凝血酶突變體的製作方法

2023-09-19 18:13:05 4

專利名稱：凝血酶突變體的製作方法
凝血酶(止血中一種關鍵酶)根據其底物特異性不同，具有促凝血和抗凝血兩種特性。它由肝臟以一種無活性的酶原，即凝血酶原形式分泌出來，凝血酶原在凝血因子Va和Xa的作用下形成成熟的α-凝血酶。在體外用諸如Echis carinatus(龍狀蝰蛇)蛇毒等幾種蛇毒來酶解凝血酶原就可模擬上述過程。
凝血酶通過酶解纖維蛋白原，最終導致形成一種不可溶的纖維蛋白凝塊而起促凝劑作用。它會激活凝血因子V和VIII變成FVa和FVIIIa，酶解XI因子形成活化的XIa因子(導致進一步激活IX因子和X因子並延長凝血作用)，酶解血小板凝血酶受體導致血小板激活。另一方面，當凝血酶與血栓調節素(TM)(血管內皮細胞上的一種組成型膜蛋白)結合時，它會發生構型變化以致失去促凝血活性，取而代之是獲得了能把稱為C蛋白(PC)的血漿蛋白轉變為活性C蛋白(aPC)的能力。aPC是一種絲氨酸蛋白酶，它通過滅活在凝血一連串反應中起重要作用的兩個因子FV(FVa)和FVIII(FVIIIa)而起抗凝劑作用。aPC還能滅活血漿蛋白酶原活化抑制因子1(PAI-1)，它是組織血漿蛋白酶原活化因子(tPA)的主要生理抑制因子，即能加強正常纖維蛋白溶解作用。這一機制能保證血液凝集局限在傷口處。完全缺乏PC的嬰兒基本上難以存活，由於稱為新生兒暴發性紫癜的血栓形成疾病；某些部分缺乏PC的病人會復發血栓形成。此外，許多現行的輸注aPC的動物模型顯示，外源性aPC是一種抗血栓形成和抗炎症的分子。
人凝血酶是由一個大約有579個成熟胺基酸(有潛在的等位基因變異或N-末端的微小異質性)和一個約43殘基的前導序列(De-gen等，「Bio-chemistry」222087〔1993〕)的前體多肽即凝血酶原產生出來的。這前導序列在細胞表達和分泌凝血酶原過程中被蛋白水解而去掉。凝血酶原是一種酶原或無活性的蛋白酶，它通過蛋白水解而活化。至少有3個基本酶解位點。在體內，凝血酶原可被Xa因子在有Va因子、磷脂和鈣離子存在下，在殘基R271和T272(殘基編號按Degen等人的方法)之間酶解生成前凝血酶2和片段1.2。凝血酶原還可被同一系統在R320和I321之間酶解，生成凝血酶meizothrombin，它再在R155和S156之間自我酶解成片段1(1-155)和meizothrombin des1(一種二硫鍵連接的從156殘基延伸到凝血酶原羧基端的二肽，在R323處酶解)。最後，前凝血酶2在R320和I321之間酶解，或由meizothrombin des1在R271和T272之間酶解生成凝血酶。然後凝血酶自身在T284和T285之間酶解，得到成熟的A-鏈N-末端。本發明中，把凝血酶A鏈的成熟N-末端殘基(Degen系統中為T285)稱為「T1a」，然後連續編號到R36a位的精氨酸殘基。B鏈是從它的N-末端殘基I1數起(Degen系統為I321)直到E259。這兩條凝血酶多肽通過C9a和C119之間的一個二硫鍵共價連接在一起。
對於凝血酶，除了用Degen等人基於DNA的系統外，還使用了兩種不同的編碼方法。一種是基於與胰凝乳蛋白酶原的線性排列(Bode等「EMBOJ」83467(1989)。第二種是華盛頓大學的Sadle和同事推薦的方法。本專利說明書中使用的就是Sadle的編碼方法。按這種方法，凝血酶的B鏈從I1開始，延伸到E259為止，而A鏈正象上述那樣，注個「a」字，即從T1a到R36a。這種凝血酶被稱為「參考序列凝血酶」它的全部序列顯示在

圖1中，如Wu等人[PNAS USA 886775(1991)]公布的幾種根據Sadle方法所編碼的凝血酶突變體。Wu等人的突變體和相應的胰凝乳蛋白酶原編碼及Degen殘基編碼分別依次表示如下H43(57，363)、K52(605，372)、N53(60g，373)、R62(67，382)、R68(73，388)、R70(75、390)、D99(102、419)和S205(195，525)。
眾所周知，凝血酶對纖維蛋白原和蛋白C活化作用的結合位點是重疊的，但不是一致的。這是基於少數凝血酶突變體得來的(Wu等，op cit)。Wu等人報導過有凝血酶序列但在52位有穀氨酸取代的(K52E)一種多肽在產生活化的PC上活性大約要比野生型凝血酶高出2.5倍，並只有野生型凝血酶的正常纖維蛋白原凝集活性的17％。相反，也報導過有凝血酶序列但在70位有穀氨酸取代(R70E)的一種多肽有野生型凝血酶的纖維蛋白原的凝集活性，但只有大約7％的野生型凝血酶的PC活化能力。根據Wu等人，R68E蛋白基本上喪失了這兩種功能。
其他與凝血酶有序列同源性的多肽見Le Bonniec et al.，「JBC」268(25)19055(1993)；Le Bonniec et al.，「JBC」266(21)13796(1991)；Le Bonniec et al.，「PNAS USA」887371(1991)；Sheehan etal.，「JBC」268(5)3639(1993)；Horrevoet et al.，「JBC」268(2)779(1993)；Suzuki etal.，「JBC」266(28)18498(1991)；Sheehan et al.，「Thrombosis and Haemostasis」69Abstract 1784(1993)；Gan et al.，「Thrombosis and Haemostasis」69Abstract1783(1993)；Gan et al.，「Thrombosis and Haemostasis」69Abstract 1787(1993)，and Naray-Szabo et al.，「Theochem」59401(1989)。
凝血酶在凝血中的關鍵作用使這種蛋白成為研製治療血栓形成藥劑時的一個靶子。絕大部分嘗試都集中在直接抑制凝血酶的蛋白水解活性上，事實上，許多凝血酶促凝血活性的抑制劑都有抗凝作用(Hirsh，1991；Hirsh，1991a)。但是，這些抑制劑的作用能力可能會受伴隨的對凝血酶抗凝活性的抑制所限制。相反，抗凝作用可通過增加或刺激凝血酶的抗凝途徑而實現，如通過服用可溶性TM(Go-mi等，「Blood」751396-1399，1990和Light，D；WO93/15755)或活化的PC(「aPC」)(Dreyfus等，1991，Gruber等，1990，Gruber等，1991，Taylor等1987)。這種方法不能封閉由先前激活的凝血酶所引起的正在發生的凝血作用。
研製一些提高了理化和生物學活性的新型多肽是本發明一個目的。
本發明還有一個目的是研製一種新型多肽，其凝血酶的促凝血和抗凝血活性基本上是分開的，並且還選擇性地抵抗肝素介導的抗凝血酶III(AT-III)抑制作用。
還有一個目的是獲得能在重組細胞培養中高效表達的多肽。
本發明還有一個目的是提供對蛋白C活性或纖維蛋白原有底物特異性但基本不酶解正常情況下不是凝血酶底物之底物的新型多肽。
本發明的另一個目的是提供在篩選凝血酶的促凝血或抗凝血活性的激動劑或拮抗物質時有用的新型共價修飾的多肽。
另一個目的是提供能活化蛋白C但基本上不能或降低了對任何一種或幾種纖維蛋白原、凝血酶血小板受體和/或XIII、V、XI或VIII因子的蛋白酶解活性的新型多肽。
還有另外一個目的就是獲得新型的在從細胞培養或天然來源純化如TM或aPC一類的與凝血酶作用的多肽時有用的多肽。
另外一個目的是要鑑定能保留凝血酶至少一定程度的所希望的蛋白酶解活性的新型多肽，這包括凝血酶對所希望底物的Kcat和Km。
在另一個目的中，新提供的新型多肽要表現出與野生型凝血酶相比增強的PAI-1滅活活性。
另一個目的是提供在凝血機制異常的病人中鑑定血栓調節素功能缺陷的方法。
對其他的目的，提供的新型多肽可用於治療血栓形成，特別是與敗血病休克有關的血栓形成，用於實質性腫瘤的治療，用於改進創傷敷料的製備以及依賴於凝血酶特性的治療和診斷方面的應用。
另一目的是鑑定凝血酶的新型同系物，它們提高或降低了刺激細胞增殖的能力(Ben-Sharit等，「PNAS USA」83976-980 1986)。
本發明這些目的和其他目的在將本專利說明書作為一個整體考慮將是明顯的。
本發明涉及一些新型多肽(以下簡稱「NP」)，其中凝血酶特性是分離的，即這些多肽不具有凝血酶一個或幾個不希望的特性，但仍保留一個或幾個凝血酶所希望的特性。此外，本發明還涉及在凝血酶靶位殘基有突變的那些NP。
凝血酶的已知胺基酸序列變體不包括在本發明NP之內，特別是凝血酶R70E，凝血酶R68E，凝血酶K154A，凝血酶K252E，凝血酶K174E，凝血酶R180E，凝血酶D99A，凝血酶D99N，凝血酶E202Q，凝血酶E25K，凝血酶R245E，凝血酶S205A，凝血酶R197E，凝血酶D199E，凝血酶N151D，凝血酶K154E，凝血酶de-sP48，P49，W50，凝血酶desE146，T147，W148，凝血酶desT147-S158，WO93/13208中的凝血酶其中在凝血酶活化位點內至少有一個胺基酸殘基突變了和其中F19-E25環被來自組織凝血酶原激活因子的相應環所取代。但是，凝血酶K52E的排除僅以現有技術能生產為限。活化位點變異的凝血酶的排除僅限於W093/13208中所定義和公開的活化位點。已知的凝血酶與非凝血酶多肽或前凝血酶原或凝血酶原多肽的融合物也被排除在本發明的新型多肽之外。然而，那些已知凝血酶中有額外胺基酸取代、插入或缺失的凝血酶未被排除在本發明的NP之外。
天然存生的凝血酶也排除在本發明的新型多肽之外，不管它是來自人的還是動物的(包括天然產生的等位基因突變)，它沒有從血液或其他機體組織中分離或純化出來，即為天然產物。但應理解本發明的NP包括除在本發明中考慮的突變外還有那些不同於參考序列凝血酶的等位基因突變。
在本發明一些具體實施方案中，我們提供新的具有蛋白水解活性的、蛋白C活性與纖維蛋白原凝結之比不同於野生型凝血酶的多肽。具體講，我們提供兩大類新型多肽。第一類叫做蛋白C激活因子或「PCA」，我們提供的多肽其抗凝活性與促凝活性之比大於2。PCA多肽能激活蛋白C但基本上不能酶解纖維蛋白原。令人驚異的是，我們在動物中的實驗研究證實PCA中促凝活性殘餘水平都有較好的耐變性，不會導致播散性血管內凝血或其他臨床不良促凝反應。而且，我們意外地能夠鑑定這樣的PCA，它們缺乏在我們的試驗中可測到的任何促凝活性，但仍有蛋白C活化能力。因此，本發明的一個具體實施方案包括給予需要抗凝治療的受者治療有效劑量的PCA。
作為上述實施方案的延伸，製備並服用一種PCA，此PCA的抗凝活性基本上對抗預定的凝血酶抑制劑如肝素和AT-III等的抑制作用。在一個實施方案中，體內把PCA與肝素結合起來給藥。肝素抑制了內源性凝血酶的促凝血活性而不影響PCA的抗凝血活性，從而導致提高了抗凝血作用。本發明這一實施方案的另一優點在於預計服用的PCA會對體內清除AT-III—肝素有抗性，從而延長生物半衰期。
在另外一些實施方案中，提供的PCA降低了對血小板凝血酶受體的蛋白水解活性，因此在治療劑量下不激活血小板。提供的PCA其刺激血小板凝集的EC50都大於10nM，常規大於20nM。以能激活蛋白C的劑量使用PCA時，EC50比野生型凝血酶大的PCA會降低或消除可測到的血小板凝集。
本發明第二類新型多肽叫「纖維蛋白原凝集蛋白」或「FCP」。這些多肽抗凝活性與促凝活性之比小於0.5。這些NP在凝血酶PC激活結構域中有突變，降低突變後的多肽抗凝活性使其不足野生型凝血酶的一半，但仍保留凝聚纖維蛋白原的能力。這些多肽如在診斷、製備方法和手術止血中是有用的。本發明另一實施方案包括給需要促凝治療的受治者以治療有效劑量的FCP。
若在現有文獻中出現FCA或PCA的公開達到可實施程度，這種已知多肽可用於上述的本發明治療方法中。
在一個實施方案中，我們提供了PCA多肽，其中鄰近一個或多個凝血酶殘基W50、K52、D58、K65、H66、Y71、N74、K106、K107、S176、T177、W227、D193、K196、E202、E229、R233、D232、D234、K236、Y237或F239已取代或缺失一個凝血酶多肽的胺基酸殘基，或插入一個殘基。
在另一實施方案中，我們提供了FCP多肽，其中鄰近一個或多個凝血酶殘基K21、Q24、R70、R98或K77已取代或缺失一個凝血酶多肽的胺基酸殘基，或插入一個殘基。
本發明另一個實施方案有助於對各種自發性血栓形成疾病進行特異性診斷。這一實施方案是一種方法，包括用診斷有效劑量的PCA與受檢者血液和血管組織接觸，然後測定受檢者血液的止血參數而確定受檢者aPC途經是否有缺陷。
圖1(SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2)描繪的是編碼參考序列凝血酶(也稱為野生型凝血酶)DNA的核苷酸序列，它的互補序列以及參考序列凝血酶的推定胺基酸序列。
圖2A和2B是比較重組野生型人凝血酶(2A)和K52A PCA(2B)在兔子中的活性。這一研究顯示與人野生型凝血酶相比，新型多肽對循環纖維蛋白原沒有造成明顯降低，但它能誘發抗凝作用，如用活化PTT試驗所測定的結果。
圖3顯示K52A PCA在體內有明顯長的半衰期，服用後使抗凝作用活性持續達約150分鐘。
圖4是比較兩個劑量的本發明新型多肽(PCA-2，E229A PCA)在食蟹猴中的抗凝活性。
圖5是比較本發明兩種PCA(K52A和E229A)在食蟹猴中的抗凝活性。
圖6證實本發明的兩種NP(K52A和E229A)持續的血栓調節素依賴關係。
圖7表示本發明的兩種NP的血小板激活效力與野生型凝血酶相比大大降低。
本發明的新型多肽其胺基酸序列與參考凝血酶序列至少有80％的同源性(常規至少90％，優選至少95％)，但它們具有參考序列凝血酶所不具有的某些質或量的顯著特性，正如本發明在別處所描述過的那樣。
「同源性」定義為把兩個序列線性排列，必要時留出空隙使同源性百分比達到最大後，與參考序列凝血酶中的殘基一致的候選胺基酸序列中的殘基百分比。線性排列的方法和其電腦程式是本領域中熟知的。對於決定一個候選序列是否符合這一定義而可以使用或採用的一個電腦程式是Genentech，Inc，提出的「Align2」，它已於1991年12月10日以用戶文件(user documentation)在美國版權局(Washington.DC 20559)登記。
在計算胺基酸序列同源性時，把侯選胺基酸和參考序列以能產生線性對準殘基數最大的方法線性排列出來，在線性排列的序列中以缺口表示殘基的插入和缺失。例如一個含100個殘基的參考凝血酶序列片段，在它的N—末端融合上20個異源性殘基(細菌信號序列)，但在凝血酶片段序列中只有1個殘基取代的120個殘基的多肽，計算得出其與參考序列凝血酶的同源性為99％，因為這一片段的序列除有1個殘基取代和N-末端融合的20個殘基外，其餘同排成線性的參考凝血酶序列都精確的一致。即假如候選的和參考序列作最大線性排列比較時表現出有1個或幾個胺基酸殘基插入(或缺失)，那麼這些殘基在作同源性計算時可被忽略。
在另一實例中，本文所用「E202A NP」意味著這樣指稱的多肽包括在凝血酶B鏈(包括以下任何一條B鏈)202位上的丙氨酸取代成熟人凝血酶B鏈(無A鏈)、合有A、B鏈的人凝血酶原、與人B鏈凝血酶融合的細菌多肽或含有202位點的人B鏈凝血酶片段，只要每個這樣的衍生物保留激活蛋白C或酶切纖維蛋白原而產生血凝塊的能力或經加工後能這樣就行。也包括凝血酶A或B鏈片段，特別是B鏈的，同樣要求多肽作為一個整體至少能激活蛋白C或酶切纖維蛋白原產生血凝塊。凝血酶片段大小有約10、20、30、50、100或更多個殘基。一般來說，在凝血酶序列中有一個以上殘基取代的NP也將包括插入的凝血酶序列。
同源性分析都是基於從用於表達NP的核酸序列推衍出來的任何一個或幾個序列、作為體外第一個產生的產品的序列或任何經翻譯後修飾的序列。因此，假如參考的和侯選的序列表達時是一致的，而後來谷胺醯胺殘基被脫氨成為穀氨酸，則第一個候選序列是100％同源的，但脫氨的序列不是。
本發明把「促凝活性」定義為由實例2.3中纖維蛋白原凝集試驗所測定的活性，用NP濃度和相應的野生型凝血酶濃度標準化進行校正。
本發明把「抗凝活性」定義為由實施例2.4中蛋白C活化試驗所測定的活性，用NP濃度和相應的野生型凝血酶濃度標準化進行校正。
用任何適宜的試驗都能測出NP和凝血酶的濃度。下文表1a報告了結果，其中NP和凝血酶蛋白濃度都是由醯氨分解活性推斷出來的。然而，用一種免疫試驗法也可滿足該目的。例如，可以用固定化的PPAK去捕獲NP和凝血酶，並用標記的抗凝血酶抗體檢測結合上去的蛋白。假如NP或凝血酶基本上是均勻的話，那麼就可用諸如已知的Lowry法等大量蛋白測定法來確定試驗樣品中的NP或凝血酶的濃度。
「相應」野生型凝血酶是指一種蛋白，它基本是按製備分析物NP相同方法製備的，並與NP有相同的序列，只是在NP中出現的突變又恢復到參考序列凝血酶中所出現的殘基。
