用於製備血管生成素的方法

2023-09-19 14:52:00 1

專利名稱：用於製備血管生成素的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於從乳製品中製備富含血管生成素的級分的方 法，以及涉及這類級分用作食品添加劑、營養製品或者用於製備治療 用組合物的用途。
背景技術：
血管生成素是一種由幾類生長型細胞生產的14kDa、非糖基化的 多肽，所述細胞包括血管內皮細胞、主動脈平滑肌細胞、成纖維細胞 以及一些腫瘤例如結腸癌、卵巢癌和乳癌。已經從許多來源中分離出 了血管生成素，包括正常人血漿、牛血漿、牛乳，以及小鼠血清、兔
血清和豬血清o
血管生成素與胰核糖核酸酶同源並且具有不同的核糖核酸酶活
性。該蛋白質能夠誘導新的血管生長；然而，尚未確認血管生成素的 核糖核酸酶活性在該蛋白所誘導的血管發生中所起的作用。
正常人血漿中血管生成素的濃度為60-120 ng/ml。然而，該蛋白 的濃度在患有各種癌症的患者體內會有所升高，並且已知抑制血管生 成素可防止人腫瘤生長。
除作為血管發生的有效刺激劑之外，血管生成素已經被證明具有 許多其他活性。這些包括下列能力移除皮膚缺陷例如色斑、調節免 疫應答、保護多形核白細胞免於自發降解和抗全身性細菌和真菌病原 體的殺微生物活性。基於已知的血管生成素的生理功能，可以預測該 蛋白在藥品、膳食食品添加劑和化妝品中的各種應用。
然而，血管生成素在這類應用中的使用需要一種用於從適合來源 以商業規模製備該蛋白的有效方法。本發明的一個優選實施方案的目 標為提供這類方法。該方法還可能被包括在一種用於純化其他乳製品 組分(例如乳鐵蛋白、乳酸過氧化物酶或生長因子)的現有的方法中 作為其一部分。本說明書中所引用的所有參考文獻——包括任何專利或專利申 請——均通過引用的方式納入本文。應該清楚地理解，儘管本文引用
了許多現有技術出版物，但是這種引用並非承認任何這些文獻在澳大 利亞或在任何其他國家中構成本領域中的公知常識。

發明內容
第一方面中，本發明提供了一種用於從乳製品中製備富含血管生
成素的級分的方法，其中所述方法包括
(a) 使所述乳製品與陽離子交換樹脂接觸；
(b) 用流動相將所述富含血管生成素的級分從所述陽離子交換 樹脂上洗脫下來；和
(c) 收集所述洗脫的富含血管生成素的級分，其中在步驟(a)之前 所述乳製品沒有進行過陽離子交換色謙法處理。
所述乳製品可包括全乳、脫脂乳、酪乳、乳清或初乳。與所述陽 離子交換樹脂接觸的乳製品的量優選地為約16個柱體積(CV)至約 600 CV，更優選約16CV至約150CV，並且最優選約68 CV。
在所述第一方面的一個實施方案中，優選在步驟(b)之前將不含血 管生成素的乳酸過氧化物酶級分從所述柱上洗脫下來。優選地，所述 不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分是使用含有0.34 M氯化鈉 (2.0% w/v)或具有等價離子強度的流動相洗脫的，並且所述流動相 的pH為6.5。
在所述第一方面的另一個實施方案中，優選在洗脫所述富含血管 生成素的級分之前，將所述陽離子交換樹脂用低離子強度的緩衝液 (<0.34 M的鹽或其等價物)或水衝洗以移除所述柱中剩餘的乳製品。
在所述第一方面的另一個實施方案中，洗脫所述富含血管生成素 的級分的流動相優選地含有0.38-1.5 M氯化鈉(2.25-8.7% w/v )或具 有等價離子強度，更優選含有0.38-0.59 M氯化鈉(2.25-3.5% w/v )或 具有等價離子強度，並且最優選含有0.43 M氯化鈉(2.5%w/v)或具 有等價離子強度。
