脂即單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂；它們分別由一個或者兩個鼠李糖基團組成。鼠李糖脂已在化妝品行業中廣泛用於諸如保溼劑、牙膏、保險套潤滑劑和香波的產品，並且在有機物和重金屬汙染場所的生物修復中有效。它們還能促進銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa )對廢烴如原油和植物油的降解。
[0074]槐糖脂存在於假絲酵母屬(Candida)或者相關酵母種並由這些微生物分泌到培養基中，並且已知是表面活性劑。羥基脂肪酸的性質是特徵性的，羥基基團位於η或η-1碳原子上；碳鏈長為16、17或者18,因生長培養基的組成而變。已在Candida bogoriensis中確認了具有不飽和C18脂肪酸的槐糖苷。從球擬酵母屬(Torulopsis spp)分離了獨特的槐糖脂，其與已經提到的那些槐糖脂不同之處在於它是一種大環內酯，其中羥基脂肪酸的羧基基團被槐糖中的末端葡萄糖的4』羥基基團酯化。在該脂質中還存在兩個乙酸基團。槐糖脂因其兩親結構而表現出表面活性劑活性。在槐糖脂生產菌中，Candida bombicola是研究得最多的一個種，因為它能大量產生槐糖脂物質。已證實槐糖脂可用於硬質表面清潔和自動盤碟洗滌漂洗助劑配方。
[0075]表面活性肽是一種細菌環狀脂肽，是一種非常強效的表面活性劑，常用作抗生素。它是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(產內生孢子的革蘭氏陽性細菌)所產生的24類抗生素之一。表面活性肽的結構由七個胺基酸的肽環(L-天冬醯胺、L-亮氨酸、穀氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸和兩個D-亮氨酸)和長13-15個碳的疏水脂肪酸鏈組成，所述疏水脂肪酸鏈使其能夠穿透細胞膜。表面活性肽與其他表面活性劑一樣，能影響它被溶解於其中的液體的表面張力。它在低至20 μ M的濃度下，能將水的表面張力從72mN/m降低到27mN/m。[0076]美國專利案7，906，315 ;7，893，015 ;7，887，906 ;7，858，334 ;7，749，203 ;7，581，594 ;7，556，654 ;7，541，321 ;7，540，926 ;7，473，363 ;7，413，643 ;7，325，603 ；7，226，897 ;7，198，680 ;6，956，122 ;6，921，390 ;6，727，223 ;6，582，730 ;6，475，968 ；6，389，820 ;6，369，014 ;6，346，281 ;6，319，898 ;6，262，038 ;6，063，602 ;6，060，287 ；6，051，552 ;5，866，376 ;5，767，090 ;5，635，392 ;5，551，987 ;5，417，879 ;5，128，262 ；4，943，390 和 4，640，767 ;以及美國專利公開案 20110065167 ；20110027844 ；20100323928 ；20100168405 ；20100144643 ；20100143316 ；20100004472 ；20100000795 ；20090288825 ；20090269833 ；20090203565 ；20090170700 ；20090148881 ；20090098028 ；20080296222 ；20080293570 ；20080193730 ；20080085251 ；20080023044 ；20080023030 ；20080020947 ；20070249035 ；20070249034 ；20070215347 ；20070134288 ；20060106120 ；20050271698 ；20050266036 ；20050227338 ；20050176117 ；20050106702 ；20040251197 ；20040244969 ；20040231982 ；20040156816 ；20040152613 ；20040022775 ；20030096988 ；20030018306 ；20020176895 ；20020123077和20020120101中所描述的生物表面活性劑，也可通過本發明的方法生產；另參見《表面活性劑科學系列第48卷，生物表面活性劑，生產性質應用》(Surfactant Science SeriesVolume48, BIOSURFACTANTS, Production PropertiesApplications)，NaimKosaric 編輯，CRC Press 出版社，1993。