在一些實施方案中，新型多肽具有(a)至少一個能與針對參考序列凝血酶抗體起交叉反應的免疫表位，(b)同參考序列凝血酶A、B鏈有同源性的被一個二硫鍵連在一起的兩條鏈；(c)凝血酶活性位點殘基S205、H43和D99；(d)對纖維蛋白原或蛋白C的Kcat依情況而定，為參考序列的至少20％，優選至少75％，最優選大於或等於參考序列的Kcat，(e)對纖維蛋白原或蛋白C的Km為參考序列Km的(依情況)最多約為150％，優選最多約為100％，最好最多約為50％，優選至少約為75％，(f)與參考序列凝血酶相比，用S-2238水解作用所測定的蛋白水解活性大於約50％，優選大於約75％，最優選大於約90％，和/或(g)其底物特異性其基本上不寬於參考序列凝血酶，例如，它可以在體內酶解不同於天然凝血酶底物的人類蛋白，其裂解速率為參考序列的至多150％，優選至多120％。
本發明中典型的PCA具有(a)促凝活性等於或小於參考序列凝血酶的百分之50、25、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1，(b)當與參考序列凝血酶比較時，其抗凝活性與促凝活性之比大於2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25或50，(c)抗凝活性與參考序列凝血酶的抗凝活性相等或大於它的百分之5、10、15、25、50、75或100。
本發明中典型的FCP具有(a)抗凝活性等於或小於參考序列凝血酶的百分之50，25、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，(b)當與參考序列凝血酶比較時，其抗凝活性與促凝活性之比小於約0.5、0.25、0.15、0.10、0.09、0.08，(c)促凝活性等於或大於參考序列凝血酶的促凝活性的約百分之5、10、15、25、50、75或100。
本發明新型多肽包括在鄰近下表1或1b中所示任何參考序列胺基酸殘基位點處取代、缺失或插入任何胺基酸殘基。表1描述的是其中凝血酶殘基用丙氨酸取代的研究結果。取代的NP是那些在參考序列中至少有一個胺基酸被去掉而在相同位置上插入一個不同的胺基酸。這種取代可以是單一的，在多肽分子中只有一個胺基酸被取代，它們也可以是多位點的，即在凝血酶2個或多個位點上有2個或多個胺基酸被取代。表1從左至右豎行分別描述我們採用的編碼編號、取代的殘基、兩行S-2238水解的數據(凝血酶水解活性的測量和取代帶來構型破壞的標記)、纖維蛋白原凝集活性(促凝活性的測量)、蛋白C激活作用(抗凝活性的測量)、蛋白C激活作用與纖維蛋白原凝集活性之比。以及依賴肝素的AT-III抑制作用(在有肝素存在下，NP耐受AT-III滅活作用的能力的測量)。在我們的系統中NP Mt3和Mt37c的表達沒能測到。
表1
表1中最重要的參數是PA/FC比值。這個比值與1.0差別越大，則在突變體中促凝活性和PC激活特性分離越大。算術值最大的那些特別有利於PC激活，而最小的那些有利於促凝功能。但是，在表1列出的位點有丙氨酸以外任何一種胺基酸殘基取代也都在本發明的範圍之內，如在下面公開的20種天然的胺基酸殘基之一。對於最適宜的抗凝治療應用，儘管考慮PA/FC比值，NP的PC激活能力至少應是參考序列凝血酶的5％，常規是10～30％，以便能保證這種酶將有足夠的活性以在生理和診斷上起作用。此外，PCA絕對的纖維蛋白凝集活性理想地應小於參考序列凝血酶的10％，一般要小於5％，常規小於3％，優選小於野生型的1％，以助於保證臨床安全性。不必使NP保留與參考序列凝血酶有相同水平的PC激活活性，因為較低的活性在治療中很容易通過服用更多的這種酶加以克服。對這一方面，E229和R233 PCA特別令人注目。
除了在表1中顯示的丙氨酸取代外，其他胺基酸取代參考序列凝血酶也在本發明的範圍之內。通常，插入的殘基都是天然的胺基酸，常見的有G、A、Y、V、L、I、S、T、D、E、Q、C、M、N、F、P、W、K、R或H(用慣用的單字符，EP323149)。適宜插入的殘基還包括羥脯氨酸，β-羥基天冬氨酸，γ-羥基穀氨酸，羥基賴氨酸或正亮氨酸，作為同名物的替代物使用。
這些取代可能是保守的，其取代的殘基具有被取代殘基類似的結構或功能。其他的取代將是較少保守的，具有不同結構或功能的殘基之間產生交換。對於本發明，這些殘基類別包括1.正電性R、K、H；2.負電性P、E；3.脂肪族的V、L、I、M；4.芳香族的F、Y、W；5.小的A、S、T、G、P、C；6.帶電的R、K、D、E、H；7.極性的S、T、Q、N、Y、H、W；8.小而親水的C、S、T。跨類的取代通常對蛋白功能的影響比保守性(類內)的取代要大。因此，本發明的範圍還特別包括把保守性取代引入表1或1b的位點中去，假如結果不理想，則把非保守的取代引入到這比位點上。然而，典型的脯氨酸、甘氨酸和半胱氨酸取代或插入到上述序列中是不優選的。
本發明的一個目的是獲得對人無免疫原性或很小免疫原性的NP。就這方面，取代或插入K或R殘基到本序列中是不優選的。
優選的取代位點是其中丙氨酸取代導致PA/FC比值大於2.0或小於0.5的表1中位點(W50，K52、D58、K65、H66、Y71、N74、E202、E229、R233、D234、K21、Q24、K70、R98和K77)。選出其中4個位點發生飽和突變(E229、R233、W50、K52)。此外，將不同的雙重和三重突變引進到位點W50、K52、R233、E229、E202、K106、K107、D193和K196中。按表1突變體的同樣方式製備並在重組細胞培養中表達這些NP，然後檢測其表達水平、醯胺分解活性、aPC和纖維蛋白原凝集活性。結果顯示在表1a中(「INF」＝接近無窮大，空白表示NP直到目前還未鑑定)。
表1a
表1a(續)
表1a中的數據按表1提供的方法得到，活性(蛋白C激活作用和纖維蛋白原凝集作用)都用醯胺分解活性標準化，除表1a中NP特異性酸胺分解活性低於相應的野生型凝血酶的活性25％時例外，對於PC激活作用和纖維蛋白原的凝集作用的NP活性值通過乘以相應的NP特異性醯胺分解活性而校正(以野生型的百分比表示)。可以注意到，在表1和1a中用數字表示的PA和FC活性，對出現在兩表中的NP是不同的。這是由兩個因素造成的，第一，表1a的結果一般都代表僅1次或2次重複試驗的結果，而表1的結果至少是4次重複的結果。因為PA和FC試驗的變異係數約在10～20％，所以可以想像到表1a的結果，對相同的NP來說會不同於表1的結果。第二，如上所述，當醯胺分解活性小於野生型凝血酶活性的75％時，表1a的結果根據Western印跡對於蛋白濃度進行了校正。這就可以對表1a中各種NP作更有意義的比較，因為那些結果都是對按Western印跡方法測定出來的相同蛋白濃度校正的。表1的NP不需要作大量校正，因為對絕大多數情況來說，丙氨酸突變保留參考序列凝血酶的大部分蛋白水解活性。
表1a中鑑定了特別顯著的PCA，數據表明至少保留了一些aPC活性，但基本完全消除了在我們的試驗中可檢測到的FC活性(600秒未出現凝集)。這些是雙突變體W50A、E229A和E229A、R233A，單突變體E229D(顯然與野生型酶只有一個亞甲基的差別)、E229F、E229S、E229W、E229Y、R233E、R233G、R233M、R233N、R233S、W50E、W50K、W50C和K52C。
表1和1a中PCA只是NP的代表，其中凝血酶殘基突變以便產生特別安全和有效的PCA。其他這類PCA用本發明介紹的方法或對本領域技術人員顯而易見的其他方法很容易鑑定。例如用額外的活性來選擇多位點突變，和讓以丙氨酸篩選鑑定出來的其他有希望的位點發生飽和突變，以便選擇最適宜的修飾。因為很顯然，其他具有理想的促凝和抗凝作用的NP都能成功地鑑定出來，這將僅僅是鑑定和分離他們的常規試驗問題。
從表1和1a中顯顯可以看出E229和R233是PCA的關鍵殘基。以範德華力接觸E229或R233、靠近E229或R233的殘基以及與含有R233結構域及含有E229的環接觸的殘基而進行的凝血酶殘基修飾，可能類似於直接取代E229或R233而影響纖維蛋白原凝集和蛋白C激活，這是通過引起E229或R233的方向或位置的改變或通過破壞正常情況下與E229或R233有關的分子內部相互作用而引起的。為了鑑定其取代可以模擬E229取代的那些殘基，找出了凝血酶三維結構中最接近E229的殘基。把那些Cα在E229Cα10埃範圍內的殘基列在下表1b中表1b殘基Cα與CαE229距離(埃) 表1中的突變PA/FCE146 10.06 -S176 9.93 -T177 8.28 -R178 10.31Mt321.13I179 10.03 -D199 10.91 -A200 10.90 -C201 9.74 -E202 10.06Mt342.52W227 7.27 -G228 3.82 -G230 3.73 -C231 6.69 -D232 8.88 -R233 7.94Mt36b 10.87D234 10.64Mt36c 2.18G235 10.41 -K236 6.96 -Y237 7.75 -G238 7.88 -F239 9.32 -
用這種分析方法獨立鑑定出來的位點之一是R233，通過表1a中報導的結果證實這一點在PCA特異性上起重要的作用。表1報導的最初篩選中還鑑定出另外3個位點，這三個位點PA/FC比值都大於1，還證實這一結構域在分離凝血酶aPC活性的底物特異性上起關鍵作用。因此，製備那些表1b中列出的任一個或幾個殘基被取代或缺失或緊靠基插入殘基的NP是在本發明的範圍內。特別是位於E229Cα或R233Cα10以內的殘基都是特別有意義的，在8以內的那些殘基更是如此。但是，C201和C231不是優選位點，因為它們配對在天然凝血酶中形成一個二硫鍵。G228、G230、G235和G238也不是優選的殘基。因此，優選取代、插入或缺失的表1b中的殘基是S176、T177、W227、D232、K236、T237和G239。對表1b中的殘基用於取代優於缺失或插入，這種取代用不同於天然殘基所屬類群的成員來進行，或這種取代用天然殘基類群中的成員來進行。但是，一般來說，半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸不應用於表1b中任一殘基的取代。R233 10的殘基將與許多最靠近E229的殘基重疊，不重疊的額外殘基用Bode(op cit)三維結構很容易鑑別出來。
PCA多肽一般都是對相應參考序列殘基在下列凝血酶1個或幾個位點上有殘基取代的多肽，它們是K52、K65、Y71、N74、W50、D58、H66、E202、E229、D234和R233。殘基K52、K106、K107、K196和/或K65獨立優選地用天然胺基酸殘基，如G、A、V、L、I、S、T、D、N、E、Q、C、M、F、Y、P、W、R或H取代。K52一般用半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、穀氨酸、天冬醯胺或穀氨醯胺取代，在某些情況下，用穀氨酸以外的任何天然胺基酸殘基取代，或在其他一些實施方案中，用穀氨酸或天冬氨酸以外的殘基取代；而K65、K106、K107和/或K196典型地用丙氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、精氨酸或組氨酸取代。
Y71優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、S、T、I、E、Q、C、M、N、F、P、W、K、R或H取代，典型地是苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸或色氨酸取代。
N74優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、I、S、T、D、E、Q、C、M、F、P、W、K、R或H取代，典型地是用丙氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或天冬氨酸取代。
W50優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、I、S、T、D、E、Q、C、M、F、P、N、K、R、Y或H取代，典型地是用半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代。
D58、D193和/或D234獨立地優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、I、S、T、W、E、Q、C、M、F、P、N、K、R、Y或H取代，典型地是用丙氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、酪氨酸、蘇氨酸或絲氨酸取代。
H66優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、I、S、T、W、D、Q、C、M、F、P、N、K、Y、E或R取代，典型地是用丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、蘇氨酸、組氨酸或絲氨酸取代。
E202和/或E229獨立地優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、I、S、T、W、D、Q、C、M、F、P、N、K、R、Y或H取代，典型地是用丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、天冬氨酸、酪氨酸或絲氨酸取代。
R233優選用天然胺基酸殘基如G、A、V、L、I、S、T、W、D、Q、C、M、F、P、N、K、E、Y或H取代，典型地是用丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、蘇氨酸、組氨酸或絲氨酸取代。
代表上述突變結合NP都屬本發明範圍內。把上述2個、3個、4個、5個或更多個取代引入本文所定義的凝血酶中。單個胺基酸取代的結果一般都是加成性的，除非這些殘基相互間直接或間接發生作用。我們指望從上述11個關鍵殘基結合的多重取代中得到另外一些PCA(W50、K52、D58、K65、H66、Y71、N74、K106、K107、D193、K196、E202、E229、R233、D234)。它們很容易按下面介紹的相同方法篩選出來，以便鑑定那些性質有所改進，特別是促凝活性同抗凝活性之比明顯降低的那些。例如它們包括E229、R233、D234；E229、R233；E229，D234；R233，D234；E229，K52；R233，K52；D234，K52；E229，R233，K52；E229，D234，K52；R233，D234，K52；E229，R233，D234，K52；W50，D58；W50，K52；W50，E229；W50，R233；W50，D234；W50，E229，R233，D234；W50，E229，R233；W50，E229，D234；W50，R233，D234；W50，E229，K52；W50，R233，K52；W50，D234，K52；W50，E229，R233，K52；W50，E229，D234，K52； W50，R233，D234，K52；W50，E229，R233，D234，K52；E202，E229，R233，D234；E202，E229，R233；E202，E229，D234；E202，R233，D234；E202，E229，K52；E202，E233，K52；E202，D234，K52；E202，E229，R233，K52；E202，E229，D234，K52；E202，R233，D234，K52；E202，E229，R233，D234，K52；E202，W50，K52；E202，W50，E229；E202，W50，R233；E202，W50，D234；E202，W50，R233，D234；E202，W50，E229，R233；E202，W50，E229，D234；E202，W50，R233，D234；E202，W50，K52；E202，W50，E229；E202，W50，R233；E202，W50，D234；W50，E202；E202，K52；E202，E229；E202，R233；E202，D234；D58，K52；D58，E229；D58，R233；D58，D234；D58，W50；D58，E202；D58，K52，E229；D58，K52，R233；D58，K52，D234；D58，K52，W50；D58，K52，E202；D58，E229，R233；D58，E229，D234；D58，E229，W50；D58，E229，E202；D58，R233，D234；D58，R233，W50；D58，R233，E202；D58，D234，W50；D58，R233，E202；D58，W50，E202；D58，W50，R233；and D58，W50，D234.