在另一個優選的實施方案中，洗脫所述富含血管生成素的級分的 流動相pH範圍在4.0-9.0之間，優選5.5-7.5,並且最優選6.5。
所述陽離子交換樹脂可包括瓊脂糖微球。優選地，所述瓊脂糖微球的大小範圍為45-900 jim,並且更優選90-300 nm。
在一個實施方案中，在所述第一方面的方法的步驟(a)的過程中， 所述陽離子交換樹脂以約6-卯升/升樹脂/小時、優選以約6-50升/升樹 脂/小時並且最優選以約33升/升樹脂/小時的流速處理。
本發明第一方面所述的方法可以為連續法或分批法。優選地，所 述方法為連續法。
在一個實施方案中，所述富含血管生成素的級分的血管生成素含 量為至少2。/。w/w,優選至少10。/。w/w，更優選至少20。/ow/w。
在另一個實施方案中，對所述富含血管生成素的級分進行進一步 處理以減少存在於所述組合物中的非血管生成素蛋白和/或鹽的量。
在本發明的第二方面中，提供了一種根據本發明第一方面所述的 方法製備的富含血管生成素的級分。
在本發明的第三方面中，提供了本發明第二方面所述的富含血管 生成素的級分在製備食品或營養製品中的用途。在一個優選的實施方 案中，所述食品為運動營養品或嬰兒食品添加劑。
在本發明的第四方面中，提供了一種包括本發明第二方面所述的 富含血管生成素的級分的食品或營養製品。
在本發明的第五方面中，提供了一種包括本發明第二方面所述的 富含血管生成素的級分和可藥用載體的藥物組合物。
在本發明的第六方面中，提供了本發明第二方面所述的富含血管 生成素的級分在製備用於治療或預防疾病的藥劑中的用途，所述疾病 為由病毒、細菌或真菌以及它們的毒素所引起的疾病或者其中需要刺 激血管發生的疾病。
在本發明的第七方面中，提供了本發明第二方面所述的富含血管 生成素的級分作為營養製品的成分的用途，所述營養製品可以耙向會 導致人黏膜表面感染的病原體。在一個優選的實施方案中，所述黏膜 表面可以鼻、眼、耳、肺、乳房和陰道的那些黏膜表面。
在本發明的第八方面中，提供了一種靶向會導致人黏膜表面感染 的病原體的方法，包括下列步驟將有效量的本發明第四方面所述的 營養製品或本發明第五方面所述的組合物給予受試者。
在本發明的第九方面中，提供了一種治療由病毒、細菌或真菌以 及它們的毒素所引起的疾病的方法，包括下列步驟將有效量的本發明第四方面所述的營養製品或本發明第五方面所述的組合物給予受試 者。


圖1為對一種利用本發明的方法製備的洗脫的富含血管生成素的
級分進行的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。
圖2示出了對所述富含血管生成素的級分(圖1)的SDS-PAGE 分離物進行的凝膠光密度計分析的結果。
具體實施例方式
本發明已經認識到需要一種使得可以以有效方式製備富含血管生 成素的級分的方法。因此，本發明的第一方面提供了這樣一種方法， 即其中使一種乳製品與陽離子交換柱接觸，並且使用 一種流動相將富 含血管生成素的級分從其上洗脫下來。
使用術語"富含血管生成素"來指所述洗脫級分中存在的所述血管 生成素蛋白與總蛋白的比例與進行陽離子交換色譜前所述乳製品中存 在的該比例相比有所增加。對於被認為富含血管生成素的級分而言， 其血管生成素含量應該為至少2% w/w,優選至少10% w/w，並且更 優選至少20% w/w。
本文所用的術語"級分，，是指所述乳製品的一個部分純化的部分。
