一種乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻生長及微藻油脂積累中的應用的製作方法
2023-09-19 18:08:00 1
一種乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻生長及微藻油脂積累中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種在微藻生長的過程中添加神經遞質乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物以提高微藻生物質數量和油脂含量的方法，屬於微藻生物【技術領域】。通過在微藻生長的不同時期，添加不同濃度的神經遞質乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物，分析得到不同濃度和不同時期加入的乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物對小球藻生物質數量和油脂含量的影響。本發明首次提出在微藻的生長過程中添加神經遞質乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物，為使用神經遞質以促進微藻生長和同步積累油脂提供了一條新思路。
【專利說明】一種乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻生長及微藻油脂積累中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於微藻生物【技術領域】，具體涉及一種乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻生長及微藻油脂積累中的應用。
【背景技術】
[0002]微藻種類豐富，可大量培養而不佔用耕地；生長周期短，倍增時間約3-5天，單位面積產量是糧食的幾十倍乃至上百倍；光合作用效率高，能夠有效地利用太陽能，將無機物轉化為蛋白質、多糖、多不飽和脂肪酸等營養成分，可用於食品、醫藥和能源方面；油脂含量高，達乾重的20% _70%，遠高於陸地植物，是一種非常具有前景的生物原料。目前利用培養微藻來積累油脂以生產生物柴油，已成為利用太陽能開發可再生資源最熱門的研究領域，具有強大的市場潛力和非凡的社會價值。
[0003]與高等的油料作物相比，微藻的生物化學成分受培養鹽組成和環境條件改變的影響較大，如氮缺乏容易刺激微藻的油脂尤其是三醯甘油的積累，溫度降低會促進微藻多不飽和脂肪酸的積累等，因此需要深入探索微藻的最優產油培養條件。
[0004]培養鹽組成和環境條件對微藻油脂積累影響的研究較多，而植物激素等活性分子的化學調節影響微藻油脂積累的研究較少，從植物激素對高等植物生長的影響的研究結果中可以看出植物激素對高等植物的生長具有很強的調節作用，因此研究其對微藻生長的影響，對於提高微藻的生物質數量和油脂積累速率具有重要的意義。
[0005]微藻自養系統與異養系統相比生物質積累較低，因此能夠顯著促進生長提高生物質積累的措施對建立具有低成本優勢的微藻自養系統起到重要作用。現有技術中，微藻自養系統中普遍採用兩步法生產油脂，即第一階段的優化條件下達成快速生長以形成生物質以及隨後的脅迫條件下以積累油脂。快速生長下油脂積累少，脅迫條件下生物質積累受抑，綜合起來，最終的油脂產量偏低，降低了微藻自養系統生產油脂的實用價值。因此，發明能使微藻快速生長的同時同步積累油脂的一步法方法對建立低成本的高效的微藻自養系統生產油脂技術起到關鍵作用。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種利用乙醯膽鹼及其類似物促進微藻生長及油脂同步積累的方法。
[0007]為解決以上技術問題，本發明採用如下技術方案:
[0008]乙醯膽鹼及其類似物在同時促進微藻生長及微藻油脂積累中的應用在本發明的保護範圍之內。
[0009]其中，所述的微藻為小球藻、螺旋藻、衣藻、微綠球藻、紅球藻、富油新綠藻、多核綠藻(Deasonia multinucleata)、多形柵藻(Desmodesmus multiformis)、掌網藻(Palmodictyon varium)和葡萄藻中的任意一種。
[0010]其中，在微藻的培養基中添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼的類似物，添加的時間為微藻生長的調整期或對數期。優選在微藻OD68tl值為O~0.5時(調整期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物，最優選在微藻OD68tl值為O時(調整期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物；或者優選在微藻OD68tl值為1.2~1.6時(對數期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物，最優選在微藻OD68tl值為1.5時(對數期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物。
[0011]其中，乙醯膽鹼在微藻生長的調整期的添加量為0.1~5μ g/L，優選為0.5~5 μ g/L,最優選 5 μ g/L。
[0012]其中，乙醯膽鹼在微藻生長的對數期的添加量為0.1~5μ g/L，優選為0.25~5 μ g/L,最優選 5 μ g/L。
[0013]其中，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的調整期的添加量為50~200μ g/L，優選為150 ~200 μ g/L,最優選 200 μ g/L。
[0014]其中，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的對數期的添加量為50~200μ g/L，優選為150 ~200 μ g/L,最優選 200 μ g/L。
[0015]其中，所述的乙醯膽鹼的類似物為膽鹼、氯化膽鹼、氫氧化膽鹼、胞磷膽鹼或磷脂醯膽鹼，優選膽鹼。
[0016]其中，微藻培養溫度為25~30°C，優選30°C ;培養光照強度為2000~40001ux，優選為30001ux。
[0017]乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻油脂積累中的應用在本發明的保護範圍之內。