[0077]發酵生產生物表面活性劑是通過將宿主細胞或者微生物在生物反應器或者發酵罐內的液體發酵培養基中培養來進行。選擇培養基的組成(例如營養物、碳源等)、溫度和pH,以給培養物的生長和/或生物表面活性劑的產生提供適當的條件。通常將空氣或者富氧空氣噴射到培養基中，以給培養物的呼吸供氧。
[0078]本發明涉及向培養液添加任何造成生物表面活性劑沉澱的物質或者處理，從而使生物表面活性劑不可溶。具體地講，任何造成生物表面活性劑沉澱的物質或者處理都可被本發明的方法採用。造成生物表面活性劑沉澱的物質包括但不限於鹽、聚合物、酸、溶劑或者醇。造成生物表面活性劑沉澱的物理條件包括但不限於熱量的變化和PH的變化。技術人員會理解，造成生物表面活性劑沉澱的條件可包括沉澱劑、物理條件的改變或者這兩者的組合。
[0079]具體地講，本發明還涉及可通過本文描述的工藝生產的生物表面活性劑。例如，本文給出了通過改變發酵培養基和條件對常規的發酵技術進行改進，以使所表達的疏水蛋白在發酵仍在進行的同時在發酵液中變得不可溶，從而防止發酵過程中泡沫溢出。使用該改進的發酵法生產的疏水蛋白的組成在圖2中給出，質量7180處的峰對應於全長疏水蛋白分子。有趣的是，由本文給出的方法生產的疏水蛋白導致均勻的產品，這與通常為兩種變體的混合物的天然疏水蛋白不同。因此，本發明還涵蓋任何具有圖2中示出的圖譜的疏水蛋白。
[0080]有利地，沉澱劑是或者包括可由酸和鹼的中和反應產生的、由陽離子和陰離子構成的鹽一離子化合物，例如包含任何合適陰離子和任何合適陽離子的離子化合物，所述陰離子例如滷離子(例如氯離子、氟離子、溴離子或者碘離子)；檸檬酸根；乙酸根；硝酸根(或者硝酸鹽)、亞硝酸鹽、碳酸根；硫酸根；磷酸根；氨基磺酸根；膦酸根；或者氨基磺酸根；所述陽離子例如銨、鈣、金屬或者過渡金屬如鋁、鐵、鎂、鋰、鉀或者鈉。鹽有利地包含多原子離子，更優選包含硫酸鹽。鹽可以是或者包含硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸鉀或者硫酸鈉。在一個特別有利的實施例中，鹽是或者包含硫酸鈉。在另一個特別有利的實施例中，鹽是或者包含硫酸銨。在其他實施例中，鹽可以是乙酸鹽、碳酸鹽、氯鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、硝酸鹽或者磷酸鹽。
[0081]在另一個實施例中，沉澱劑是醇。醇可以是一元醇或者多元醇,如一元或者多元C1-C6醇，如甲醇、乙醇或者異丙醇。
[0082]在另一個實施例中，沉澱劑是水混溶性有機溶劑。溶劑可以是丙酮或者酮。
[0083]在另一個實施例中，沉澱劑是水溶性聚合物。聚合物可以是聚乙二醇或者多糖如葡聚糖。在另一個實施例中，沉澱劑是陽離子聚合物，如但不限於C581(Cytec Industries公司，美國新澤西州伍德蘭帕克(Woodland Park, NJ07424))。
[0084]在一個特別優選的實施例中，根據生物表面活性劑對培養液的pH進行調節。例如，如果生物表面活性劑為疏水蛋白，則pH有利地為約4.0 ± 0.5。pH可在以下範圍:約 3.9±0.5 至約 4.1±0.5、約 3.8±0.5 至約 4.2±0.5、約 3.7±0.5 至約 4.3±0.5、約 3.6±0.5 至約 4.4±0.5、約 3.5±0.5 至約 4.5±0.5、約 3.4±0.5 至約 4.6±0.5、約 3.3±0.5 至約 4.7±0.5、約 3.2±0.5 至約 4.8±0.5、約 3.1±0.5 至約 4.9±0.5、約 3.0±0.5 至約 5.0±0.5、約 2.9±0.5 至約 5.1±0.5、約 2.8±0.5 至約 5.2±0.5、約 2.7±0.5 至約 5.3±0.5、約 2.6±0.5 至約 5.4±0.5、約 2.5±0.5 至約 5.5±0.5、約 2.4±0.5 至約 5.6±0.5、約 2.3±0.5 至約 5.7±0.5、約 2.2±0.5 至約 5.8±0.5、約2.1±0.5 至約 5.9±0.5 或者約 1.0±0.5 至約 6.0±0.5。