使用術語"有效的"來指與目前用來富集蛋白(包括血管生成素) 的方法相比 一種價廉且快速的方法。
適合的乳製品可能會包括全乳、脫脂乳、酪乳、乳清(例如酸或 乳酪/凝乳乳清)或乳清衍生物(例如乳清蛋白濃縮物或乳清蛋白分離 流出物)，以及初乳。在進行本發明的方法之前所述乳製品沒有進行過 陽離子交換色i普法處理。
對本領域技術人員來說顯而易見的是，所述乳製品可以獲自任何 泌乳動物，例如反芻動物如奶牛、綿羊、水牛、山羊和鹿，非反芻動 物包括靈長類(如人)和單胃動物(如豬)。優選地，在本發明的方法 中使用源自牛全乳的脫脂乳。
本發明第一方面所述的方法僅使用 一種陽離子交換樹脂或柱。可 以使用各種類型陽離子交換樹脂基質，並且這些在本領域中是已知的。這些包括例如任何基於交聯的多糖例如交聯的瓊脂糖(Sepharose)或葡聚糖(Sephadex)的支持物；任何基於纖維素例如纖維和微球(Sephacel， Gibco HB )、顆粒(Gibco HG )或苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(Dowex resin )的支持物；或者任何基於聚丙烯醯胺例如羥基化甲基丙烯酸聚合物(TosohHW)的支持物。
適合的樹脂官能團也是本領域技術人員已知的並且包括磺丙基(SP)、羧曱基(CM)、正磷酸鹽/正磷酸例如Whatman Pll、磺酸曱酯(S)，羧酸和磺酸(50W)。
優選地，所選樹脂的最小微球直徑為45 jun,最大直徑為卯0 jim。
最佳地，微球直徑在卯fim至300 nm之間。
在一個優選的實施方案中，微球直徑範圍為45-165 jirn和100-300Hm的SP瓊脂糖陽離子交換樹脂微球均適用於血管生成素吸附和純化。
所述樹脂通常被填充在10 cm深的柱中；然而，根據所需獲得的血管生成素的量，所述柱的深度可在4 cm至200 cm之間變動。所迷柱的直徑還會根據用途不同而有所變化。通常，直徑範圍在0.9cm至200 cm，並且最佳直徑為62 cm。可以使用任何適合的材料(包括不鏽鋼、塑料或玻璃)來構建所述容納樹脂的柱。
在所述接觸步驟中，乳製品被吸附到陽離子交換柱上時的流速會根據所述方法的規模和所使用乳製品的類型而變化。流速的下限由工業類型用途的成本效益決定，因為在非常低的流速下進行所述方法的成本超出了收益。
在一個優選的實施方案中，所述乳製品為脫脂乳，並且以6-卯升/升樹脂/小時(h )的速度(線性流速60-卯0 cm/h )將所述乳製品上樣到所述柱上。優選地，所使用的流速範圍為6-50升/升樹脂/小時(線性流速60-500 cm/h)，並且更優選34升/升樹脂/小時(線性流速331cm/h )。高流速適用於與樹脂接觸的乳製品總量受限時的血管生成素純化。使用上文所述的流速時，已經發現對於血管生成素的最佳分級分離，例如與陽離子交換樹脂接觸的脫脂乳的量約為16-600個柱(床)體積，優選16-150個柱體積，並且更優選68個柱體積。
儘管如澳大利亞專利613688中所述，乳製品體積遠遠超出樹脂體積的情況適用於製備其他乳製品例如乳酸過氧化物酶和乳鐵蛋白，但是本發明的發明人已經發現數量級為1000個柱體積的乳製品體積:樹脂體積(乳製品升數/升樹脂)並不適用於利用本發明方法進行的血管生成素製備。發明人已經發現超過約600個柱體積的乳製品體積:樹脂體積會使得幾乎沒有血管生成素與所述樹脂結合，並且回收的血管生成素與原料相比沒有富集。因此，在脫脂乳的情況下，本發明優選的上限為約600個柱體積，優選約150個柱體積，並且最優選約68個柱體積。隨著乳製品:樹脂比例的增加，結合的血管生成素的量以及洗脫的血管生成素的純度逐漸下降。至於流速，下限由商業因素而非柱相關因素確定。如果所上樣的乳製品的體積遠少於16個柱體積，則達到了一個臨界點，即此時衝洗和洗脫時間超過了可以純化出足夠量的血管生成素以使得該方法在經濟上可行的臨界點。