多重取代的NP實施方案舉例如下(用上述分類號指示取代的類別，如W50.3表示W50用V、L、I或M任一個取代)W50.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8，K52.2，.3，.4，5，.6，.7或.8； W50.1，.2，3，.5，.6，.7或.8，D58.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8；W50.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8，H66.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8；W50.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8，Y71.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8；W50.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8，E229.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8；K52.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，D58.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8；K52.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，H66.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8；K52.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，Y71.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8；K52.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，R233.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8；D58.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8，H66.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8；D581，.3，.4，.5，.6，.7或，8，Y71.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8；D58.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8，E202.1，3，.4，.5，.6，.7或，8；D58.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8，R233.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8；H66.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，Y71.1，.2，.3，.5，.6，7或.8；H66.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，E229.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8；H66.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8，R233.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8；Y71.1，.2，3，.5，.6，.7或.8，E229.1，.3，.4，.5，.6，.7或.8；和Y71.1，.2，.3，.5，.6，.7或.8，R233.2，.3，.4，.5，.6，.7或.8.
多重取代的NP特別有W50F，Y或H，D58E，N或Q；W50F，Y或H，H66F，Y或W；W50F，Y或H，Y71F，H或W； W50F，Y或H，E229D，N或Q； W50F，Y或H，R233K或H；D58E，N或Q，H66F，Y或H；D58E，N或Q，Y71F，H或W；D58E，N或Q，E229D，N或Q；D58E，N或Q，R233K或H；H66F，Y或W，Y71F，H或W；H66F，Y或W，E229D，N或Q；H66F，Y或W，R233K或H；Y71F，H或W，E229D，N或Q；Y71F，H或W，R233K或H；E229D，N或Q，R233K或H；W50A，K52A；W50A，E229A；W50A，R233A；K52A，K106A，K107A；K52A，D193A，K196A；K52A，E202A；K52A，E229A；K52A，K233A；E229L，R233E；E229L，R233N；E229L，W50K；E229L，K52W；E229A，W50L；E229L，W50M；R233E，W50G；R233E，W50K；R233E，W50K；R233E，W50L；R233E，W50M；R233E，W50R；R233E，W50T；R233E，K52W；W50L，K52A；W50L，K52W；G230C，C231G；C231D，D232C；E202C，C201E；C201A，A200C；和E229A.R233A.
多重取代NP的進一步示例選自以下K52G，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q M，F，Y，P，W，R，K或H；K52A，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52V，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52L，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52I，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52S，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H； K52T，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52D，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52N，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52E，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52Q，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52M，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52F，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52Y，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H； K52P，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52W，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52R，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；K52H，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，C，Q，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50G，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50A，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50V，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50L，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50I，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50S，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50T，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50D，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50N，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50E，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50Q，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50M，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50F，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50Y，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50P，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50K，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50R，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50H，E229G，A，V，I，L，S，T，D，N，Q，C，M，F，Y，P，W，R，K或H；W50G，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50A，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50V，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50L，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50I，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50S，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50T，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50D，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50N，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50E，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50Q，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50M，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50F，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50Y，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50P，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50K，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50R，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；W50H，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229G，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229A，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229V，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229L，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H； E229I，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229S，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229T，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229D，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229N，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229Q，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229M，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229F，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229Y，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229P，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229K，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229R，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；E229H，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H；和E229W，R233G，A，V，I，L，S，T，W，D，Q，C，M，F，Y，P，N，K，E或H.
在緊鄰表1，1a或1b中指定的參考序列中任一個位置的凝血酶胺基酸處插入一個或多個胺基酸的NP包括在本發明範圍內。插入性NP一般都有含NH2-PP-A-(X)n1-B-PP-COOH的多肽結構，基中X是插入的殘基(可以是相同的或不同的)，n1是整數，A或B是指定要插入的位點，PP代表NP其餘部分或NP N端或C端的一個鍵。這樣的實例包括K52AA、R233RA、K52KA、K52AK、E229AE、E229EW、E229WE、E229EY、E229YE、G228GE、G228GA、G228GS、G228GAA、G228GAE、G228GSE、G230GA、G230GS、G230GAA和E229EA(從N端向C端讀起)。典型的插入見於E22910範圍內，並緊靠表1b中任一個殘基。插入部分包括從1到約1000或更多個殘基的凝血酶或非凝血酶多肽，雖然這些殘基典型地是從NP A和/或B鏈的N端或C端引入。這些多肽包括凝血酶原序列或或其段(天論是人的還是動物的)、為了從細胞培養物中免疫親和純化NP產物的抗原序列、信號序列以及象下面將要詳細介紹的序列。
本發明範圍內的NP還包括把糖基化位點引入參考序列中或從參考序列中去掉的NP，無論是通過取代、插入還是缺失一個或幾個胺基酸殘基。這種變化將導致NXS或NXT序列的建立或去除，其中X可以是任一殘基。因此，可用天冬醯胺取代位於距絲氨酸或蘇氨酸2個殘基的N-未端方向的任何殘基，以引入一個糖基化位點。或者用任何一個殘基取代N53、缺失F54、用絲氨酸外的任何殘基取代T55，或在N53和T55之間至少插入一個殘基來消除野生型凝血酶N53位上的單一糖基化位點。