[0085]如果生物表面活性劑為鼠李糖脂或者槐糖脂，則pH有利地為約2.5±0.5。pH可在以下範圍:約2.4±0.5至約2.6±0.5、約2.3±0.5至約2.7±0.5、約2.2±0.5至約 2.8±0.5、約 2.1±0.5 至約 2.9±0.5、約 2.0±0.5 至約 3.0±0.5、約 1.9±0.5 至約 3.1±0.5、約 1.8±0.5 至約 3.2±0.5、約 1.7±0.5 至約 3.3±0.5、約 1.6±0.5 至約 3.4±0.5、約 1.5±0.5 至約 3.5±0.5、約 1.4±0.5 至約 3.6±0.5、約 1.3±0.5 至約 3.7±0.5、約 1.2±0.5 至約 3.8±0.5、約 1.1±0.5 至約 3.9±0.5、約 1.0±0.5 至約 4.0±0.5、約 0.9±0.5 至約 4.1±0.5、約 0.8±0.5 至約 4.2±0.5、約 0.7±0.5 至約4.3±0.5、約 0.6±0.5 至約 4.4±0.5 或者約 0.5±0.5 至約 4.5±0.5。
[0086]在另一個實施例中，其他表面活性劑的有利pH可為約pH7.0±0.5、約ρΗ7.1±0.5、約ρΗ7.2±0.5、約ρΗ7.3±0.5、約ρΗ7.4±0.5、約ρΗ7.5±0.5、約ρΗ7.6±0.5、約 ρΗ7.7±0.5、約 ρΗ7.8±0.5、約 ρΗ7.9±0.5、約 ρΗ8.0±0.5、約 ρΗ8.1±0.5、約ρΗ8.2±0.5、約ρΗ8.3±0.5、約ρΗ8.4±0.5、約ρΗ8.5±0.5、約ρΗ8.6±0.5、約ρΗ8.7±0.5、約 ρΗ8.8±0.5、約 ρΗ8.9±0.5、約 ρΗ9.0±0.5、約 ρΗ9.1±0.5、約 ρΗ9.2±0.5、約ρΗ9.3±0.5、約ρΗ9.4±0.5、約ρΗ9.5±0.5、約ρΗ9.6±0.5、約ρΗ9.7±0.5、約ρΗ9.8±0.5、約 ρΗ9.9±0.5、約 ρΗ10.0±0.5、約 ρΗ10.1±0.5、約 ρΗ10.2±0.5、約 ρΗ10.3±0.5、約 ρΗ10.4±0.5、約 ρΗ10.5±0.5、約 ρΗ10.6±0.5、約 ρΗ10.7±0.5、約 ρΗ10.8±0.5、約 ρΗΙΟ.9±0.5、約 ρΗ11.0±0.5、約 ρΗΙΙ.1±0.5、約 ρΗ11.2±0.5、約 ρΗ11.3±0.5、約 ρΗ11.4±0.5、約 ρΗ11.5±0.5、約 ρΗ11.6±0.5、約 ρΗΙΙ.7±0.5、約 ρΗ11.8±0.5、約 pHIL 9±0.5、約 ρΗ12.0±0.5、約 ρΗ12.1±0.5、約 ρΗ12.2±0.5、約 ρΗ12.3±0.5、約 ρΗ12.4±0.5、約 ρΗ12.5±0.5、約 ρΗ12.6±0.5、約 ρΗ12.7±0.5、約 ρΗ12.8±0.5、約 ρΗ12.9±0.5、約 ρΗ13.0±0.5、約 ρΗ13.1±0.5、約 ρΗ13.2±0.5、約 ρΗ13.3±0.5、約ρΗ13.4±0.5、約 ρΗ13.5±0.5、約 ρΗ13.6±0.5、約 ρΗ13.7±0.5、約 ρΗ13.8±0.5 或者約ρΗ13.9±0.5。
[0087]如前面提到，pH的調節不需包括卡拉膠，並且卡拉膠的任何使用不需包括pH調節，尤其是PH3.5或者3以下。而且，任何將離子強度調節到0.5以下、或者0.4以下、或者
0.3以下、或者0.2以下不需包括將pH調節到3.5或者3以下和/或使用卡拉膠。導致降低pH的pH調節可通過添加酸如硫酸來實現。
[0088]沉澱劑，例如添加的鹽、醇、水混溶性有機溶劑或者水溶性聚合物或者陽離子聚合物、和/或PH調節、和/或溫度調節和/或溫度提高的加入量或者pH調節量，要實現生物表面活性劑(例如疏水蛋白如疏水蛋白11)的充分沉澱或者不溶解化，有利地以避免使用消泡劑。也就是說，不溶解化對於泡沫控制是有利的。換句話說，不溶解化是作為控制泡沫的手段來進行，而沉澱劑的量或者PH調節或者溫度調節的量要能造成一定量的不溶解化以控制發泡。而且，有利的是，沉澱劑的量或者PH調節或者溫度調節的量不會不利地影響細胞或者微生物生長和/或生物表面活性劑的產生。