在使乳製品與陽離子交換樹脂接觸以使得血管生成素得以吸附的過程中，所述來源的pH優選地為約6.5,但是調整pH對於本發明的方法來說不是必需的。
在洗脫吸附到柱上的血管生成素的過程中，使用了一種由離子強度為0.38-1.5 M的緩衝溶液組成的流動相。所述流動相中4吏用的鹽的類型不限並且是本領域中技術人員已知的。例如可以使用任何可溶性無毒緩衝液，例如氯化物、檸檬酸、磷酸、乙酸、硫酸、重碳酸、氫氧化物、咪唑或馬來酸的任何可溶性鈉鹽、鉀鹽、鈞鹽、鎂鹽或鋰鹽。還可以4吏用合成的兩性離子緩衝液，例如Trizma、 HEPES或tricine當離子強度升高到高於0.6 M時血管生成素的純度下降，因為此時非-血管生成素蛋白開始洗脫，其他蛋白藉此稀釋了血管生成素。在一個優選的實施方案中，所述流動相由離子強度為0.38-1.5 M(2.25-8.7% w/v )的氯化鈉組成，並且更優選地由離子強度為0.38-0.59M(2.25-3.5% w/v)的氯化鈉組成。最優選地，4吏用等價於或4氐於0.43M氯化鈉(2.5%)的離子強度。
所述流動相的pH範圍可較寬，例如4.0-9.0,優選5.5-7.5，並且最優選約6.5。在上限和下限時，蛋白穩定性以及蛋白結合陽離子交換樹脂的能力均會受到影響。範圍在5.5-7.5之間的pH在沒有降低產量的情況下提供了最高的血管生成素純度。
所述流動相的體積和流速也是可變的。例如，可以使用由l-20升緩衝溶液/升樹脂組成的流動相。優選的範圍為1-10升，並且更優選地使用2.5升緩沖溶液/升樹脂。優選地，所述流動相的流速為6-90升/升樹脂/小時(60-卯0 cm/h )。更優選地，所述流速為6-40( 60-400 cm/h )，並且最優選地，最佳線性流速為7.5升/升樹脂/小時(75cm/h)。
本發明第一方面所述的方法可以單獨用於製備富含血管生成素的級分，或者該方法可以被納入作為全面(integrated)分級分離方法中的一部分，在所述全面分級分離方法其他所需的乳製品組分被分級分離。例如，在從陽離子交換柱上洗脫所述富含血管生成素的級分之前，可以從所述柱上洗脫不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分。用於洗脫所述乳酸過氧化物酶級分的緩衝液類型以及該緩衝液流速和體積通常與上文所述的用於洗脫所述血管生成素級分的那些相同。然而，該緩衝液的離子強度不同。例如，該緩衝液可以由離子強度為0.26-0.43 M(1.5-2.5% w/v)的氯化鈉組成，更優選地由離子強度為0.3-0.38 M(1.75-2.25% w/v)的氯化鈉組成，並且最優選地，乳酸過氧化物酶洗脫緩衝液的離子強度等價於0.341\1氯化鈉(2.0%)。
此外， 一旦已經洗脫了所述乳酸過氧化物酶和血管生成素級分，則可以從所述柱上洗脫乳鐵蛋白級分。同樣，用於洗脫所述乳鐵蛋白級分的緩衝液類型以及該緩衝液流速和體積也通常與上文所述的用於洗脫所述乳酸過氧化物酶和血管生成素級分的那些相同。然而，該緩衝液的離子強度不同。例如，該緩衝液可以由離子強度為0.59-3.0 M(3.5-17.4% w/v)的氯化鈉組成，更優選地由離子強度為0.68-2.0 M(4.0-11.7% w/v)的氯化鈉組成，並且最優選地，乳4失蛋白洗脫緩衝液的離子強度等價於1.5M氯化鈉(8.75%)。