缺失性NP也包括在本發明範圍之內，即其中有一個或幾個參考序列中的胺基酸殘基在指定的位置上被除去，側翼的殘基按一般方式以肽鍵連接。表1或1b中闡述的任何一個位點都適於缺失，雖然一般不優選缺失P、C或G殘基。此外，在有些NP實施方案中凝血酶A鏈作為一個整體被選擇性地缺失。在本發明實施方案中，缺失在E229約10的範圍內進行，包括表1b中任何一個殘基，優選A200、E202、Y237、I179、R178、E146、以及S226。
缺失或插入，典型的都是相對小的，如1到10個殘基，一般不多於2個殘基，儘管缺失或插入可以是相當大的，即如果根據具體情況，它們不在對促凝或抗凝活性所必須的參考序列部分，或在翻譯後或回收後加工過程中把額外的序列去掉。部分缺失或插入的殘基數目將取決於它們是否構成象螺旋或摺疊的二級結構中的成分(此時，僅有1個或優選2個殘基插入或缺失)，或結構上很少限制的結構域如環狀，其中較大數目的殘基可以缺失或插入而不會過分擾亂凝血酶的結構。
有缺失、插入和/或取代的結合形式的NP也包括在本發明的範圍之內。典型情況有，單一殘基的缺失將伴隨一個在缺失位點上1到3個殘基的插入；較大結構域的缺失可根據具體情況對於促凝活性或aPC活性不一定必須伴有一個插入。凝血酶A鏈可選擇性從NP中缺失，此時B鏈中常規與A鏈形成二硫鍵的半胱氨酸(C119)被取代或從B鏈中缺失。在C119處典型的取代是R、G、A、V、I、L、S、T、W、D、Q、M、F、Y、P、N、K、E或H中的任一個，但通常是S、M或A。為了有利於表達或回收NP，所用的大部分插入都應自然伴有在參考序列中的其他修飾，這種修飾對NP提供理想的特徵，如抗凝或促凝作用。
本發明的NP可以進行翻譯後共價修飾，如，天冬醯胺或穀氨醯胺的脫氨作用，或半胱氨酸的氧化作用，以及根據用於表達突變體的宿主細胞在N53上缺失或變異糖基化作用。含有這種修飾的NP都包括在本發明的範圍內。假如N53是糖基化的，優選用哺乳細胞特徵性糖來糖基化，儘管它也可能具有真菌(如酵母)的糖基化模式。由成纖細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、神經細胞、肝細胞或骨髓細胞或細胞系，或任何哺乳細胞系如CHO或胚腎細胞表達的NP糖基化特性都是可接受的。
凝血酶體內清除的一個主要機制是形成凝血酶-AT-III複合物，這主要依賴細胞表面的肝素樣分子。我們預期突變凝血酶的肝素結合位點將阻止肝素結合，從而延長這種蛋白的血漿半衰期。臨床上，這種降低達到抗血栓形成效果所需的蛋白量。在這一實施方案中，使肝素結合位點突變，以使NP不再能夠顯著結合肝素。這通過至少在已知肝素結合結構域上的一個或幾個殘基的缺失、取代或插入而完成(包括R89、R180、R245、K248和K252)。有抗性的NP包括能導致把新O-或N-連接的糖基化位點(NXS/T)引進結合區的取代或插入(如R180N)。
表1顯示兩個涉及三重丙氨酸取代的突變體對由肝素介導的AT-III抑制有抵抗作用，顯示在肝素存在下纖維蛋白原凝集活性大於50％，而野生型凝血酶為18％。其中一個這樣的突變體同時有R178、R180和D183取代，顯示出促凝活性或抗凝活性沒有降低。最佳的突變體是通過篩選對肝素介導的抑制的最大抗性(特別是在抗凝血酶III存在下)而鑑定出來的。此類變體可選擇性地與上述介紹的各種變異結合，如那些表現出促凝活性與抗凝活性相比有所降低的突變。這樣的NP和肝素結合服用會取得強抗凝效果，其中抗凝途徑由NP所激活，內源性凝血酶的促凝活性被肝素介素的AT-III抑制。
新型多肽的製備和篩選理想的NP顯示調節的纖維蛋白原凝集或aPC活性、降低的肝素抑制作用、改變的酶解血小板凝血酶受體的能力和其他理想特性，這些NP可通過用本發明中介紹的體外相關試驗篩選候選物而鑑別出來，然後必要時在動物中檢測再確定在血栓形成或出血試驗中的有效性。外源aPC可用作陽性對照。然後任選在已證明aPC灌注有效的動物模型如兔、豚鼠、狒狒敗血病休克或動脈血栓形成模型中直接檢測選出的NP。此外這種NP的抗凝效力可在心肺分流術模型中測定。這些試驗是常規的，並在本領域內已廣為人知。不需要做過多的試驗來製備和檢測那些本發明具體公開以外的NP。
本發明NP很容易用本領域已知的方法製備。通常，編碼NP的核酸通過PCR、體外合成、克隆、結合前三者而製備，若有必要還包括編碼凝血酶核酸的定點突變。在體外系統或重組宿主細胞中表達。表達方法之一是用特定tRNA進行基於核糖體的合成(Ben-ner，」TIBTECB」12158-163(1994)和Robetson等，」J.Am.chem.Soc.」1132722-2729(1991))，但通常是編碼NP的核酸(常為DNA)被插入到適當的表達載體中，用此重組載體轉染宿主細胞，並在適當培養基中培養此細胞，通過層析或其他純化方法從重組細胞培養物中回收具有所需胺基酸序列的NP。本發明也包括在重組細胞培養中或通過體外方法部分合成NP，然後用多肽連接酶進行多肽片段的連接(逆蛋白水解合成)。
表達NP的核酸典型地編碼含有所需突變的前凝血酶原，因為這有利於表達和用現有的用於凝血酶的方法加工。此外，「無gla區」凝血酶原的重組表達的已知方法很適於製備本發明的NP。本發明也包括表達編碼下述任何NP類似物的核酸，(a)前凝血酶-2(α-凝血酶)或前凝血酶-1，(b)「meizothrombin des 1」的雙鏈序列(可表達一條從S156(Degen et al)一直延伸到編碼B鏈的核酸的3』末端的單鏈，或共表達分別編碼S156片段和凝血酶B鏈的核酸)，(c)凝血酶(表達編碼A鏈和B鏈的一條單鏈，或在相同細胞中共表達分別編碼A、B鏈的核酸)，或(d)無A鏈的凝血酶B鏈。「分別編碼」這裡指編碼A鏈和B鏈的核酸至少被一個終止密碼子所分離，若必要，下遊核酸(通常為B鏈)從一個起始密碼子開始。然而應注意的是，細菌多順反子表達盒可不需要下遊編碼序列的起始密碼子。獨立地表達兩鏈的合適的載體和宿主細胞在美國專利4,923,805描述過。這種異雙體的表達系統通常是哺乳動物。
多順反子表達系統用於包括上述凝血酶兩條鏈序列的單一細胞共表達。這些系統本身是已知的，尤其用於在細胞培養中獨立合成PN的A、B鏈，從而不需要翻譯後的加工。在這種情形下，通常兩條鏈在相同表達調控序列指導下表達(鏈與表達調解序列可在相同或不同的載體上)。然而，編碼每條鏈的核酸需要含有自身起始密碼子，更可取的是，每個核酸都編碼它自身的信號序列。
任選地NP作為α-凝血酶前蛋白或分離的A鏈B鏈被表達，從而NP作為前體表達並加工成成熟NP，並且從宿主細胞中分泌出來。在此所用的前序列或信號序列包括與凝血酶基因來源相關的天然的前序列，例如前凝血酶原的人前序列；或含有與該凝血酶原信號的序列或來源不同的胺基酸序列的前序列。合適的前序列包括(a)微生物蛋白酶的，如枯草桿菌蛋白酶，(b)哺乳動物蛋白酶的，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、纖溶酶包括尿激酶或tPA，還有凝血因子如因子V、X、IX、VII、VIII或纖維蛋白原，(c)細胞因子的，例如γ-幹擾素或白細胞介素，(d)生長因子的，如生長激素或TGF-α，(e)多肽或具有與人凝血酶A、B鏈同源的N末端成熟序列的蛋白的，(f)免疫球蛋白的，(g)受體的，(h)其他分泌的或細胞膜結合蛋白的前序列，或(i)用於指導無gla區凝血酶原分泌的已知的前序列(WO 93/13208的第11頁30行到第12頁21行)。任意選擇的信號序列來自宿主細胞，或至少宿主細胞所屬種系分支或與之同源。例如，人們常在酵母表達系統中使用酵母蛋白的前序列，比如交配因子，或在細菌表達系統中用細菌的前序列，比如ST-II或β-內醯胺酶。從有與成熟凝血酶A、B鏈相同的成熟N-末端殘基的異源多肽中選擇信號，並且使用那些帶有N末端同源凝血酶鏈的信號是很理想的。多種多樣的合適的信號序列已為人知，並且可用在本發明提到的NP的製備方法中。
編碼分泌型NP的核酸結構通常可編碼凝血酶A或B鏈，A、B鏈的N末端與相同或不同信號序列的正常C末端熔合。按本領域普遍已知的那樣，它們在表達調控序列如啟動子、操縱子、增強子多聚苷酸序列的調節下被拼接入表達載體。構建合適的表達載體用來分泌性或在胞質中表達本發明NP對本領域技術人員是常規操作，可用常規的分子生物學工具來完成，包括體外核酸的合成、PCR、接頭、連接酶、限制性內切酶、表達和穿梭質粒、轉染工具等，所有這些都是公眾可得到的(大部分有商品供應)。
用於給定重組宿主細胞表達NP的合適啟動子、增強子、終止序列和其他功能子是人們已熟知的，適於用編碼所需NP的核酸轉染的宿主細胞也是已知的。有一些已在上述提到，另一些則在WO93/13208第12頁21行到第19頁5行和EP319，312B1第16頁10—18行和表II中有述。使用能使NP糖基化的宿主細胞是很理想的，典型的這些細胞包括哺乳動物細胞，如人胚腎293細胞，COS細胞，CHO，BHK—21細胞等等。另外，以前已用來在重組細胞培養中表達蛋白水解酶或酶原的宿主細胞，或已知在非重組培養中高水平表達這種酶或酶原的宿主細胞都是適合的。後一種情形下，如果內源性酶或酶原很難與NP分離開，那麼內源性基因應通過同源重組而被去除，或其表達通過編碼反義序列的核酸共轉染宿主細胞而受抑制，這裡的反義序列是編碼不需要的多肽的RNA的互補序列。此時最好用高水平表達內源性基因的表達調控序列(如啟動子、增強子等等)對NP的表達進行調控。
應選擇宿主載體系統以生成基本一致的NP，這樣就避免了從其他同種異型NP中純化單分子種的需求。如果細胞能夠糖基化，那麼基本上所有的NP分子都應被糖基化。此外，最好選擇(在相關細胞室中)沒有能鏈內裂解凝血酶A、B鏈的蛋白分解活性的宿主細胞。選擇的細胞不含有蛋白酶，例如在胞質中這種蛋白酶將在凝血酶BR62、R123、R73或K154後裂解，已知所有上述位點都是B鏈降解的位點。例如，已知大腸桿菌和其他微生物株就很少或不含細胞外或胞質的蛋白分解活性(除信號多肽酶外)。這樣的細胞最好用於以下表達系統中，其中A鏈和B鏈與相同或不同信號序列融合、在同一宿主細胞中表達。A鏈、B鏈被共同分泌進胞質或細胞外基質，它們在那裡形成二硫鍵。有害蛋白酶的缺乏有助於確保產物不受作用於NP的宿主內源性蛋白酶的影響而對鏈長產生微小異質性，但是A、B鏈的獨立分泌不依賴這些細胞。此外，或替代地，A或B鏈的鹼性殘基也就是蛋白酶解的位點被一些K或R以外的殘基所取代。例如，據報導K154是在γ-凝血酶轉化中酶解的位點之一(Colman etal.，」Hemostasis and Thrombosis」，P.154(1987))。上表1表明K154被A取代而活性沒有明顯的變化。因此K154可被R以外的其他殘基所取代以提供對蛋白水解降解的耐性(還有其他任何需要的變異)。這也可延長NP的體內壽命。
重組細胞在常規條件下，用以前已用於目的細胞的常規培養基進行培養。這些條件和培養基已廣為人知。新轉染的細胞只可以短暫地表達NP，而穩定的轉化子很容易按傳統的操作獲到用一個選擇基因如DHIR或谷胺醯胺合成酶共轉化，並且在選擇劑存在下連續培養，選擇劑例如分別為氨甲喋吟或甲硫氨酸Sulfoximine。在取代基和插入特性的微小差異，NP的產率就可有顯著差別。在這種情形下，對篩選產生的凝血酶量至少為參考凝血酶在相同表達系統中所得量的75％的表達系統是有利的。有時這體系可用來在低於常規37℃，常在約10℃～30℃，最佳在15℃～27℃下培養細胞。微生物或哺乳動物細胞就是如此。
優選NP作為一適當組裝的、二硫鍵連結的凝血酶A和B鏈類似物或作為單獨B鏈類似物被表達。NP通常是水溶性的。它在細菌中以折射體的形式表達，這種情形下回收不溶的NP，並用已知的方法重新摺疊，例如通過溶解在鹽酸胍中，然後漸漸移去變性劑。本發明直接表達的NP可有一額外的N末端蛋氨酸或封閉的蛋氨酸殘基，儘管可使用能裂解這樣的外源N末端蛋氨酸殘基的宿主細胞。
如果A、B鏈融合起來，例如當NP作為α-凝血酶類似物被表達時，那麼為激活前體酶原成為蛋白水解活性的NP，需要翻譯後的蛋白水解加工過程。這樣的前體類似於天然凝血酶原，或者可以是一條或兩條與凝血酶異源性多肽融合的NP鏈，如信號序列的情形。宿主細胞培養自身就可完成蛋白水解活化和/或加工，也可在NP前體回收(有或無NP前體的純化)以後完成。翻譯後的蛋白水解加工(或在宿主細胞培養中，或在NP前體初步回收以後)用來除去一些凝血酶原(或凝血酶原異源性)序列，這些序列的N末端與NP A或B鏈融合，或插入在NP前體的其他地方(例如利於純化的抗原標記)。NP前體可被一種酶或多種酶水解，這些酶能夠在NP A、B鏈內正確裂解，沒有過多的或不需要的水解作用。通常，用來除去前序列、激活天然凝血酶原的合適的酶見於龍狀蝰蛇毒液中。因子Xa也用於活化NP前體。NP成熟B鏈或共表達的成熟個體A、B鏈不需要蛋白水解活化。
用不同蛋白酶或凝血酶自身識別並酶解的另一序列來取代凝血酶活化區(因子Xa裂解位點)有利於NP前體的蛋白水解活化。用於本發明NP的適當取代的活化位點在WO93/13208，第9頁21行到第10頁17行中有述。在WO93/13208中注意到，因為酵母能表達KEX2並且可在活化位點處內源性裂解凝血酶前體，因此，用酵母KEX2位點取代凝血酶原中凝血酶活化位點是值得注意的。能適當取代凝血酶活化區域的其他序列公開在EP319，312 B1的表1中。作為NP或其前體細胞培養加工的一部分，這些序列被細胞膜結合的蛋白酶所裂解。
在NP或其前體表達或純化中注意時間都可進行蛋白水解活化，尤其在NP前體從細胞或細胞培養上清純化後進行。注意，含有一新的二元位點(由R或K殘基插入或取代進入凝血酶序列而產生的)的NP可能對不會裂解天然凝血酶的酶的水解作用敏感，從而降低了表達或活化中的產率。此時需要選擇一表達系統和/或一個有不同底物特異性的激活酶以減少偶發的裂解。
從重組宿主細胞培養產生的NP量根據許多因素變化，包括培養條件和NP本身性質。理想的是，培養產生的NP按重量計應大於參考凝血酶的一半(優選大於75％)。
不需進一步純化，在診斷上使用重組細胞的含NP的、活化的、濃縮的條件培養液是可能的。然而，想要治療用的NP應用以前用於凝血酶或其他蛋白質的方法進行分離純化，例如天然或還原性/SDS電泳，等電聚焦，固定PH梯度電泳，鹽析，溶劑抽提(用乙醇等)和層析，如凝膠過濾，離子交換(陽離子或陰離子)，配體親和層析(cibacron藍F3GA或對氨基苄脒)、免疫親和層析，包譜聚焦，反相或疏水作用層析。適當的方法公開在Colman等，「Hlemostasis andThrombosis」，P.148(1987)中，和其中引用的參考文獻中，WO93/13208第19頁33行到21頁25行及其他常規來源。活化酶(如果有的話)在隨後的純化步驟中被固定或除去。一般分離NP使純度按蛋白重量計大於95％，優選大於99％。
NP或其片段也可在體外製備，尤其當它們較小時，如約30個殘基或更少時。但更大些的完整NP也可在體外過程中製備。例如，較小的NP用Merrifield」J.Am.Chem.Soc.」852149(1963)描述的標準因相肽合成操作進行合成而製備。然後用多肽連接酶連在一起(逆蛋白水解)。蛋白合成的體外方法也可用於製備NP，而不需要重組細胞培養。這些方法對小規模製備有用，有利於降低宿主細胞蛋白酶對產率的可能影響。體外NP蛋白合成還有另一重要優點是可在特異性位點向NP中引進非天然胺基酸殘基(Benner，和Robertson etal.，如上所引用)。因此本文使用「胺基酸殘基」一詞(有關取代或插入對凝血酶的修飾，尤其是單個胺基酸取代或插入)時，應認識到該胺基酸不限於與天然tRNA結合的天然殘基。Robert-son等所述氨基醯基tRNA可用多種非天然胺基酸殘基有效製備(「非天然」指不在蛋白質中天然存在的，儘管在生物系統本身可以發現該胺基酸)。因為該tRNA被選擇結合一個不被蛋白合成中任何普通tRNA識別的密碼子，選擇的非天然胺基酸殘基只結合在NP序列中該獨特密碼子選定的特殊位點。這樣，NP被在所需的獨特插入或取代位點含一無義密碼子(如UAG)的核酸編碼。被適當結合的非天然胺基酸例如描述在Greenstein等「Chemistry of theAmino Acids」Vols.1-3，1986中。通常，人們可以用藥學上無毒的，天然存在但通常不被結合進蛋白質的L-胺基酸。這樣的胺基酸結構上與在給定位點產生所需效果的天然殘基有關，用於進一步分離和完善所需的NP特性。
本發明的NP也包括被一非肽部分取代的凝血酶，或者其目的是開始製備NP時使用，或對如本文別處描述的那樣通過胺基酸取代、插入或缺失製備的NP作隨後的修飾。凝血酶或其組成鏈或亞片段的共價修飾可製備NP本身。既然我們已經確定了凝血酶促凝與抗凝功能中涉及的主要殘基，本發明也包括在這樣的位點引入共價修飾，以達到用天然殘基產生相應的定點突變所達到的相同目的。例如含有羧基的殘基如E229側鏈通過與碳二亞胺(R′－N＝C－R′，R和R′是不同的烷基)反應而衍生化，或通過與氨或取代的胺反應而被醯胺化。