[0089]疏水蛋白的低溶解度的優選pH範圍為約3.5-4.5。對於其他表面活性劑，pH範圍可能大不相同，本領域技術人員可確定優選的pH範圍。
[0090]對於疏水蛋白，在3.5-4.5之間的pH範圍內，硫酸銨或者硫酸鈉的所需濃度是溫度依賴性的。在約30°C至約60°C之間，優選的濃度為約0.1%至約5%。在約30°C或者以下，硫酸鈉的濃度有利地在5%以上，直至該鹽的飽和極限，這對於硫酸鈉而言為約15%，對於硫酸銨而言為約30-50%，根據溫度而定。
[0091]同樣，對於其他生物表面活性劑，這些沉澱劑的溫度和濃度都可能大不相同，要通過實驗對每一者進行確定。
[0092]在其他有利的實`施例中，生物表面活性劑可以是鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽。有利地，鼠李糖脂可用氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈉和/或陽離子聚合物(如但不限於C581)進行沉澱。有利地，槐糖脂可用氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈉和/或陽離子聚合物(如但不限於C581)進行沉澱。有利地，表面活性肽可用氯化鈉、氯化鈣和/或硫酸鈉進行沉澱。在另一個有利的實施例中，鼠李糖脂、槐糖脂和表面活性肽可在地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和 / 或裡氏木黴(Trichodermareseei)中擴增。
[0093]疏水蛋白的無鹽、濃縮溶液(達80g/L或者以上)可單獨通過極高的溫度進行沉澱以控制發泡。例如，80°C的溫度有效地破壞了在加熱到該溫度的過程中形成的任何泡沫，其中在該溫度下PH在約6-7之間。
[0094]疏水蛋白可用異丙醇在室溫下進行沉澱。兩到三體積的異丙醇當加到一體積的疏水蛋白水溶液時將使疏水蛋白沉澱。
[0095]在另一個實施例中，物理條件是溫度。
[0096]在一個特別優選的實施例中，對培養液的溫度進行調節。根據生物表面活性劑和濃度而定，在這裡溫度範圍可很大，可在約20°C至約90°C的範圍內。對於疏水蛋白，溫度在30°C以上。對於鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽，溫度可為約20°C至約30°C。
[0097]有幾種方式測試泡沫控制的有效性。最容易的方式是檢查表面泡沫，看是否有總體積顯著減少的跡象。夾帶的空氣可用具有能記錄液體密度隨時間的變化的密度計的類似設備進行測試。[0098]在一個有利的實施例中，泡沫控制的有效性可通過受試溶液的膨脹度進行測量，膨脹度是一種計算值，涉及發泡溶液的體積減去起始體積再除以起始體積，以分數或者百分數報告。膨脹度為零意味著溶液不含泡沫。
[0099]也可採用泡沫減少指數作為用於控制泡沫的處理的有效性的度量。它是未處理的溶液與經處理的溶液的膨脹度之比。
[0100]在另一個實施例中，泡沫減少的有效性也可以是測量生物表面活性劑的絕對和相對不溶性。如果生物表面活性劑至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或者95%不可溶，則可認定泡沫減少有效。
[0101]如果少於0.lg/kg、0.5g/kg、lg/kg、2g/kg、3g/kg、4g/kg、5g/kg、6g/kg、7g/kg、8g/kg、9g/kg或者10g/kg的生物表面活性劑(以g測量)存在於溶液(以kg測量)中，則可認定泡沫減少有效。
[0102]在一個有利的實施例中，如果生物表面活性劑至少約25%不可溶和/或如果不超過lg/kg的生物表面活性劑存在於上清液中，則可認定泡沫減少有效。
[0103]在一個有利的實施例中，如果生物表面活性劑是蛋白質，可通過測量沉澱物(不溶性)和上清液(可溶性)中該蛋白質的量來定量該蛋白質的不溶性。可通過定量沉澱物(不溶性)和上清液(可溶性)中的該蛋白質，來確定絕對和相對不溶性。定量蛋白質的方法是本領域技術人員知道的。
[0104]定量沉澱物中的和溶液中的非蛋白質生物表面活性劑的方法是本領域技術人員公知的。