在本發明第一方面的另一個實施方案中，在所述用乳製品上樣到陽離子交換柱上的步驟後，可以通過用低離子強度緩衝液或用水衝洗所述陽離子交換柱來移除柱中的任何未結合蛋白。如果使用緩衝液，則該緩衝液的離子強度通常低於0.34M,並且優選地低於0.05 M。適合的緩沖液、它們的pH和體積與上文所述的用於洗脫所述乳酸過氧化物酶、血管生成素和乳鐵蛋白級分的那些相同。然而，所述衝洗緩衝液流速優選地為15升/升樹脂/小時(147cm/h)。
可以對利用本發明的方法製備的富含血管生成素的級分進行進一步處理以移除非血管生成素蛋白和/或移除鹽。人們認為對於標準化的食品或營養製品的生產以及對於治療劑的製備來說，這很重要。這些步驟可以下列方法來實現膜過濾、理想地超濾，或本領域中已知的等價方法，例如透析、電透析、分子篩色諳、固相萃取、納米過濾或其他已知方法。保留富含血管生成素的滲餘物，並且棄去滲透物。
如果選擇超濾，則膜大小範圍優選地為0.15-10 kDaNMWCO,並且最優選5 kDa NMWCO。
由於血管生成素參與許多生理功能，因此使用本發明方法製備該蛋白提供了一種該蛋白的理想且經濟的來源，所述蛋白隨後可以針對這些功能使用。例如，所述純化的蛋白可以用於製備食品或營養製品。常見的食品包括運動營養品粉劑或嬰兒食品添加劑，所述運動營養品粉劑在食用後可提高運動成績。
本文所用的術語"營養製品，，是指分離或純化自食品(在本文的情況下為乳製品)的可食用產品，它被證明在口服時具有生理學益處或者可以預防或減輕急性或慢性疾病或損傷。因此，所述營養製品可以為單獨的或者與可使用食品或飲品混合的膳食製品或添加劑形式。所述營養製品可以對心血管疾病、克隆氏病或涉及無法自愈性(non-healing)創傷例如潰瘍的病症有積極的臨床效果。
所述營養製品組合物可以為可溶性粉劑、液體或即々欠製劑形式。或者，所述營養製品組合物可以為固體形式，例如即食棒或早餐穀物形式。還可以存在各種香料、纖維、增甜劑或其他添加劑。
所述營養製品優選地具有可接受的感官特性(例如可接受的氣味、味道和口感)，並且還可以包括選自維生素A、 Bl、 B2、 B3、 B5、 B6、Bll、 B12、生物素、C、 D、 E、 H和K以及4丐、鎂、鉀、鋅和鐵中的至少一種的維生素和/或礦物質。
可以通過經鼻胃管、空腸管或者通過使受試者飲用或食用所述組合物來將其給予所述受試者。
所述營養製品組合物可以按照常規方法製備；例如，可以通過將所述蛋白與其他添加劑混合在一起來製備所述組合物。如果使用的話，所述混合物中可以包括乳化劑。此時可以加入額外的維生素和礦物質，但是通常稍後加入以避免熱降解。
如果需要生產粉狀營養製劑組合物，則可以將粉狀形式的所述蛋白與額外組分混合。所述粉劑含溼量應該低於約5重量％。然後可以混入水——優選已經進4亍過反滲透處理的水——以形成液體混合物。如果所述營養製品組合物是以即食液體形式提供的，則可以將其加熱以降少細菌載量。如果需要生產液體的營養製品組合物，則優選地將所述液體混合物無菌地填充到適合的容器中。可以使用本領域中的常規技術進行所述容器的無菌填充。具有適合用於進行無菌填充性質的裝置可通過購買獲得。
利用本發明的方法製備的富含血管生成素的級分還可以被配製為適合用於給予受試者的藥物組合物。
優選地，所述組合物還包括一種或多種可藥用載體、稀釋劑或賦