如R233和K52的鹼性側鏈也可被衍生化。如，R233D和E是很好的PCA，其中正電側鏈已被負電側鏈所取代。相似的電荷逆轉通過用氯乙酸取代凝血酶R233或K52而完成。賴氨酸殘基用乙酸酐進行乙醯代。
凝血酶中色氨酸是一個很稀有的胺基酸。因此，W50是翻譯後共價修飾的優選位點，因為預期在具有更普通殘基的其他位點的取代成功的可能性較小。W50與氧化劑如滷素供體如溴反應，將產生如下側鏈結構。此反應應在水性溶劑中和低滷素濃度下進行。 為得到本發明的NP，NP或凝血酶的其他共價修飾對本領域技術人員來說是顯而易見的。不需要起反應的側鏈通過用抗體直接對抗含有殘基的表位而被保護。為完成這樣的修飾所用試劑已為人知並廣泛應用於診斷和製備領域。見T.Creighton，ProteinsStructureand Moleculer Properties，1983。
共價修飾也可用於達到製備具有分離的底物特性之外的目標。例如將NP與水不溶性基質交聯使其不溶。這通過NP和基質與形成共價交聯的雙功能試劑反應來完成。合適的試劑例如有1，1-雙(重氮基乙醯)-α-苯乙烷，戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯，如與4-疊氮基水楊酸的酯，均雙功能性醯亞胺酯，包括二琥珀醯亞胺酯如3，3′一二硫代二(琥珀醯亞胺基丙酸酯)，和雙官能馬來醯亞胺如二-N-馬來醯亞氨基-1，8-辛烷。衍生化試劑如3-[(對疊氮苯基)二硫代]丙醯亞氨酸甲酯產生光敏中間體，該中間體在光存在下能形成交聯。或者將NP固定在反應活性水不溶性基質中，如溴化氰活化的碳水化合物和US 3，969，287；3691016；4195128，4247642，4229537和4330440中描述的反應性底物。
也可通過將NP與各種非蛋白聚合物相連而共價修飾，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧亞烷基，按U.S 4640835，4496689，4301144，4670417，4791192，4179337中所闡述方法進行。
體內NP的循環半衰期可以通過把NP連在能提供延長的半衰期的聚合物上而被延長，例如聚乙二醇(PEG)。PEG是一個非免疫原性的、線性的，不帶電荷的聚合物，每個氧化乙烯單位含3個水分子。(Maxfield，et al.，「Polymer」16505-509(1975)；Bailey，F.Eet.al.，「Nonionic Surfactants」，Schick，M.J.ed，pp.794-821(1967))。一些治療性酶已被偶聯到PEG上以提高他們的體內半衰期(Abuchowski，A.et al.，「J.Biol.Chem」2523582-3586(1977)；Abuchowshi，A.et al.，「Cancer Biochem.Biophys.」7175-186(1984)).一個IL-2-PEG偶合物已被報導增加了循環時間和效力(Katre，N.V.et al.「Proc.Natl.Acad.Sci.」841487-1491(1987)；Goodson.R.et al.，「Biol/Technology」8343-346(1990))。另見Abuchowski，A.et al.，「J.Biol.Chem」2523578-3581(1977)。這些文獻中所用的PEG偶聯方法中任一種方法對本發明的NP都適用。
最後，在診斷學應用中通過與以前用於診斷學檢測的可檢測基團交聯而對NP共價修飾，詳述見下文。
本發明NP的應用本發明的NP用於治療、診斷和預防方法。其用途依賴於其具有的特性，這對本領域普通技術人員是顯而易見的。大部分情形下，所有的NP將保留凝血酶的免疫表位，因此在凝血酶的免疫檢測中NP可用來代替凝血酶，無論它們是否落在本文所用的PCA或FCP的定義中，也無論他們是否具有蛋白水解活性。另外，PCA與FCP具有專門的治療應用。
抗凝劑NP，特別是PCA，用來改善或阻止不良的凝塊。它們有效地活化內源性蛋白C途徑，作為一種強抗凝劑通過產生外源aPC使FVa、FVIIIa失活，並且通過使PAI-1失活增強了tPA介導的纖維蛋白溶解作用。這種NP，尤其是PCA的臨床適應症，包括血栓性疾病或另一些情況，如敗血症休克、冠狀溶栓和血管成形術的輔助治療，肺栓塞、短暫的局部缺血和中風，不穩定心絞痛，心肌梗塞，深靜脈血栓和各種動、靜脈血栓。在敗血性休克治療方法中，抗凝劑NP給深度敗血症者服用(苯蘭氏陽性、陰性菌、真菌的感染)，例如病人表現體徵是高熱，低壓，DIC，腎功能不全和/或ARDS。抗凝劑NP尤其是PCA，用於到以前aPC的任何應用中。這可見EP191606B1中P13L52-P15L32。為治療應用，將抗凝劑NP尤其是PCA給予哺乳動物，尤其是人，以藥物可接受劑型及治療有效劑量進行給藥。抗凝劑NP可作為一個濃縮藥團靜脈內給藥或一段時間的連續輸注，或肌內、皮下、動脈內、滑膜內、鞘內、表皮、吸入途徑等。抗凝NP也適於導管給藥主要起局部抗凝作用。
抗凝劑NP也用在凝血疾病的診斷上。在病人中發現的大部分高凝狀態並不能歸因於特異的分子缺陷。許多有血栓發作傾向的病人是由於出生先天的蛋白C激活途徑組分的缺陷，這樣的病人目前很難診斷。PCA特別用在缺陷的活化蛋白C途徑和途徑某一成分缺乏的診斷。在此實施方案中，這些病人並不急需抗凝治療，但可以被了解已有未知起因的過度血栓形成傾向。給病人服用抗凝劑NP，如PCA，病人血液抗凝狀態在PCA有時間起作用後測定。PCA的劑量基本上與在一般病人誘導可檢測的抗凝作用有效的PCA量相同。基本上在與一般病人體內誘導可檢測的抗凝作用相同的時間檢測病人的抗凝狀態。血液凝固的任何檢測方法都適合，如aPTT等等。如果PCA不能成功地誘導病人血液可檢測抗凝作用，那麼可能病人有血栓調節素—蛋白C抗凝途徑的缺陷。在另一實施方案中，將可溶的TM與PCA共同給藥，確定哪一蛋白能克服缺陷並產生缺陷部位的信息。如果TM與NP誘導抗凝，而蛋白C與NP不能，則可作出結論受試者的TM是缺陷的。
促凝血的NP作為促凝劑用於任何目的的治療。例如，它們被滲透進敷料、繃帶等中，或用於表皮給藥的其他劑型中。FCP在大塊實質性腫瘤的血栓形成性治療中作為血栓形成促進劑也是有效的。如U.S專利5,147,638中描述，FCP可用來取代C4b結合蛋白、或抗aPC抗體，最理想的是與細胞因子結合，例如TNF-α、TNF-β、γ-IFN，IL-1，IL-2和/或GM/CSF。FCP的劑量將被調節到可誘導腫瘤內凝血，但在其他地方不產生臨床上明顯的凝血。依賴於內源激活的NP原型也可用於此方法中。
NP的劑型是那些其他蛋白治療所用的常規劑型。NP應是無菌的，最好是放在無菌的容器中(如，用橡膠塞子密封的小瓶)，並含有無毒的藥用載體，包括鹽和溶劑。這種載體的例子包括離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩衝液如磷酸鹽，甘氨酸、精氨酸、賴氨酚、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹼金屬鹽，或電解質如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、矽膠、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素類物質和聚乙二醇。NP的凝膠形成或表皮給藥劑型的載體包括多糖如羧甲基纖維素鈉或甲基纖維素，PVP，聚丙烯酸鹽，聚氧乙烯—聚氧丙烯嵌段聚合物，FEG和木蠟醇。可使用常規的儲存形式，例如包括微膠束、納膠束、脂質體、膏藥、吸入劑型、鼻噴霧劑、舌下片劑。在這類載體中一般將NP配製成濃度約1～150μmol或1～200mg/ml。特別當(一般情況如此)NP含有連接A、B鏈的二硫鍵或在B鏈內存在二硫鍵時，最好還包含抗氧化劑如抗壞血酸。應選擇適當的製劑pH值使脫醯氨作用和自身水解作用達到最低限度，通常pH值約為5～8。另外製劑最好是凍幹的，但也可以水溶液的形式製備和貯存。
預防或治療血栓形成的抗凝NP的合適劑量取決於殘餘促凝活性的量(如果有的話)、血栓形成的部位及性質或待治療的預期血栓形成、凝血疾病的嚴重程度和病程、抗凝NP用於預防還是治療、以前治療的特點和進程、NP在循環中的半衰期、其它治療方法或抗凝劑的應用、NP給藥部位(局部劑量低於全身劑量)、患者對NP的應答、NP是否依賴內源性凝血酶原激活途徑(即提供的凝血酶NP是相應的凝血酶原或其非活化的片段)或其它主治大夫用於判斷的考慮因素。因為PCA是一種活性酶，抗凝血作用所需的量是很小的，在5-10nM範圍內(血漿終濃度)，實際上我們用兔子做實驗得出的結果是K52A PCA在血漿水平3—9nM範圍內產生抗凝治療作用，E229A PCA試驗結果相似。與其它抗凝血大分子如水蛭素(100—800nM)或GS-522〔一種凝血酶結合性DNA aptamer(2000—4000nM；PCT US 92/01367)〕相比，該結果非常有利。我們初步的猴子試驗證實，靈長類PCA劑量約為0.05U/kg/min到20U/kg/min，主要取決於殘留血纖維蛋白原降解活性(尤其在低劑量時，這將對防止纖維蛋白原的消耗和血小板激活起作用)和aPC活性的效力(PCA保留了大部分野生型aPC活性並將在低劑量範圍內使用)。1U等於對S-2238醯胺分解活性為1NIH單位(凝血活性)野生型凝血酶時的量(見實施例4)。
本發明中的NP並不期望具有免疫原性，因為在本申請的具體實施方案中只有少數關鍵殘基被修飾(少於5個)或被糖基化覆蓋。高度保守的單一取代(例如E229D)尤其如此。有些NP的半衰期可能非常短，這就需要將它們連續地輸注(野生型凝血酶的血漿半衰期可能極短，為幾秒)。然而，在有些情形下，這可能具有臨床上的優點，因為這就免除了當患者出現出血現象時對凝血酶抑制劑的需要。PCA在比人類低級的靈長類動物或其它動物中，適當劑量給藥後90—180分鐘內具有抗凝血效應。因此PCA通過一次注射或短時間(如10分鐘)輸注給藥是可行的。但是連續輸液仍在本發明範圍內。
促凝或抗凝NP適於給患者一次或進行系列治療。根據條件，可幾天或更長時間內重複給藥，一直到取得滿意抗凝或促凝血效果為止。
根據本發明的另一個具體實施方案，本發明的化合物作為促凝或抗凝劑的效力可通過將此化合物與另一種藥或對相關目的有效的醫療措施順序或同時給藥而得以提高。PCA可與其它已知抗凝劑如肝素、第十因子(Factor X)抑制劑、血小板凝集抑制劑等聯合使用，還可與其它溶栓治療藥聯合應用，如tPA、脲激酶或鏈蛋白激酶或氣球血管成形術或其它促血塊溶解的方法、動脈粥樣硬化症斑治療或血管內壁的操作或接觸。
本發明NP可用來鑑別與凝血酶靶位結合的物質(凝血酶結合的配體，即TBP)。特別有意義的是那些與凝血酶PC激活區結合而不與促凝區結合或與之正好相反的物質。在一優選實施方案中，它們與凝血酶結合併顯著抑制凝血酶的促凝血活性，而不相當地抑制它的PC激活功能。但這並不意味著TBP必須保持凝血酶PC激活功能完全不受抑制。此時所需要的只是PC激活被抑制的程度必須低於促凝血功能。典型的TBP將抑制靶凝血酶的蛋白分解活性，使PC活化與促凝血活性的比率小於0.5或大於2.0。TBP通常為二種類型的聚合物多肽或寡核苷酸，但基本上不受限制地含有分子量小於1500的任何物質。TBP具有診斷學價值，可間接標記凝血酶或從試驗樣品中將凝血酶與其它物質分離。TBP與凝血酶結合的能力還可用於從汙染的混合物如重組凝血酶表達細胞的細胞培養上清(其中包括凝血酶胺基酸序列NP)中回收凝血酶。典型地，在凝血酶免疫分析中，如果NP具有被所述凝血酶免疫分析中所用抗體識別的至少一個凝血酶表位，NP可用來替換凝血酶標準品，而TBP替換抗凝血酶抗體。NP還可用於特定單個凝血酶特性的功能分析，例如它的促凝血活性，只要NP保留有促凝血活性。
典型的多肽類TBP能特異結合FCP而不能結合PCA的多肽或蛋白質。因此它們是凝血酶的aPC功能或促凝血功能的高度特異性抑制劑。
肽類TBP是通過應用體外直接演化方法獲得的，如應用絲狀噬菌體顯示候選序列(或稱作噬菌體顯示法)以及依賴系統發生和篩選肽活性的本身已知的相似方法。這些通常都是很小的分子，大約含5到20個殘基。本發明的FCP和PCA多肽，以用於篩選寡核苷酸類TBP的同樣的總體方法，也可用於篩選這樣的肽類TBP。
抗體類TBP為免疫球蛋白，通常是單克隆抗體，能特異地抑制凝血酶的促凝或aPC功能。這些抗體是用含有參考序列凝血酶的一種蛋白組合物誘導的。為了得到一種抗凝劑抗體，以PCA吸附抗體混合物，不與PCA有效結合的抗體(但顯示凝集抑制功能)便被獲得。這些抗體必然針對纖維蛋白原裂解表位。促凝劑抗體的製備也採用相似的方法。
這裡所講的「單克隆抗體」是指從大量均一抗體群中獲得的抗體，即抗體群中的單個抗體具有基本同一的特異性和親和性。單克隆抗體包括雜合和重組抗體(如「人源化抗體」)，而不管其來源或免疫球蛋白種類或亞類歸屬，以及抗體片段(如Fab、F(ab′)2和Fv)。因此，「單克隆」抗體可用產生大量均一群體的特定方法生產。例如，單克隆抗體可用參考文獻中描述的方法製備Kohler和Milstein，「Nature」256495(1975)，Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciplesand Practice pp.53-103(1986)，Kozbor，「J Immunol.」1333001(1984)，或Bradeur等，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications pp.51—63(1987)，或者可用重組DNA方法製備。Cabilly等U.S.Pat.NO.4,816,567。
在本發明一種優選實施方案中，單克隆抗體對參考序列凝血酶的親和力至少為109摩爾/升，例如採用Munson Pollard，「Anal.Bichem.」107220(1980)的Scatchard分析方法測定。另外，單克隆抗體對凝血酶的促凝或抗凝活性的抑制率至少為50％，優選大於80％，最優選大於90％，例如，採用本文透露的PC激活分析或凝血酶時間測定法測定。
編碼單克隆抗體的DNA易於採用常規方法分離並測定序列(如，應用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。上述DNA優選來自雜交瘤細胞。分離出的DNA可插入到表達載體中，再將重組載體轉染到猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞等宿主細胞中，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。
對DNA進行選擇性修飾，以便改變其表達產物——免疫球蛋白的特徵。例如，將鼠抗體可變區的互補決定區(CDR)改變成人抗體的相應區從而產生「人源」形式的鼠抗體。在一些方案中，選定的鼠抗體框架區(framework region(FR))的胺基酸殘基也被相應的人抗體中的胺基酸殘基所取代。鼠抗體的「人源」形式也可以通過以人抗體重鏈和輕鏈穩定區編碼序列取代鼠抗體的同源序列而產生，見Morrison等，「PNAS」816651(1984)。
結合靶蛋白的寡核苷酸的演化選擇方法是眾所周知的，WO92/14843；Ellington等，「Nature」355850(1992)；Bock等，「Nature」355564(1992)；Ellington等，「Nature」346818(1990)；Tuerk等；「Sci-ence」249505(1990)。這些寡核苷酸通常稱作aptamers，一般含有常見的A、T、G、C或U鹼基或其衍生物，具有與靶蛋白預定位點結合的序列。此時，FCP與PCA在陰性(不結合)和陽性(結合)選擇方法中用來產生TBP，如特異性抑制凝集或aPC活性的aptamer。一種抑制凝血酶促凝功能(但基本不幹擾其抗凝劑活性)的TBP選擇方法，包括(a)製備候選混合物(寡核苷酸、肽、提取物、蛋白質等)；(b)將候選物與具促凝血活性(一般為參考序列凝血酶)的凝血酶接觸；(c)將能結合凝血酶的候選物與凝血酶分離；(d)將步驟(c)中得到的候選物與因突變而基本失去凝血酶促凝血功能的NP如PCA接觸；(e)回收那些不與PCA結合的候選物。這樣可以保證選擇出的所有候選物都能結合到與PCA多肽不同的胺基酸位點，即對凝血酶的促凝血功能關鍵的殘基。或者，富含潛在抗凝劑TBP的一種候選物或混合物可以這樣選擇(a)製備結合配體的候選物混合物(如上)；(b)將候選物與具有促凝血活性的凝血酶接觸(典型的為參考序列凝血酶)；(c)將與凝血酶結合的候選物與凝血酶分離；(d)將步驟(c)中的候選物與因突變而基本失去PC激活功能的凝血酶NP，如FCP接觸；(e)回收那些與FCP結合的候選物。這樣，所得到的候選物混合物富含或選出了不與在PC激活位點有突變殘基的凝血酶結合的候選物。這些候選物混合物再進行抗凝劑活性選擇，例如，通過進一步選擇不與PCA結合的TBP。最後，這將富集或者選擇出與PC激活位點不結合但與凝血酶的促凝殘基結合的候選TBP。步驟(c)和(d)在兩種方法中可選擇性地倒置。