[0105]多重光散射耦合垂直掃描是最廣泛使用的監測產品的分散狀態、從而鑑定和定量去穩定化現象的技術[Roland 等人，《國際藥物雜誌》(International Journalof Pharmaceutics), 263 (2003) 85-94 ；Lemarchand 等人，《藥物研究》(PharmaceuticalResearch)，20-8 (2003) 1284-1292 ；Mengual等人，《膠體與表面A:物理化學和工程方面》(Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects),152 (1999) 111 - 123 ；Bru等人，《顆粒尺寸測定與表徵》(Particle sizing andcharacterisation), T.Provder和J.Texter編輯，(2004)]。它對任何沒有稀釋的濃縮分散體適用，包括泡沫在內。當使光線穿過樣品時，光線被氣泡反向散射。反向散射強度與分散相的尺寸和體積分數成正比。因此，濃度的局部改變(排水、脫水收縮)和尺寸的全局改變(熟化、凝聚)被檢測出和監測到。也可用電導率來監測生長培養基成分的濃度以及監測濁度。
[0106]來自本發明的一個特別優點是，生產生物表面活性劑的工藝可以是連續的。例如，在本發明的實施中，生物反應器或者發酵罐可具有用於移除溶解的生物表面活性劑(例如疏水蛋白)的裝置，例如閥門控制的流體管道，由該流體管道可從生物反應器或者發酵罐移除溶解的生物表面活性劑。閥門可與用於打開和關閉閥門的處理器或者微處理器相連而被操作。處理器或者微處理器可從傳感器接收信號，如指示生物表面活性劑在溶液中的濃度或其變化或者溶液的濁度或者別的參數(如泡沫的量)的傳感器，並且基於該傳感器信號，處理器或者微處理器可指示閥門的打開或者關閉以移除溶解的生物表面活性劑；或者處理器或者微處理器可基於其他參數促使閥門打開或者關閉，所述其他參數例如添加或者施加沉澱劑和/或沉澱條件的開始時間，沉澱劑濃度的達到和/或沉澱條件的達到，包括在一段時間內。生物反應器或者發酵罐還可包括用於添加沉澱劑或者流體或者其他條件以達到沉澱條件的裝置，所述裝置例如是閥門控制的流體管道，通過該流體管道可添加沉澱劑，例如鹽(有利地在溶液中)、醇、或者能實現沉澱條件的流體(例如用於降低pH的酸)，或者所述裝置是加熱器。閥門或者加熱器可與用於打開和關閉閥門或者加熱器的處理器或者微處理器相連。處理器或者微處理器可從傳感器接收信號，如指示生物表面活性劑在溶液中的濃度或其變化或者別的參數(如泡沫)的傳感器，並且基於該傳感器信號，處理器或者微處理器可指示閥門或者加熱器的打開或者關閉以添加沉澱劑或者流體或者其他造成溶解(solubilization)的手段；或者處理器或者微處理器可基於其他參數促使閥門打開或者關閉，所述其他參數例如移除溶解的生物表面活性劑的開始時間。此外，生物反應器或者發酵罐可包括用於添加生產生物表面活性劑的培養基和/或細胞或者微生物或者培養基的其他成分的裝置。在移除溶解的生物表面活性劑時不可避免的是，一些生產生物表面活性劑的培養基和/或細胞或者微生物或者培養基的其他成分將隨該溶解的表面活性劑一起失去，因此生物反應器或者發酵罐包括補充裝置。這個補充裝置可例如是閥門控制的流體連接裝置，細胞或者生物體或者培養基或者培養基的其他成分從這個流體連接裝置被輸送到生物反應器或者發酵罐。閥門可與用於打開和關閉閥門的處理器或者微處理器連接。處理器或者微處理器可從傳感器接收信號，如指示細胞或者微生物或者培養基的其他成分的濃度或其變化或者溶液的濁度或者別的參數的傳感器，並且基於該傳感器信號，處理器或者微處理器可指示閥門的打開或者關閉以進行補充；或者處理器或者微處理器可基於其他參數(如時間)促使閥門打開或者關閉。當細胞、微生物或者培養基或者培養基的成分隨溶解的表面活性劑一起收穫時，可將該細胞、微生物或者培養基或者培養基的成分與該溶解的生物表面活性劑分離，並例如通過補充裝置循環回到發酵罐或者生物反應器。前面所述的傳感器可以是生物反應器或者發酵罐中的或者與生物反應器或者發酵罐連接的一個或者多個傳感器。
[0107]這樣， 將用於生產和能生產生物表面活性劑(例如疏水蛋白如疏水蛋白I1、鼠李糖月旨、槐糖脂或者表面活性肽)的培養基輸送到生物反應器或者發酵罐，隨著發泡發生或者正在發生或者在它顯著發生之前或者在培養基在生物反應器或者發酵罐中一段時間後，添加或者施加沉澱劑或者沉澱條件，例如添加硫酸鈉和/或添加醇和/或施加熱量和/或調節PH (有利地向下調節)，由此泡沫得到控制，生物表面活性劑發生沉澱或者不溶解化。將不溶解化的生物表面活性劑從生物反應器或者發酵罐移除。並將培養基或其成分例如細胞或者微生物、營養物、或者培養基的其他成分輸送到生物反應器或者發酵罐中，即培養基或其成分例如細胞或者微生物、營養物、或者培養基的其他成分得到補充。任選地，將隨不溶解化的生物表面活性劑一起分離的培養基或其成分例如細胞或者微生物、營養物、或者培養基的其他成分循環回到生物反應器或者發酵罐。這樣可以連續生產生物表面活性劑。