形劑。這類組合物可以包括緩衝液例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖；甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸例如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑例如EDTA;佐劑和防腐劑。本發明的組合物可以被配製用於靜脈內給藥、局部給藥或口服給藥。
可以以一種適用於所要治療和/或預防的疾病的方式將這類組合物給予受試者。給藥量和給藥頻率將由下述因素決定，所述因素如受試者的身體狀況以及受試者疾病的類型和/或嚴重程度。還可以通過臨床試驗來確定適合的劑量。有效量的組合物可以由醫師在考慮到受試者在年齡、體重、疾病嚴重程度、身體狀況方面的個體差異、給藥途徑以及任何與受試者治療相關的其他因素的情況下確定。"有效量，，的所述組合物實質上是足以達到所需治療效果的量。
在另一個方面中，本發明提供了用於治療和/或預防疾病的方法。這類治療方法包括給予受試者有效量的上文所述的營養製品或藥物組合物。優選地，這類疾病包括那些由病毒、細菌或真菌以及它們的毒素所引起的疾病。然而，由於血管生成素在血管發生中起作用，因此還可以使用本發明的含有血管生成素的組合物來治療需要刺激血管發生的疾病。這些疾病包括冠心病、中風、缺血性肢體病和創傷癒合延遲。
本說明書通篇中，除非上下文中另外要求，否則術語"包括"或其同義詞如"包含"或"含有"均應被理解為是指包括所述要素或整數或者要素群或整數群，但不排除任何其他的要素或整數或者要素群或整數群。
還必須注意到，除非上下文中另外明確指出，否則本說明書中使用的單數形式"a ( — ) "、 "an (—個)"和"the (該)"包括複數方面。對本領域技術人員來說顯而易見的是，雖然為了清楚性和便於理
解，本發明已經進行了相當詳細地描述，但是在不偏離本說明書中所
公開的發明概念的範圍的情況下，可以對本文所述的實施方案和方法
進行各種變化和改變。
現在參照下述實施例對本發明進行進一步詳述。除非另外說明，
否則提供這些實施例的目的僅在於舉例說明，而並非意在進行限制。
因此，本發明包括由於本文所提供的教導而變得顯而易見的任何及所
有變化。
實施例1:用於從脫脂乳製備富含血管生成素的級分的方法
用SP Sepharose Big Beads (GE Healthcare)填充10 cm深的柱4吏得
該柱的總床體積為29.7升。以331 cm/h的線性流速(34升脫脂乳/升
樹脂/小時)將脫脂牛奶流上樣到該柱上，持續2小時直至所上樣的脫
脂乳體積為填充到該柱中的樹脂體積的68倍。
通過以147 cm/h的線性流速(15升緩衝液/升樹脂/小時)即0.25
CV/分鐘在10分鐘期間加入2.5個柱體積(CV)的水來移除該柱中剩
餘的乳。
通過用2.5 CV的含等價於2.00/。 (0.34 M) NaCl的鈉離子且pH為6.5的緩衝液，以75 cm/h的線性流速(7.5昇陽離子緩衝液/升樹脂/小時)即0.125 CV/分鐘在20分鐘期間將不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分從所述柱上洗脫下來。將起始的0.5昇陽離子緩沖溶液/升樹脂排入到排液裝置，並且收集接下來的2.5昇陽離子緩沖溶液/升樹脂作為不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分(包括與下一緩沖液施加時間重疊的時間即透過時間裡的0.5昇陽離子緩衝溶液/升樹脂)。