抑制凝血酶蛋白C激活功能的TBP，通過一個類似上述富集具有抑制促凝血功能的TBP的方法選擇，如選擇結合凝血酶而不結合FCP的TBP。
結合步驟大部分情況採用固定化NP進行，典型地按眾所周知的方法將NP通過其糖基取代基或其N-末端或C-末端吸附到不溶性載體上(例如，伴刀豆蛋白A瓊脂糖固定法，再用α-甲基甘露糖苷洗脫，Bock等，op cit)。
當候選物是可進行複製的物質時，如絲狀顯示噬菌體或寡核苷酸，可以選擇性地在步驟(c)和(d)之間插入一步或多個步驟對選擇的或分離的候選物混合進行擴增。而通常在這些步驟中間，候選物並不進行擴增。另外，重複(a)至(e)步驟是需要的，而且多數情況下，在步驟(e)和(a)之間插入一個擴增步驟。擴增(寡核苷酸類候選物通常以PCR方法擴增)對於富集其所選擇功能的混合物是有用的。
FCP和PCA在製備TBP中是非常有用的中間體。
在診斷應用方面，TBP或本發明中的NP可選擇性地用可檢測的物質進行標記。可檢測的物質可以是直接或間接產生可檢測信號的任何取代基。例如，可檢測的物質可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S和125I；螢光或化學發光化合物，如異硫氰酸螢光素、若丹明或螢光素；放射性同位素標記物，如125I、32P、14C或3H、；或酶，如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
本領域中本身已知的各種方法均適用於用可檢測物質標記TBP或NP，參閱以下文獻所述方法以上文獻以及Hunter等，「Na-ture」144945(1962)；David等，「Biochemistry」131014(1974)；Pain等，「J.Immunol.Meth.」40219(1981)；和Nygren，J.「Histochem.and Cytochem.」30407(1982)。寡核苷酸類TBP採用以前用於診斷探針領域中的常規方式進行標記。
標記的NP應用於例如結合凝血酶的蛋白如抗體的檢測。另外，非標記NP與抗分析物抗體連接(共價結合或免疫吸附)或與分析物結合受體連接，由於它們能降解那些易用螢光或比色方法測定的己標記的肽，這使它們自身就可用作標記物。未標記NP與其連接的典型受體包括細胞表面大分子，如LFA-1、VLA-4、mac-1、I-CAM1、I-CAM2、I-CAM3或V-CAM1。未標記NP與其連接的典型抗體包括針對參與凝血連鎖反應的蛋白以及內皮細胞抗原、腫瘤抗原或其他細胞表面大分子的抗體。已知有適宜的結合蛋白或標記蛋白的方法，並方便地用來結合或標記NP。例如把NP B鏈N-末端融合到免疫球蛋白重鏈C-末端或細胞表面受體的細胞外結構域的C-末端上。
任選本發明的TBP或NP用於已知的免疫檢測技術中，如競爭性結合試驗、直接或間接夾心試驗及免疫沉澱試驗。Zola，Mono-clonal Antibodies；A Manual of Techniques.pp.147-158(1987)。
競爭結合試驗依賴標記的標準物質(它可以是凝血酶，或它的一個免疫反應性部分如本發明的標記NP)與試驗樣品凝血酶競爭結合有限量TBP的能力。試驗樣品中凝血酶量與標準品與TBP結合的量成反比。為了有利於檢測結合的標準物的數量，一般在競爭前或後把TBP固相化(不可溶解)，這樣同TBP結合的標準物和分析物就很方便地與仍未結合的標準物及分析物分離。
夾心試驗涉及二種TBP的使用，每種能同凝血酶的不同靶位或表位結合。在一種夾心試驗中，試驗樣品中的分析物通過已固定在固相支持物上的第一種TBP結合，然後，第二種TBP再同這種分析物結合，即形成一種不溶性的三組分複合物。David和Greene.U.S.Pat.No.4,376,110。第二抗體本身可以是用可檢測物標記的(在直接夾心試驗中)或可以用抗-TBP抗體來測定，這種抗-TBP抗體是用可檢測物標記的(在間接夾心試驗中)。例如，一種類型的夾心試驗就是ELISA試驗，其中可檢測物是一種酶。
本發明的TBP和NP在體內影像中也是有用的，其中，把用可檢測物標記的一種TBP或NP給予宿主，優選血流中，並檢測宿主中有無標記的TBP或NP及定位。
以下實施例只是說明性質的，無意以任何方式限制本發明。本發明所引用的所用專利和參考文獻都明確地併入本文作為參考。
實施例11.1產生重組人凝血酶原表達載體的構建編碼人凝血酶原的全部1869個鹼基對的序列加上5′非翻譯區12個鹼基對序列以及3′端非翻譯區的97個鹼基序列是從一個人凝血酶原cDNA克隆BS(KS)-hFII(從Ross T.A.MacGillivray，Dept.of Biochemisty，Univ of British Columbia，Vancouver Canada得到)的SmaI到XbaI片段上分離出來的。這一片段被克隆到真核表達載體pRc/CMV中(Invitrogen Corp，San Diego，CA)。pRc/CMV用HindIII酶切，3′凹陷末端用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段補平。此載體用Xba1進一步酶切，並與編碼凝血酶原序列的SmaI到XbaI片段連接。得到的重組子pRc/CMV-hPT含有編碼凝血酶原的序列，側翼連有在哺乳類細胞中高效轉錄所需要的序列人巨細胞病毒立即早期基因啟動子和轉錄終止子序列及牛生長激素基因的多腺苷化信號。這個克隆還含有提供氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因和為在大腸桿菌中繁殖、保存的ColE1複製起點。還有絲狀噬菌體的複製起點f1，以使用缺陷輔助噬菌體M13KO7感染的大腸桿菌中產生單鏈DNA(Vieira和Messing，1987)。這種載體可用於在暫時性轉染的哺乳動物細胞中表達人凝血酶原，然而，具有新黴素磷酸轉移酶基因意味著能大規模表達的持久性轉染細胞系可通過對抗生素G418有抗性而篩選出來。
1.2鑑定凝血酶表面上功能性殘基的誘變策略我們設計的誘變策略是系統性地對人α-凝血酶表面進行掃描以鑑定對纖維蛋白原凝集作用、依賴於血栓調節素的蛋白C激活作用、由肝素/抗凝血酶III引起的凝集抑制作用以及凝血酶aptamer起重要作用的殘基。設計這種策略以便有最大的機會鑑定功能性殘基，而對蛋白構型非特異性破壞機會最小。帶電荷和有極性(R、K、D、E、H、S、T、Q、N、Y、W)胺基酸對於突變特別有意義，因為這些殘基能參與形成氫鍵和靜電作用，看來這些對結合帶電的配體是非常重要的。第二，只有α-凝血酶表面上與溶劑高度接觸的帶電荷和極性殘基被選來進行突變。溶劑易接近的殘基作為靶位，因為這些殘基都可用於與配體相作用，對序列變異更有耐受性(Bowie等，1990)。對人α-凝血酶與抑制劑水蛭素複合物(Rydel等，1990)的2.3晶體結構中每個凝血酶殘基，測定了對半徑1.4溶劑探針的分部易接近度(Rose等1985)，選出了70個分部易接近度大於35％的帶電荷極性殘基用於突變。只有1個殘基R36a除外。R36a是位於α-凝血酶A鏈和B鏈之間連接處，是加工凝血酶原為成熟的雙鏈α-凝血酶所必需的。然而，對此要增加幾個殘基，包括位於推測的纖維蛋白原外側結合位點(exosite)上的5個殘基(R20.K65、H66、R68、K77)和2個在推定的肝素結合位點上的殘基(R98、W249)。即總共76個殘基通過寡核苷酸定向誘變用丙氨酸代替。丙氨酸被用於所有的取代，因為丙氨酸與α-及β-二級結構是相容的(Klap-per，1977)，在蛋白深埋的和外露的位點都可被接受(Klapper，1977；Rose等，1985)，而且它的側鏈無極性而且小，保證了用丙氨酸取代而破壞蛋白質α構型的可能性小。當有2個或3個作為靶位點的殘基串連在一起時，同時可進行多重取代。如果這種多重突變顯示出有功能性遺傳表型，那麼再單獨進行單個殘基取代。丙氨酸替代的突變體全部列在表1中。人α-凝血酶中殘基的編號系統就是以前所用的系統(Wu等，1991)，其中B鏈的殘基是連續編號的(1-259)。A鏈的殘基也是連續編號的(1a-36a)，但用小寫a作下標，表明為A鏈殘基。
1.3用寡核苷酸指導的誘變構建人凝血酶原中丙氨酸的取代在單鏈DNA模板上，通過寡核苷酸指導的誘變把丙氨酸取代引進人凝血酶原基因中(Zoller和Smith，1982)。含尿密啶的單鏈DNA模板由大腸桿菌dut—ung—株產生(CJ236)(Kunkel，等，1987)，延伸和連接誘變寡苷酸引物後，能夠在大腸桿菌ung+株中針對非突變模板鏈進行篩選。編碼丙氨酸取代物的合成寡核苷酸引物，側翼拼接12個同凝血酶原編碼鏈互補的核苷酸，在AppliedBiosystems Inc.固相合成儀上用磷酸醯胺(phosphoamidite)化學法合成。磷酸化引物與pRc/CMV-hPT模板雜交，用T7 DNA聚合酶延伸，並用T4 DNA連接酶連接到新合成的鏈上。把這異源雙鏈DNA用於轉化dut+ung+大腸桿菌菌株XL1-Blue，針對含尿嘧啶的親代鏈篩選。用雙脫氧末端終止法和測序酶2.0(United StatesBiochemical)對單個轉化子進行單鏈DNA測序，以證實每個突變的一致性。對每個pRc/CMV-hPT突變體，取500ml XL1-Blue培養物，提取其質粒DNA，用於轉染培養的COS-7細胞。用QIA-GEN Maxi質粒製備藥盒分離出大約1mg的閉合環狀質粒DNA。以相同的方法，用適宜的模板製備編碼本發明所述其他NP的DNA。
實施例22.1重組凝血酶原在暫時表達試驗中的表達和激活把含有未修飾的凝血酶原cDNA(對野生型凝血酶)、在S205A位突變的凝血酶(作為陰性對照)和各種突變體的各種重組凝血酶原重組子(10～20μg)，用DEAE-葡聚糖轉染法(Adams和Rose，1985)，分別轉進到106個生長在35mm孔中的COS-7細胞中。轉染後2天，用PBS洗單層細胞兩次，向單層細胞加入1ml無血清DME培養液，37℃培養24小時(當37℃培養表達測不出或表達較差時偶爾在30℃以下培養可能有利，特別是27℃，即Mt11、12、13、34、35、14.5、和37c)。然後收集這種條件培養液，離心去掉任何細胞碎片，並用Centricon-30通過超濾濃縮20倍。50μl這種濃縮的培養液用1.5μg Echis Carinatus蛇毒在37℃激活45分鐘。把25μl蛇毒激活前後的條件培養液用抗人凝血酶多克隆或單克隆抗體，通過Western印跡進行分析。凝血酶表達水平為每106細胞有0.12到2.0μg凝血酶不等，這是根據Western分析和醯胺分解檢測估算。
2.1在條件細胞培養液中培養的重組凝血酶原用Slot Blot法定量。
用Schleicher和Schuell MinifoldII真空Slot-bolt裝置，通過定量Western印跡方法檢測凝血酶蛋白濃度。按上述方法激活濃縮20倍條件培養液中的凝血酶原和純化的凝血酶原標準品(AmericanDiagnostica)。樣本和標準品都用PBS稀釋，並把它調整到與模擬轉染細胞條件培養液有相同濃度。把含有大約50ng激活凝血酶原的雙份100μl和雙份純化的激活凝血酶原標準品(1-200ng)通過Slot-blot裝置上的0.45μm硝酸纖維素濾膜抽乾。對每個Slot都用200μl PBS洗2次。濾膜用PBS洗2次，並用PBS配製的5％無脂脫脂奶(Carnation)封閉。膜上的印跡與用5％脫脂奶配製的11μg/ml的免抗人凝血酶原多克隆免疫球蛋白(Dako)一起孵育。用含有0.05％Tween-20的PBS洗滌印跡並與1μCi/mlS-標記的驢抗兔免疫球蛋白F(ab′)2(Amershan)片段一起孵育。用含0.05％Tween-20的PBS洗滌印跡，用Ambis 4000放射分析影像檢測儀掃描測出每個印跡的放射活性。每份樣本中凝血酶的濃度由標準曲線測出，這個標準曲線在1-200ng凝血酶原範圍內為線性。
2.2醯胺分解試驗按以前所述方法進行凝血酶顯色底物S-2238的水解(Wu等，1991)。用血漿凝血酶構建標準曲線，其中1μg凝血酶水解速度為300μl 100μM的S—2238中1220.5mOD/分鐘。為了測定水解300μl 100μMS—2238的速度，使用了20μl1/3稀釋的蛇毒激活的條件培養液。
2.3.纖維蛋白原凝集作用在纖維蛋白原凝集試驗中使用在實施例2.2醯胺分解試驗中產生335mOD/分鐘水解速度的蛇毒激活條件培養基的量(相當於0.27μg血漿凝血酶)。反應混合物含有20μl條件培養基和182μl含20mM Tris-醋酸pH7.5、140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2的選擇緩衝液。通過加入50μl由10mg/ml的無鈣離子PBS儲存母液用選擇緩衝液新配製的2mg/ml的人纖維蛋白原來起始反應。用纖維蛋白儀(fibrometer)測量從加入纖維蛋白原到出現血凝塊的時間(秒數)。用血漿凝血酶標準凝集曲線將凝集時間轉換為相當於每ml多少mg血漿凝血酶。結果以野生型活性的百分比表示。
2.4蛋白C激活作用按以前介結的方法(Tsiang等，1990)從以504±34fmol/106細胞水平表達重組人血栓調節素的TMnc細胞製備細胞裂解液(Tsiang等1992)。把大約8×106細裂解在800μl中，得到裂解液中血栓調節素濃度為～5nM。對照裂解物由未轉染的親代CV—1細胞系(不表達TM)以類似方法製備。市場上購得的人血漿蛋白C，每pmole含有～0.005-0.02pmoles的汙染凝血酶原。為了克服這個問題，先把444pmoles的蛋白C用10μg Echis Carina-tus蛇毒在37℃處理30分鐘，使汙染的凝血酶原轉化為凝血酶，然後再用凝血酶抑制劑PPACK(D-Phe-Pro-Arg-氯甲基酮)滴定滅活它。這種蛇毒處理過的、PPACK滴定過的蛋白C再用於蛋白C激活試驗中(Tsiang等，1990)。試驗混合液含有相當於S-2238醯胺分解活性標準量(8.5mOD/分鐘)蛇毒激活的條件培養液，20μlTMnc細胞裂解液和887nM的蛋白C，總體積為50μl。將這種混合液37℃孵育1小時，加入抗凝血酶III和肝素終止反應。對於血栓調節素非依賴性蛋白C激活作用，在試驗混合液中省略TMnc裂解液，並用5mMNa2EDTA代替2mMCaCl2。得到的活化蛋白C用對產色底物S-2366的水解來來測定。表1a中粗線條表示按實施例2.3中有同方法作了修正。蛋白C激活活性以野生型活性的百分比表示。
2.5.肝素依賴性抗凝血酶III對凝集的抑制作用每個試驗中使用相當於水解S-2238底物每分鐘產生370mOD的蛇毒激活培養液。樣本體積用模擬轉染20倍濃縮的培養液調整到15μl，與135μl的選擇緩中液混合併在37℃預熱。在同時把50μ12mg/ml纖維蛋白原和50μl650nM AT-III(帶0.1U/ml肝素或不帶0.1U/ml肝素的)加到樣本混合液後，立即測定凝集時間。AT-III抑制凝集對肝素的敏感性以有肝素存在時殘留的凝集活性與無肝素對照的百分比表示。
實施例33.1重組凝血酶的穩定表達把實施例1中的線性化重組凝血酶原重組子(10μg)用磷酸鈣轉染法，轉入到BHK-21細胞裡(Graham和Van del Eb.，1973；Park-er和Stark，1979)。在含有G418抗生素的培養液中挑選克隆，用醯胺分解活性和Western印跡來檢測表達水平。
3.2用於蛋白純化的條件培養基的製備把每個表達重組凝血酶原的理想克隆接種到850cm2的滾筒發酵瓶中，在含有10％FCS的完全DMEM中培養(每瓶200ml5×106細胞)。2天後，細胞達到融合成片後，加入微載體珠(Cytodex 2)(Pharmacia LKB，Piscatawasy，NJ)以包被細胞單層。3天後，小珠被長在它上面的細胞蓋住後，細胞用PBS洗滌，再把無血清的含有5μg/ml胰島素、5μg/ml轉鐵蛋白、5μg/ml脂球蛋白和10μg/ml維他命K的DMEM加入到細胞上使其分泌凝血酶原。3天以後集條件培養基，之後6天收集一次。
另外一種方法是不用微載體小珠擴展生長表面積，即把每個理想的BHK-21克隆接種到1700cm2的擴大表面積滾筒發磷瓶中，以上述相同培養基培養(每瓶200ml，5×106細胞)。4天後，細胞達到融合後，用PBS洗細胞2次(不是3次)，把同樣無血清培養基(150ml)加入到細胞上使其表達凝血酶原。收集條件培養夜3次，4天後一次(150ml)，8天後第2次(150ml)，11天後第3次(100ml)。用布氏漏鬥讓條件培養液濾過Whatwan N°1濾低，以除去細胞碎片，和第一種方法中的小珠。