[0108]該方法可在反應器例如生物反應器中進行。本文所用的「生物反應器」指任何製造的或者設計的能夠支撐生物活性環境的裝置或者系統。例如，生物反應器可包括其中進行一個或者多個化學和/或生物過程的容器。在一些實施例中，這些過程涉及生物體或者衍生自這種生物體的生化活性物質。在一些實施例中，生物體或者細胞可在生物反應器中生長。在一些實施例中，生物體可在使用過程中懸浮或者固定在反應器中。
[0109]隨這個方法使用的反應器可包括但不限於批式反應器、補料分批反應器、連續反應器如連續攪拌的罐式反應器、移動培養基、填充床、纖維床、膜反應器或者本領域已知的或者有待發現的任何其他系統。
[0110]在一些實施例中，連續反應器的使用可以將物料連續泵送經過反應器。所泵送的物料的流動可以促進混合。在一些實施例中，可在反應器中使用靜態混合器如擋板和/或機械攪拌，以促進各組分的混合。
[0111]在一些實施例中，該方法可用生物反應器進行。細胞和培養基可通過輸入部件提供到生物反應器，輸入部件包括但不限於埠、輸送管、管道、軟管和/或本領域知道的任何其他輸入裝置。可使用多個輸入部件來將細胞、培養基和/或營養物提供到反應器。
[0112]可利用包括一個或者多個傳感器以及一個或者多個控制器的控制系統來控制反應器內的條件。控制器可包括但不限於處理器、微處理器或者本領域知道的其他控制器。用來控制反應器條件的信息可從一個或者多個傳感器和/或從使用者提供到控制器。
[0113]傳感器可用來測量反應器內的條件，包括但不限於溫度、pH、組成、泡沫的存在、泡沫的量、壓力、沉澱物的存在、沉澱物的量和/或本領域知道的任何其他相關測量項目。多個傳感器可設置在反應器周圍，以測定特定位置的條件。例如，在一些實施例中可將用來測定沉澱物的量或者存在的傳感器設置為接近反應器的底部。各實施例可包括接近輸入部件開口、罐內各種位置和/或任何目的位置的，用於測定泡沫的存在的傳感器。可使用本領域知道的任何傳感器。
[0114]一些實施例可包括罐中的窗口或者開口以便觀察。一些反應器可包括設置在反應器中的燈以便觀察反應器內的條件。操作者可以能夠觀察罐中的條件並將數據輸入到與一個或者多個控制器連接的用戶界面中，以調節罐內的條件。
[0115]例如，基於來自傳感器和/或使用者輸入部件的數據，可根據反應器中的需要打開或者關閉閥門。在一些實施例中，輸入部件上的閥門可控制營養物、緩衝劑、培養基、生物體和/或其他組分的添加。
[0116]一些實施例可包括讓細胞在反應器的內室中生長。可將營養物、培養基和細胞以足以優化目的生物體的生長的比例加入到反應器。在一些實施例中，控制所添加的物料的組成以優化目的組分的生產。例如，目的組分可以是蛋白質或者化合物。
[0117]在一些實施例中，隨著目的組分的濃度提高，發泡可能開始出現。可利用窗口和/或傳感器來檢測反應器中的發泡。例如，可使用傳感器或者窗口來確定是否出現發泡。一旦檢測到發泡，控制器可指示添加沉澱劑到反應器。在一些實施例中，沉澱劑可讓目的組分從溶液中沉澱出來。沉澱的組分可積累在反應器的底部。
[0118]一些實施例可包括一個或者多個設置為接近反應器底部的傳感器，以測定是否存在沉澱物和/或存在的沉澱物的量。這些傳感器可與一個或者多個控制器通訊。控制器可使用這個輸入來確定打開接近反應器底部的閥門，從而沉澱物排出反應器。
[0119]在一些實施例中，可利用輸入部件和輸出部件上的泵來促進物料在輸入部件和輸出部件中的移動。
[0120]如圖3中所示，一些實施例可包括利用反應器100進行該方法。細胞、培養基和/或營養物可通過輸入部件102提供到反應器100。如圖3中所示，輸入部件102可包括用來控制生物體和/或培養基向容器的遞送的閥門104。在一些實施例中，可利用多個輸入部件來將生物體和/或培養基遞送到反應器的不同位置。在一些實施例中，如圖3中所示，細胞和培養基通過輸入部件102提供。多個傳感器106可設置在反應器100的各個位置。傳感器106給控制器108，110提供數據。控制器108，110能夠控制細胞、培養基、營養物、沉澱劑和/或其他組分的量。在一些實施例中，控制器可作出調整以控制反應器、輸入部件和/或輸出部件中的條件。