然後通過用2.5 CV的含等價於2.5% w/v ( 0.43 M ) NaCl的鈉離子且pH為6.5的緩衝液，以75 cm/h的線性流速(7.5昇陽離子緩衝液/升樹脂/小時)即0.125 CV/分鐘在20分鐘期間將富含血管生成素的級分從所述柱上洗脫下來。將起始的0.5昇陽離子緩衝溶液/升樹脂排入排液裝置，並且收集接下來的2.5昇陽離子緩衝溶液/升樹脂作為富含血管生成素的級分(包括與下一緩沖液的施加時間重疊的時間裡的0.5昇陽離子緩衝溶液/升樹脂)。最後，通過用2.5 CV的含等價於8.75% w/v ( 1.5 M ) NaCl的鈉離子且pH為6.5的緩沖液，以75 cm/h的線性流速(7.5昇陽離子緩衝液/升樹脂/小時)即0.125 CV/分鐘在20分鐘期間將乳鐵蛋白級分從所述柱上洗脫下來。將起始的0.5昇陽離子緩沖溶液/升樹脂排入排液裝置，並且收集接下來的2.5昇陽離子緩衝溶液/升樹脂作為乳鐵蛋白級分。
將所收集的富含血管生成素的級分超濾(NMWCO 5 kDa)以濃縮並降低鹽含量。將所得的濃縮物冷凍乾燥並且在室溫下貯藏備用。
利用SDS-PAGE分析所述富含血管生成素的級分的血管生成素含量(圖1)，發現所述級分含有57。/。(蛋白水平)的低分子量(14kDa)蛋白(圖2)，利用MALDI-TOF/TOFMS確認該蛋白為血管生成素(結果未示出)。
對本領域技術人員來說顯而易見的是，這種血管生成素製備方法可基於商業目的擴大規模。
權利要求
1.一種用於從乳製品中製備富含血管生成素的級分的方法，其中所述方法包括(a)使所述乳製品與陽離子交換樹脂接觸；(b)用流動相將所述富含血管生成素的級分從所述陽離子交換樹脂上洗脫下來；和(c)收集所述洗脫的富含血管生成素的級分，其中在步驟(a)之前所述乳製品沒有進行過陽離子交換色譜法處理。
2. 權利要求1所述的方法，其中所述乳製品選自全乳、脫脂乳或酪乳。
3. 權利要求1或2所述的方法，其中與所述陽離子交換樹脂接觸的乳 製品的量為約16個柱體積至約600個柱體積。
4. 權利要求1或2所述的方法，其中與所述陽離子交換樹脂接觸的乳 製品的量為約16個柱體積至約150個柱體積。
5. 權利要求1或2所述的方法，其中與所述陽離子交換樹脂接觸的乳 製品的量為約68個柱體積。
6. 權利要求l-5任一項所述方法，其中在步驟(b)之前將不含血管生成 素的乳酸過氧化物酶級分從所述柱上洗脫下來。
7. 權利要求6所述的方法，其中洗脫所述不含血管生成素的乳酸過氧 化物酶級分的流動相含有0.34 M氯化鈉(2.0% w/v)或具有等價 離子強度，並且所述流動相的pH為6.5。
8. 權利要求l-7任一項所述的方法，其中在洗脫所述富含血管生成素 的級分之前，將所述陽離子交換樹脂用低離子強度的緩衝液(<0，34 M的鹽或其等價物)或水衝洗以移除所述柱中剩餘的乳製品。
9. 權利要求l-8任一項所述的方法，其中洗脫所述富含血管生成素的 級分的流動相含有0.38-1.5 M氯化鈉(2.25-8.7% w/v )或具有等價 離子強度。
10. 權利要求l-9任一項所述的方法，其中洗脫所述富含血管生成素的 級分的流動相含有0.38-0.59 M氯化鈉(2.25-3.5% w/v )或具有等 價離子強度。
11. 權利要求1-10任一項所述的方法，其中洗脫所述富含血管生成素 的級分的流動相含有0.43 M氯化鈉(2.5% w/v)或具有等價離子 強度。