3.3培養液濃縮和透析用切線流過濾系統(Pellicon，Millipore，Bedlford，MA)對含有凝血酶原的無血清條件培養夜進行濃縮。按廠家說明書來預平衡切線流濾器(PLGC型，5平分英尺，MWCO.10000)的低分子量蛋白結合纖維素濾膜。濃縮期間，進樣一側加壓20-25psi，收樣側壓力用3～4psi。滲透流速為150～200ml/分鐘。當培養液(收集的樣品)濃縮到500～600ml時，用同樣濾器讓它對1000～1200ml透析緩衝液(0.1M磷酸鉀，PH7.5)透析7—8次。簡而言之，就是在這一過濾系統中把透析緩衝液以循環混合液形式輕輕混合，約2～3分鐘內加入到濃縮培養液中(滲出)。然後把混合液濃縮到500～600ml。重複上述透析7—8次後，用透析緩衝液取代99.9％以上的培養液。
3.4凝血酶原的純化把最終的透析液(600～800ml)通過一個無菌的一次性0.45μm濾膜(Nalgene，Rochester，NY)，並上樣到一個2.6×7cm的DEAE—葡聚糖快速流陰離子交換層析柱上(Pharmacia，Piscataway，NJ)。用0.1～0.7M磷酸鉀梯度在0.35～0.45M之間洗脫出凝血酶原峰。再用可溶性Echis carinatus蛇毒(Sigma St.Louis，MO)活化後的醯胺分解測定及SDS—PAGE電泳兩種方法來測定含有凝血酶原的部分。合併有活性的部分，並對0.02M HEPES、0.1M NaCl、PH8.0於4℃透析過夜。透析後的混合凝血酶原部分，通過一個PM30濾膜、用一個搖動池(Amicon，Beverly，MA)濃縮到10—15ml。
3.5NP的純化濃縮物中的凝血酶原NP通過Echis carinatus蛇毒加工成NP，蛇毒預先吸附在Amberlite CG50上(ICN Biomedicals，Irvine，CA)並任意固定到Affi-Gel10小珠上(Bio Rad，Richmond，CA)。蛇毒活化凝血酶原NP是在37℃輕輕旋轉50分鐘來進行的。通過離心再通過0.45μm濾膜過濾來去除蛇毒結合的小珠。濾液立即上樣到2.6×7cm的Amberlite CG50(200-400目)陽離子交換柱上。用0.1～1.0M NaCl梯度在0.4M洗出NP單一峰。根據醯胺分解活性和SDS—PAGE電泳(染色膠和Westernblot)結果，把含有NP的流份合併。然後再用一個帶有PM30膜的攪拌池把合併的NP流份濃縮到8～10ml，並對0.1M NaCl，0.02M HEPES，PH8.0透析。對純化的NP進行醯胺分解活性、血漿凝固時間、蛋白C激活作用和血小板聚集作用方面的鑑定。也測定了它的純度和特異活性。最後NP製品用滅菌的聚丙烯試管0.5ml一份保存在-80℃。
3.6NP在體內的抗凝作用試驗的配製品詳細說明如下配製品 項目 說明A對照 無菌等滲鹽水，USP.B試驗 含有大約0.25mg/ml凝血酶的野生型人凝血酶無菌等滲水溶液(Hematologic Technologies人凝血酶，來自人血漿，凝血酶原酶活化)C對照 用NP試驗中相同的方法以Echis蛇毒激活的重組參考序列凝血酶原(圖2A)D試驗 含有約0.25mg/ml NP的重組NP K 52A的無菌等滲水溶液(圖2B)E對照 兔腦促凝血酶原激酶無菌等滲溶液(含組織因子)每種配製品通過插入中央靜脈的插管從靜脈按每小時大約13ml流速輸入紐西蘭大白兔中(對野生型為每分鐘每公斤體重14.3U，對K52A是11.7U)。因為試驗的配方中可能有潛在的血栓形成能力，所以考慮從外周靜脈輸入(如耳緣靜脈)可能全引起局部血栓形成和由於試驗物局部高濃度而造成的局部缺血。通過接近中央循環(如通過頸靜脈的SVC)這種併發症就可由於輸入的化合物在血管內快速流走並迅速分布而降列最低限度。這種方法以前在狒狒中以人凝血酶應用過(J.Clin.Invest.，922003—12，1993)。
通過耳緣靜脈作為給藥途經輸入配製品已顯示是安全有效的。
結果顯示在圖2A、2B和圖3中。每個圖都代表一隻兔子的結果。圖2A顯示，野生型凝血酶引起顯著的纖維蛋白原消耗和過量的抗凝活性。相反，圖2B證實，K52A PCA具有正常範圍內抗凝活性(圖中陰影部分)，並在保持活性方面具有臨床價值，而且不引起纖維蛋白原消耗。圖3描繪了消除半衰期和可逆性。
3.7在無或有TM的情況下PCA對蛋白C的激活作用蛋白C激活試驗在實施例2.4中有述。不同於同於實施例2.4的是不需要用蛇毒和PPACK預先處理蛋白C母液，因為在純化的重組凝血酶中無蛇毒所要激活的蛋白C母液中汙染的凝血酶原。凝血酶、血栓調節素和蛋白C都按圖6中指明的濃度使用。反應物在37℃孵育1小時，用生色底物S—2366來檢測aPC活性。這一試驗證實PCA K32A和E229A仍依賴血栓調節素。
實施例4在食蟹猴中(Cynomolgus monkeys)用蛋白C激活劑2(PCA2)(E229A)和K52A PCA證實可逆的抗凝作用按實施例3.4和3.5中描述的方法製備PCA2，用無菌等滲水溶液配製，總體積為10ml。按每小時60ml的速度，把10ml PCA2溶液從外周靜脈輸入到成年雄性食蟹猴靜脈內，連續輸注10分鐘。用輸液泵控制輸注速度。輸注兩個濃度(1)1.5μg/公斤體重/分鐘(2U/公斤體重/分鐘)(2)4.5μl/公斤體重/公鍾(6U/公斤體重/分鐘)。(1U如上文所定義)。
在下列時間針刺外周靜脈採集血液標本輸注開始時立即採血(t＝0)，輸注開始後在間隔t＝5，10，20，30，45，60，90，120，150分鐘時採血。血標本體積約2ml，收集在構橡酸鹽中。10分鐘內從全血中得到血漿。在纖維蛋白測定儀中通過測量aPTT來監視抗凝作用。用纖維蛋白原缺乏血漿從凝集試驗中來確定纖維蛋白原水平。
圖4表示用2個劑量的PCA2輸注各個猴子的結果。兩個劑量都導致凝固時間延長超出預期的治療範圍(陰影部分)，而沒有消耗纖維蛋白原，表明PCA2在體內缺乏可測出的促凝活性。這種作用是可逆的，輸注結束後大約170分鐘aPTT達到正常。這種作用的可逆性啟示輸注期間不消耗凝集因子。另外表明PCA2在體內無可測出的促凝活性。逆轉作用的動力學分析啟示消除半衰期為大約50分鐘。相信持續這麼長時間在臨床上是有好處的。
在另一研究中，按每公斤體重每分鐘輸注2U的K52A PCA，按上述方法準備並輸注10分鐘，並與上述實施例中2U/kg/分鐘E229APCA輸注進行比較。結果表示在圖5中。雖然按2U/kg/分鐘輸注K52A PCA的纖維蛋白原水平沒有變化，K52A PCA是在基本相同的條件下輸注的，但按12U/kg/分鐘輸注導致aPTT大於10倍對照，纖維蛋白原降到小於10％。12U/kg/分鐘對猴子來說是過量了，儘管這種量對兔子是能耐受的(見上文)。即在猴子中的劑量一般要低於在兔子中的劑量。
表2
這些數據證實保留了血小板功能，且出血時間未變，這與用gp/IIb/IIIa抑制因子或凝血酶抑制因子所作試驗的結果不同。
實施例55.1單獨B-鏈NP的表達和應用鑑於我們的觀察結果，凝血酶A鏈中的取代對S-2238的水解FC或PA幾乎沒有什麼影響，單獨用PCA B-鏈作為抗凝劑或單獨用FCP B-鏈作促凝劑都將是有好處的。FCP或PCA B-鏈是通過還原連接的二硫鍵並重新捲曲從兩個母鏈得到(Hageman等，Arch.Biochem.Biophys.171327-336)。但是，優選的B-鏈是通過單獨表達編碼NP B-鏈核酸而得到的。B-鏈PCA或FCA的表達載體是由構建表達凝血酶原、前凝血酶1、前凝血酶2(單鏈α-凝血酶)的載體衍化而來的，是通過把編碼凝血酶B鏈氨菌末端殘基(I1)和信號肽羧基末端密碼子之間的間隔序列缺失而構建出來的。用寡核苷酸指導的誘變達到缺失，其中使用化學合成的寡核苷酸，這種核苷酸作為單鏈DNA模板上的引物編碼這種缺失，正如上文所述構建丙氨酸取代NP的情形。任選誘變C44密碼子編碼A或S。
5.2.在大腸桿菌中，前凝血酶1和前凝血酶2以GST融合蛋白形式表達。
前凝血酶-1(氨基末端殘基為S156，Degen等的殘基編號系統)和前凝血酶-2(氨基未端殘基為T272，Degen等的殘基編號系統)在大腸桿菌細胞漿中以與穀胱甘肽S-轉移酶(GST)可溶性融合蛋白形式表達。所用的表達載體是pGEX-5X-1(PharmaciaLKB Biotechnology)，它含有在大腸桿菌中繁殖所需的pBR322複製起點，編碼抗氨苄青黴素的β-內醯胺酶基因以便保持這一質粒的存在，以及編碼Lac阻遏物蛋白LacIq基因以阻抑融合蛋白的基礎表達。表達是通過tac啟動子啟動的，它可被IPTG誘導，靠近核糖體結合位點和GST基因的翻譯起始密碼子。在編碼GST 221個胺基酸序列後面是一個編碼Xa因子或Echis carinatus蛇毒的酶切位點的序列(IEGR)(用它可以從融合蛋白中酶切出GST部分)，以及含有多個單一限制酶位點可把要融合到GST編碼序列上的編碼序列插入的多接頭序列。
對於前凝血酶-1，設計PCR引物以擴增從編碼前凝血酶-1S156(Degen等的編號系統)到凝血酶B-鏈的羧基端的核苷酸序列。修飾這個編碼前凝血酶-1序列的5′端，加入一個編碼6個連續組氨酸殘基的序列，可被用作在Ni2+螯合基質中純化融合蛋白的親和標記；和加入一個編碼EcoRl限制性內切酶位點的序列。3′端引物是在終止密碼子3′上插入一個編碼XhoI限制性內切酶位點的序列加以修飾。對於前凝血酶-2，使用相同的PCR3′引物，而設計5′PCR引物以將起始於T272殘基(Degen等的殘基編號系統)的前凝血酶-2序列與6個組氨酸親和標記和EcoR1限制性內切酶位點上融合。以凝血酶原cDNA克隆，BS(KS)-hFII作模板用PCR引物擴增已修飾過的編碼前凝血酶-1和前凝血酶-2的序列。把擴增的片段克隆到pGEX-5X-1的EcoR1和XhoI位點上，GST編碼序列讀框內。用所得到的重組子轉化大腸桿菌JM105株(ATCC47016)。
把含有GST-前凝血酶-1和GST-前凝血酶-2的JM105菌穩定期培養物，於37℃在25ml含有200μg/ml氨苄青黴素的Luria-Bertani培養基(LB)中。250rpm振蕩培養過夜。200ml培養液按種4ml穩定期培養物於37°下250rpm振蕩培養直到細胞達到對數期生長(O.D600nm＝0.6～1.2)。培養溫度降到17℃，1小時後加入IPTG使終濃度達到1mM，繼續培養24小時。5000g離心收集細菌細胞，用50mM TrisCl，150mM NaCl，PH7.5洗滌，把細胞懸浮到20ml 50mM TirsCl，150μM NaCl，pH7.5緩衝液中，通過超聲3-4(50％duty cycle)分鐘破碎細胞，加入Triton X-100至終濃度為1％。提取物在4℃80rpm混勻60分鐘。通過10000g離心去除不溶性物質。GST-前凝血酶-1和GST-前凝血酶-2以可溶成分表達出來，通過抗人α-凝血酶的單抗(EXT-1)Western印跡法檢測，測得每毫升培養液中含5mg。GST-前凝血酶-1和GST-前凝血酶-2融合蛋白通過與30μg/ml的Echis carinatus蛇毒在50mM TrisCl，150mMNaCl，pH7.5中37℃培養30分鐘或更長些時間加工成成熟α-凝血酶。融合蛋白加工成與人α凝血酶的A和B鏈大小相同的片段，通過在還原條件下SDS-PAGE電泳後的Western印跡法觀測到。加工後，把200ng加工過GST-前凝血酶-1或GST-前凝血酶-2融合蛋白與100μM S-2238在50mMTrisCl、150mM NaCl，pH7.5中於37℃孵育10分鐘來檢試對凝血酶特異性生色多肽底物(S-2238)的醯胺分解活性。醯胺分解活性只有在用Echis carinatus蛇毒處現後的樣品中測到。
在穀胱甘肽一葡聚糖4B(Pharmacia)柱上用親和層析方法純化GST-前凝血酶-1和GST-前凝血酶-2融合蛋白。把菌體提取物上樣到一個1ml的穀胱甘肽-葡聚糖4B柱上，封閉柱子，並混勻40分鐘。柱子流幹後用50mM TrisCl，150mM NaCl，pH7.5加1％Triton X-100洗滌，用50mM TrisCl，150mM NaCl，pH7.5洗滌，再用1ml等份含10mM穀胱甘肽的緩衝液洗脫。用10mM穀胱甘肽洗脫下來的GST-前凝血酶-1和GST-前凝血酶-2融合蛋白，用SDS-PAGE電泳、考馬斯亮蘭染色測定，純度為約50％。
按本例中前凝血酶-1或前凝血酶2相同方法製備本發明的NP，並按本發明介紹的方法加工成成熟的有活性的NP，只是在JM105菌株中表達前誘變構建物以向這一表達載體中引入所需的序列變化。
實施例6PCA2(E229A)和野生型凝血酶的血小板凝集作用。
雖然已經證明PCA2在纖維蛋白原凝集過程中無效，但凝血酶另外一個重要的促凝功能是刺激血小板凝集，這是對血小板表面上跨膜受體的酶切結果。為了證實PCA2在凝血酶這一促凝功能中也是缺乏的，對不同濃度的PCA2和野生型凝血酶進行了血小板凝集作用的比較試驗。
用Chrono-Log雙道凝集測量儀(model 560-VS、Chrono-Log Corp.Havertown PA)，以富含血小板的構橡酸化人血漿(PRP)進行野生型和PCA-2凝血酶的血小板凝集比較試驗。在無菌Va-cutainner試管(Becton Dickenson，Rutherford，NJ)中收集人新鮮全血(4.5ml)，此試管裡含有0.5ml129mM構橡酸鈉。通過離心從構橡酸化血液中分離出PRP。根據廠家儀器說明操作凝集測量儀。把重組人α-凝血酶加到預溫(37℃2分鐘)的PRP中，終濃度對於野生型凝血酶為0.12nM～0.49nM，對PCA-2為0.74nM-71.89nM。凝血酶加到PRP後刺激血小板凝集作用通過在記錄儀上記錄光傳導5分鐘內的增加來監控。血小板凝集程度用測量加入凝血酶後追蹤1.5分鐘的曲線下面積來定量。血小板凝集的程度(cm2)對凝血酶濃度作圖(圖7)。
從本圖中計算出野生型凝血酶和PCA2刺激血小板凝集作用的EC50(達到最大刺激一半時所需要的濃度)。PCA 2(EC50＝30.8nM)在刺激血小板凝集作用上比野生型凝血的效果(EC50＝3.9nM)差8倍，即PCA2在此促凝活性及纖維蛋白原凝集方面都是缺乏的。
參考文獻Adams，G.A.et al.，Mol.Cell.Biol.5，1442-1448，1985.Bowie J.U.et al.，Science.247，1306-1310，1990.Dreyfus，M.，et al.，N.Eng.J.Med.325，1565-1568，1991.Graham，F.L.，和Vand der Eb，A.，J.Virology.52，456-567，1973.Gruber，A.，et al.，Circulation.82，578-585，1991.Gruber，A.，et al.，Circulation.84，2454-2462，1991a.Hirsh，J.，N.Eng.J.Med.324，1865-1875，1991.Hirsh，J.，N.Eng.J.Med.324，1565-1574，1991a.Klapper，M.H.，Biochem.Biophys.Res.Comn.78，1018-1024，1977Kunkel T.A.et al.，Meth.Enzymol.154，367-382，1987.LaVallie，E.R.，et al.，Biotechnology，11，187-193，1993.Maggi，A.，et al.，Haemostasis.17，329-335，1987.Parker，B.A.和Stark，G.R.，J.Virol.31，360-369，1979.Rescador，R.，et al.，Thrombosis Res.53，197-201，1989.Rose G.D.et al.，Science.229，834-838，1985.Rydel T.J.et al.，Science.249，277-280，1990.Smith，D.B.et al.，Gene，67，31-40，1988.Stader，J.A.et al.，Meth.Enzymol.185，166-187，1990.Studier，F.W.et al.，Meth.Enzymol.185，60-89，1990.Tabor，S.和Richardson，C.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84，4767-4771，1987.Taylor et al.，J.Clin.Invest.79，918-925，1987.Tsiang，M.，et al.，Biochemistry 29，10602-10612，1990.Tsiang，M.，Lentz，S.R.，和Sadler，J.E.J.Biol.Chem.267，6164-6170，1992.Vieira，J.和Messing，J.，Meth.Enzymol.153，3-11，1987.Wells，J.A.Biochemistry，29，8509-8517，1990.Wu，Q.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，6775-6879，1991.Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Res.10，6487-6493，1982.