[0121]一些實施例可包括讓細胞在反應器的內室中生長。隨著目的組分的濃度提高，發泡可能開始出現。在一些實施例中，可利用窗口和/或傳感器來檢測反應器中的發泡。一旦檢測到發泡，可向反應器添加沉澱劑。在一些實施例中，沉澱劑可讓目的組分從溶液中沉澱出來。沉澱的組分可用傳感器106檢測。在一些實施例中，反應器100中存在窗口 116以讓使用者觀察反應器中的條件。
[0122]控制器108連接到出口閥門112。控制器110可指示閥門112打開以讓沉澱物通過輸出部件114離開罐。在一些實施例中，使用者的輸入可讓控制器指示閥門112按需打開和/或關閉。
[0123]如圖3中所示，可使用輸入部件118向反應器提供營養物，包括但不限於空氣、氧氣或者本領域知道的任何其他營養物。輸入部件118可連接到遞送裝置120以將營養物提供到反應器100。在一些實施例中，遞送裝置可設置在反應器中的任何位置。一些實施例包括混合器122以促進反應器中各組分的混合。
[0124]雖然已詳細描述的本發明及其優點，但應理解，可在不偏離所附權利要求書中所限定的本發明精神和範圍的前提下，在這裡作出各種變化、替換和變更。
[0125]以下實例將進一步說明本發明，這些實例僅為說明的目的給出，並不旨在以任何方式限制本發明。
[0126]SM
[0127]實例1:澄清的未純化的疏水蛋白溶液
[0128]這裡給出一種採用硫酸鈉和pH調節來減少澄清的疏水蛋白溶液中的泡沫形成的方法。疏水蛋白溶液採用常規的生產方法獲得。疏水蛋白溶液的濃度為33g/kg。硫酸鈉處理是通過加入無水硫酸鈉至達到2.5%w/w的最終濃度，伴以輕輕混合讓其溶解來實現。使用1%硫酸將pH調節至4.0。將溶液在10°C下混合16小時。將2X5mL的經Na2S04處理的濃縮物離心以除去液體部分。將每個沉澱物在水中重懸至與初始疏水蛋白濃縮物相同的體積。使用抹刀使沉澱物鬆開並重懸。製備2X5mL的未經處理的疏水蛋白濃縮物。將濃縮物之一和Na2SO4處理的濃縮物之一進行振動混合。
[0129]立即和在4小時後，拍照片並記錄每個管子的總體積。結果在表1中給出。經硫酸鈉處理的溶液的可溶性疏水蛋白濃度為lg/L。在加入硫酸鈉後，97%的疏水蛋白不可溶。
[0130]表1
[0131]
I初始體積混合後體積保持膨帳度保持 I
(iiiL)(mL)(%)
處理O小時後 4小時後 O小時後 4小時後
^51414180% 130%"""
經硫酸鈉處理I 56.56.5 30% 30% |
泡沫減少指數ω6.0[0132]實例2:純化的疏水蛋白溶液
[0133]這裡給出一種使用熱量來減少疏水蛋白溶液的泡沫形成的方法。疏水蛋白溶液的濃度為130g/kg。當在500mL Pyrex中混合320g的疏水蛋白溶液時，泡沫充滿瓶子的頂部空間(圖1左邊的照片)。當將另一個經類似混合的疏水蛋白溶液加熱到80°C時，沉澱物形成，泡沫崩潰(圖1右邊的照片)。結果在表2中給出。
[0134]轟^
【權利要求】
1.一種控制生物表面活性劑的發泡的方法，所述生物表面活性劑在以下情況下發泡:在發酵培養基中通過宿主細胞生產所述生物表面活性劑期間，當所述宿主細胞胞外分泌所述生物表面活性劑並且所述生物表面活性劑可溶於所述發酵培養基時；所述方法包括在通過所述宿主細胞生產所述生物表面活性劑的同時使所述生物表面活性劑不溶解化，由此發泡受到控制，因為所述不溶解化的生物表面活性劑不會發泡。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物表面活性劑包含疏水蛋白I1、鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽。
3.根據權利要求1所述的方法，其中泡沫減少指數大於I，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3 ;和/或所述發酵培養基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進行；和/或與不加以不溶解化而進行的方法相比，所述方法用減低量的消泡劑來進行；和/或所述方法通過加入沉澱劑和/或施加沉澱條件來進行。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法是一種連續工藝，包括:向生物反應器輸入發酵培養基，加入沉澱劑或者施加沉澱條件，收集不溶解化的生物表面活性劑，並補充發酵培養基或其成分或者宿主細胞；任選地，將與不溶解化的生物表面活性劑一起被收集的任何發酵培養基或其成分或者宿主細胞進行再循環。