12. 權利要求1-11任一項所述的方法，其中洗脫所述富含血管生成素 的級分的流動相pH範圍在4.0-9.0之間。
13. 權利要求1-12任一項所述的方法，其中洗脫所述富含血管生成素 的級分的流動相pH範圍在5.5-7.5之間。
14. 權利要求1-13任一項所述的方法，其中洗脫所述富含血管生成素 的級分的流動相pH為6.5。
15. 權利要求1-14任一項所述的方法，其中所述陽離子交換樹脂包括 瓊脂糖微球。
16. 權利要求15所述的方法，其中所述瓊脂糖微球的大小範圍為 45-900 nm。
17. 權利要求15或16所述的方法，其中所述瓊脂糖微球的大小範圍為 90-300 nm。
18. 權利要求1-17任一項所述的方法，其中在步驟(a)中，所述陽離子 交換樹脂以約6-卯升/升樹脂/小時的流速處理。
19. 權利要求18所述的方法，其中所述接觸流速範圍為約6-50升/升樹 脂/小時。
20. 權利要求18或19所述的方法，其中所述接觸流速為約33升/升樹 脂/小時。
21. 權利要求1-20任一項所述的方法，其中所述方法為連續法或分批 法。
22. 權利要求1-21任一項所述的方法，其中所述富含血管生成素的級 分的血管生成素含量為至少2%w/w。
23. 權利要求1-22任一項所述的方法，其中對所述富含血管生成素的 級分進行進一步處理以減少存在於所述組合物中的非血管生成素 蛋白和/或鹽的量。
24. —種利用權利要求1-23任一項所述的方法製備的富含血管生成素 的級分。
25. 權利要求24所述的富含血管生成素的級分在製備食品或營養製品 中的用途。
26. 權利要求25所述的用途，其中所述食品為運動營養品或嬰兒食品 添加劑。
27. —種包括權利要求24所述的富含血管生成素的級分的食品或營養製品。
28. —種包括權利要求24所述的富含血管生成素的級分和可藥用載體 的藥物組合物。
29. 權利要求24所述的富含血管生成素的級分在製備用於治療或預防 疾病的藥劑中的用途，所述疾病為由病毒、細菌或真菌以及它們的 毒素所引起的疾病或者其中需要刺激血管發生的疾病。
30. 權利要求24所述的富含血管生成素的級分作為營養製品的成分的 用途，所述營養製品可以靶向會導致人黏膜表面感染的病原體。
31. —種靶向會導致人黏膜表面感染的病原體的方法，包括下列步驟 將有效量的權利要求27所述的營養製品或權利要求28所述的組合 物給予受試者。
32. —種治療由病毒、細菌或真菌以及它們的毒素所引起的疾病或者其 中需要刺激血管發生的疾病的方法，包括下列步驟將有效量的權 利要求27所述的營養製品或權利要求28所述的組合物給予受試 者。
33. 權利要求30所述的用途或權利要求31所述的方法，其中所述黏膜 表面選自鼻、眼、耳、肺、乳房和陰道。
全文摘要
本發明提供了一種用於從乳製品中製備富含血管生成素的級分的方法，所述方法包括使所述乳製品與陽離子交換樹脂接觸並且用流動相將所述富含血管生成素的級分從陽離子交換樹脂上洗脫下來。本發明還提供了利用所述方法生產的富含血管生成素的級分，以及包括這類血管生成素的食品、營養製品和藥物。
文檔編號A23C9/146GK101626693SQ200780041515
公開日2010年1月13日 申請日期2007年11月9日 優先權日2006年11月10日
發明者A·布朗, A·泰斯特, B·庫克斯, M·羅尼, M·麥克多諾, P·霍布曼 申請人:墨累古爾本合作有限公司;維多利亞農業服務控股公司