序列表(1)一般信息(i)申請人GILEAD SCIENCES，INC(ii)發明名稱新型多肽和凝血治療(iii)序列數2(iv)通信地址(A)收信人GILEAD SCIENCES，INC.
(B)街道353 IAKESIDE DRIVE(C)城市FOSTER CITY(D)州CALIFORNIA(E)國家美國(F)ZIP94404(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC—DOS/MS—DOS(D)軟體PatenIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申請資料(A)申請號PCT/US94/13104(B)申請日14—NOV—1994(C)分類(vii)優先申請資料(A)申請號US08/338 368(B)申請日14—NOV—1994(viii)律師/代理人信息(A)姓名HENSLEY，MAX D(B)登記號27043(C)卷號190.2F(ix)通迅資料(A)電話415—574—3000(B)傳真415—578—9264(C)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度885鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..885(xi)序列描述SEQ ID NO1ACC TTT GGC TCG GGA GAG GCA GAC TGT GGG CTG CGA CCT CTG TTC GAG48Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu1 5 10 15AAG AAG TCG CTG GAG GAC AAA ACC GAA AGA GAG CTC CTG GAA TCC TAC96Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr20 25 30ATC GAC GGG CGC ATT GTG GAG GGC TCG GAT GCA GAG ATC GGC ATG TCA 144Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser35 40 45CCT TGG CAG GTG ATG CTT TTC CGG AAG AGT CCC CAG GAG CTG CTG TGT 192Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys50 55 60GGG GCC AGC CTC ATC AGT GAC CGC TGG GTC CTC ACC GCC GCC CAC TGC 240Gly Ala Set Leu Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys65 70 75 80CTC CTG TAC CCG CCC TGG GAC AAG AAC TTC ACC GAG AAT GAC CTT CTG 288Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu85 90 95GTG CGC ATT GGC AAG CAC TCC CGC ACC AGG TAC GAG CGA AAC ATT GAA 336Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu100 105 110AAG ATA TCC ATG TTG GAA AAG ATC TAC ATC CAC CCC AGG TAC AAC TGG 384Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp115 120 125CGG GAG AAC CTG GAC CGG GAC ATT GCC CTG ATG AAG CTG AAG AAG CCT 432Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro130 135 140GTT GCC TTC AGT GAC TAC ATT CAC CCT GTG TGT CTG CCC GAC AGG GAG 480Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu145 150 155 160ACG GCA GCC AGC TTG CTC CAG GCT GGA TAC AAG GGG CGG GTG ACA GGC 528Thr Ala Ala Set Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly165 170 175TGG GGC AAC CTG AAG GAG ACG TGG ACA GCC AAC GTT GGT AAG GGG CAG 576Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln180 185 190CCC AGT GTC CTG CAG GTG GTG AAC CTG CCC ATT GTG GAG CGG CCG GTC 624Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val195 200 205TGC AAG GAC TCC ACC CGG ATC CGC ATC ACT GAC AAC ATG TTC TGT GCT 672Cys Lys Asp Set Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala210 215 220GGT TAC AAG CCT GAT GAA GGG AAA CGA GGG GAT GCC TGT GAA GGT GAC 720Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp225 230 235 240AGT GGG GGA CCC TTT GTC ATG AAG AGC CCC TTT AAC AAC CGC TGG TAT 768Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr245 250 255CAA ATG GGC ATC GTC TCA TGG GGT GAA GGC TGT GAC CGG GAT GGG AAA 816Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys260 265 270TAT GGC TTC TAC ACA CAT GTG TTC CGC CTG AAG AAG TGG ATA CAG AAG 864Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys275 280 285GTC ATT GAT CAG TTT GGA GAG 885Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu290 295(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度295個胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu1 5 10 15Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Set Tyr20 25 30Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser35 40 45Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys50 55 60Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys65 70 75 80Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu85 90 95Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu100 105 110Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp115 120 125Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro130 135 140Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu145 150 155 160Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly165 170 175Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln180 185 190Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val195 200 205Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala210 215 220Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp225 230 235 240Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr245 250 255Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys260 265 270Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys275 280 285Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu290 29權利要求
1.一種蛋白水解活性的新型多肽(NP)，其與參考序列凝血酶具有至少約80％的胺基酸序列同源性，同時其蛋白C激活活性與纖維蛋白原凝集活性的比值小於參考序列凝血酶的約0.5倍，或大於其約2倍，但條件是該新多肽不是天然的凝血酶、凝血酶K52E、凝血酶R70E、凝血酶R68E、凝血酶K154A、凝血酶K252E、凝血酶K174E、凝血酶R180E、凝血酶D99A、凝血酶D99N、凝血酶E202Q、凝血酶E25K、凝血酶R245E、凝血酶S205A，R197E，D119E、凝血酶N151D，K154E、凝血酶desP48P49W50、凝血酶desE146T147W148、在凝血酶激活位點至少有一個胺基酸殘基已被取代或缺失的凝血酶、或F19—E25環被來自組織纖維蛋白溶酶原激活因子相當的環所替代的凝血酶。
2.一種分離的蛋白水解活性的NP，其與參考序列凝血酶具有至少約80％的胺基酸序列同源性，同時其蛋白C激活活性與纖維蛋白原凝集活性的比值小於參考序列凝血酶的約0.5倍，或大於其約2倍，但條件是該新型多肽不是凝血酶K52E、凝血酶R70E、凝血酶R68E、凝血酶K154A、凝血酶K252E、凝血酶K174E、凝血酶R180E、凝血酶D99A、凝血酶D99N、凝血酶E202Q、凝血酶E25K、凝血酶R245E、凝血酶S205A，R197E，D199E、凝血酶N151D，K154E、凝血酶desP48P49QW50、凝血酶desE146T147W148、在凝血酶氨基激活位點至少有一個胺基酸殘基已被取代或缺失的凝血酶、或F19—E25環被來自組織纖維蛋白溶酶原激活因子相當的環所替代的凝血酶。
3.權利要求1的NP，其中NP選自一個或多個殘基W50、K52、D58、K65、H66、Y71、N74、K106、K107、S176、T177、W227、D193、K196、E202、E229、R233、D232、D234、K236、Y237或F239被取代、缺失或緊靠其位點插入另一殘基的凝血酶。
4.權利要求3的NP，其中W50被缺失或者用選自下組的另一胺基酸殘基取代或緊靠其位點插入G、A、V、I、L、S、T、D、N、E、Q、C、K、M、F、Y、P、R和H。
5.權利要求3的NP，其中K52、K65、K106、K107或K196被缺失或者用選自下組的另一殘基取代它或緊鄰其位點插入G、A、V、I、L、S、T、D、N、E、Q、C、M、F、Y、P、W、R和H。
6.權利要求3的NP，其中D58、D193或D234被缺失或者用選自下組的另一殘基取代或緊臨其位點插入G、A、V、I、L、S、T、N、E、Q、C、K、M、F、Y、P、W、R和H。
7.權利要求3的NP，其中W50和K52、E229和W50、R233和W50、R233和K52、或R233和E229殘基被取代或缺失。
8.權利要求3的NP，其中H66被缺失或者用選自下組的另一殘基取代或緊鄰其位點插入G、A、V、I、L、S、T、D、N、E、Q、C、K、M、F、Y、P、W和R。
9.權利要求3的NP，其中Y71被缺失或者用選自下組的另一殘基取代或緊鄰其位點插入G、A、V、I、L、S、T、D、N、E、Q、C、K、M、F、P、W、R和H。
10.權利要求3的NP，其中N74被缺失或者用選自下組的另一殘基取代或緊鄰其位點插入G、A、V、I、L、S、T、D、E、Q、C、K、M、F、Y、P、W、R和H。
11.權利要求3的NP，其中E202或E229被缺失或用選自下組的另一殘基取代或緊鄰其位點插入G、A、V、I、L、S、T、D、N、Q、C、K、M、F、Y、P、W、R和H。
12.權利要求3的NP，其中取代、缺失或插入僅發生在A鏈或B鏈上。
13.權利要求3的NP，其中R233被缺失或被選自下述一組的另一殘基取代或緊鄰其位插入G、A、V、I、L、S、T、D、N、E、Q、C、K、M、F、Y、P、W和H。
14.權利要求3的NP，其中D193，K196和K52殘基被取代或缺失。
15.權利要求3的NP，其中殘基被取代，且用丙氨酸取代。
16.權利要求3的NP，其中2或3個殘基被取代。
17.權利要求3的NP，其含有B鏈而無A鏈。
18.權利要求3的NP，其含有A鏈和B鏈。
19.權利要求1的NP，當在肝素依賴性的AT—III抑制下通過S—2238的水解作用測量時，其殘餘蛋白水解活性大於參考凝血酶的約2倍。
20.權利要求3的NP，其中肝素結合位點殘基被取代。
21.權利要求20的NP，其中殘基為R89、R180、R245、K248或K252。
22.權利要求3的NP，其中K52A，R233A NP、E229D NP、E229F NP、E229S NP、E229W NP、E229Y NP、R233N NP、R233DNP、R233F NP、W50C NP、K52C NP、W50E NP或W50K NP。
23.權利要求1的NP，其中凝血酶的K21、Q24、R70、R98或K77殘基被取代，一個或多個這樣的殘基被被缺失或者緊鄰著一個或多個這樣的殘基插入另一個殘基。
24.權利要求3的NP，其中殘基為E229或R233。
25.權利要求1的NP，其中殘基在E229或R233的Ca的約10之內。
26.編碼權利要求1的NP的核酸。
27.一種含有權利要求26的核酸的可複製的載體。
28.一種含有權利要求27的載體的重組細胞。
29.一種包括培養權利要求28的細胞和從細胞培養物中收集NP的方法。
30.權利要求29的方法，其中NP在細胞培養中以可溶性多肽形式表達。
31.權利要求29的方法，其中NP在細胞培養中以單獨B鏈形式表達。
32.權利要求29的方法，其中編碼A和B鏈序列的核酸各自獨立地與編碼信號序列的核酸連接，而且它們在同一宿主細胞中共同表達。
33.一種治療血栓形成疾病或狀況的方法，包含給予治療有效量的蛋白水解活性NP，該NP與參考序列凝血酶至少有約80％的胺基酸序列同源性，其蛋白C激活活性與纖維蛋白凝集活性的比值大於參考序列凝血酶的約2倍。
34.權利要求33的方法，其中當在肝素依賴性的AT—III抑制存在下通過S—2238的水解作用來測量時，該NP的殘餘蛋白水解活性大於參考序列凝血酶的約2倍。
35.權利要求33的方法，其中血栓形成疾病或狀況為心臟旁路外科。
36.權利要求33的方法，其中NP缺乏可檢測的纖維蛋白原凝集活性。
37.權利要求36的方法，其中NP保留了野生型凝血酶的蛋白C激活活性的至少約5％。
38.權利要求37的方法，其中NP是K52A，R233A NP、E229DNP、E229F NP、E229S NP、E229W NP、E229Y NP、R233D NP、R233N NP、R233F NP、W50C NP、K52C NP、W50E NP或W50KNP。
39.一種與參考序列凝血酶至少具有約80％的胺基酸序列同源性的NP，其中緊鄰下列凝血酶殘基至少有一個胺基酸殘基被取代、缺失或插入R20、K21、S22、Q24、E25、D35、W250、D51、K52、N53、F54、T55、N57、D58、K65、H66、R68、T69、R70、Y71、R73、N74、K77、E82、E83、R89、R93、R94、R98、K106、K107、D113、C119、D122、R123、E124、S128、Q131、K145、E146、T147、W148、T149、N151、K154、S158、E169、K174、D175、S176、T177、R178、I179、R180、D183、D193、K196、D199、A200、C201、E202、N216、N217、W227、G228、E229、G230、C231、D232、R233、D234、G235、K236、Y237、G238、F239、R245、K248、Q251、R245、K248、W249、Q251、K252、D255或Q256，但條件是該NP不是凝血酸K52E、凝血酶R70E、凝血酶R68E、凝血酶K154A、凝血酶K252E、凝血酶K174E、凝血酶R180E、凝血酶D99A、凝血酶D99N、凝血酶E202Q、凝血酶E25K、凝血酶R245E、凝血酶S205A，R197E，D199E、凝血酶N151D，K154E、凝血酶desP48P49 QW50、凝血酶desE146 T147 W148、在凝血酶氨基激活泣點至少有一個胺基酸殘基已被取代或缺失的凝血酶、或F19—E25環被來自組織纖維蛋白溶酶原激活因子的相當環所替代的凝血酶。
全文摘要
提供了具有蛋白C激活能力而無顯著纖維蛋白原凝集活性或與之相反的凝血酶突變體(TS)。相對於纖維蛋白原凝集其蛋白C活化特性提高的TS很有用，尤其作為抗凝劑及用於篩選拮抗或激活該特性的物質，以及在確定病人活性蛋白C介導的抗凝途徑狀態的診斷步驟中。促凝TS可用於實體瘤治療促進凝結，作為繃帶浸漬劑或用於診斷檢測。在重組細胞培養中或用體外方法製備這些TS。
文檔編號C12N9/74GK1139455SQ94194668
公開日1997年1月1日 申請日期1994年11月14日 優先權日1993年11月12日
發明者C.S.吉布斯, L.L.K.陸恩格, M.特西安格 申請人:吉裡德科學公司