5.—種控制生物表面活性劑的發泡的方法,所述生物表面活性劑在以下情況下發泡:在發酵培養基中通過宿主細胞生產所述生物表面活性劑期間，當所述宿主細胞胞外分泌所述生物表面活性劑並且所述生物表面活性劑可溶於所述發酵培養基時；所述方法包括在通過所述宿主細胞生產所述生物表面活性劑的同時使所述生物表面活性劑不溶解化，由此發泡受到控制，因為所述不溶解化的生物表面活性劑不會發泡，其中泡沫減少指數大於1，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3 ;和/或所述發酵培養基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進行；和/或與不對所述生物表面活性劑加以不溶解化而進行的方`法相比，所述方法用減低量的消泡劑來進行；和/或所述方法通過加入沉澱劑和/或施加沉澱條件來進行。
6.一種控制在生產過程中發泡的生物表面活性劑在溶液中的發泡的方法，所述方法包括: 在所述生物表面活性劑的生產過程中，在條件能引起泡沫形成的時候，與此同時將所述生物表面活性劑進行不溶解化，由此發泡受到控制，因為所述不溶解化的生物表面活性劑不會發泡。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述溶液包含發酵培養基，其中所述生產包括在所述發酵培養基中通過宿主細胞表達所述生物表面活性劑，並且其中所述宿主細胞胞外分泌所述生物表面活性劑且所述生物表面活性劑可溶於所述發酵培養基，由此,條件能引起泡沫形成。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述方法是一種連續工藝，包括: 向生物反應器輸入發酵培養基； 加入沉澱劑或者施加沉澱條件； 收集不溶解化的生物表面活性劑；以及補充溶液或其成分或者宿主細胞；任選地，將與不溶解化的生物表面活性劑一起被收集的任何溶液或其成分或者宿主細胞進行再循環。
9.一種控制在生產過程中發泡的生物表面活性劑的發泡的方法，所述方法包括: 在通過宿主細胞在溶液中生產所述生物表面活性劑的同時，使所述生物表面活性劑不溶解化， 控制發泡，使得: 泡沫減少指數大於1，和/或泡沫減少指數大於2，和/或泡沫減少指數大於3 ;和/或 所述溶液中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或 至少25%的所生產的生物表面活性劑被不溶解化；和/或 所述方法在不添加消泡劑的情況下進行；和/或 與不加以不溶解化而進行的方法相比，所述方法用減低量的消泡劑來進行。
10.根據權利要求1、5、6或者9中任一項所述的方法，其中所述生物表面活性劑包含疏水蛋白I1、鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽。
11.根據權利要求1、5、6或者9中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是裡氏木黴。
12.根據權利要求1、5、6或者9中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌。
13.根據權利要求1、5、6或者9中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是地衣芽孢桿菌。
14.根據權利要求1、5、6或者9中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是麴黴屬的種。
【文檔編號】C12N1/20GK103492552SQ201280016434
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年3月29日 優先權日:2011年3月29日
【發明者】M·H·恆, M·波多 申請人:丹尼斯科美國公司