[0018]其中，所述的微藻為小球藻、螺旋藻、衣藻、微綠球藻、紅球藻、富油新綠藻、多核綠藻、多形柵藻、掌網藻和葡萄藻中的任意一種。
[0019]其中，在微藻的培養基中添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼的類似物，添加的時間為微藻生長的調整期或對數期。優選在微藻OD68tl值為O~0.5時(調整期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物，最優選在微藻OD68tl值為O時(調整期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物；或者優選在微藻OD68tl值為1.2~1.6時(對數期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物，最優選在微藻OD68tl值為1.5時(對數期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物。
[0020]其中，乙醯膽鹼在微藻生長的調整期的添加量為0.1~5μ g/L，優選為0.5~5 μ g/L,最優選 5 μ g/L。
[0021]其中，乙醯膽鹼在微藻生長的對數期的添加量為0.1~5μ g/L，優選為0.25~5 μ g/L,最優選 5 μ g/L。
[0022]其中，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的調整期的添加量為50~200μ g/L，優選為150 ~200 μ g/L,最優選 200 μ g/L。
[0023]其中，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的對數期的添加量為50~200μ g/L，優選為150 ~200 μ g/L,最優選 200 μ g/L。
[0024]其中，所述的乙醯膽鹼類似物為膽鹼、氯化膽鹼、氫氧化膽鹼、胞磷膽鹼或磷脂醯膽鹼，優選膽鹼。
[0025]其中，微藻培養溫度為25~30°C，優選30°C ;培養光照強度為2000~40001ux，優選為30001ux。
[0026]乙醯膽鹼及其類似物促進微藻生長中的應用也在本發明的保護範圍之內。
[0027]其中，所述的微藻為小球藻、螺旋藻、衣藻、微綠球藻、紅球藻、富油新綠藻、多核綠藻、多形柵藻、掌網藻和葡萄藻中的任意一種。
[0028]其中，在微藻的培養基中添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼的類似物，添加的時間為微藻生長的調整期或對數期。優選在微藻OD68tl值為O~0.5時(調整期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物，最優選在微藻OD68tl值為O時(調整期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物；或者優選在微藻OD68tl值為1.2~1.6時(對數期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物，最優選在微藻OD68tl值為1.5時(對數期)添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物。
[0029]其中，乙醯膽鹼在微藻生長的調整期的添加量為0.1~10μ g/L，優選為0.5~10 μ g/L,優選 5 μ g/L。
[0030]其中，乙醯膽鹼在微藻生長的對數期的添加量為0.1~10μ g/L，優選為0.25~10 μ g/L,最優選 10 μ g/L。
[0031]其中，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的調整期的添加量為50~200μ g/L，優選為150 ~200 μ g/L,最優選 200 μ g/L。
[0032]其中，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的對數期的添加量為50~200μ g/L，優選為150 ~200 μ g/L,最優選 200 μ g/L。
[0033]其中，所述的乙醯膽鹼類似物包括膽鹼、氯化膽鹼、氫氧化膽鹼、胞磷膽鹼、磷脂醯膽鹼，優選膽鹼。
[0034]其中，微藻培養溫度為25~30°C，優選30°C ;培養光照強度為2000~40001ux，優選為30001ux。
[0035] 本發明所述的調整期的定義為:當微生物進入到一個新的環境中，由於要適應這個與它原來不同的生境條件，繁殖速度很慢，維持在一個較低的水平；調整期優選微藻OD68tl值為O~0.5範圍內。
[0036]本發明所述的對數期的定義為:微生物適應了新的環境，開始大量快速繁殖，數量快速增長，呈對數或指數曲線形狀，也稱指數期；對數期優選微藻OD68tl值為1.2~1.6範圍內。
[0037]本發明所述的穩定期的定義為:微生物數量增長到了一定的程度，由於養分等的消耗和有害代謝產物的積累使其數量不能再大量增長，增長數大致等於死亡數，處於動態平衡時期；穩定期優選為微藻OD68tl值在2.5~3.0範圍內。
[0038]有益效果:
[0039]本發明具有如下顯著特點和效果:
[0040](I)本發明首次提出在微藻的生長過程中添加乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物，為使用神經遞質乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物以促進微藻生物質和油脂積累提供了一條新思路。
[0041](2)通過補充微量乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物，可以明顯促進了微藻生物質的積累以及油脂的積累。
[0042](3)現有技術中利用微藻生產藻油都要分為生物質積累和脅迫下藻油積累兩個階段，微藻生長緩慢、積累油脂效率低，本發明提出向微藻生長的不同時期添加乙醯膽鹼或者乙醯膽鹼的類似物，添加到培養液中既顯著促進微藻的生長又同步促進微藻高效積累油月旨，實現了用一種分子處理改進了微藻生長和油脂積累的方式及其效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]圖1在微藻生長的調整期，加入不同濃度的乙醯膽鹼，小球藻生物質數量的變化。其中，橫坐標為培養時間，縱坐標為小球藻的生物質數量，用藻細胞在680nm波長下的吸光度來表不，?表不不加入乙醯膽鹼，表不乙醯膽鹼的濃度為0.5 μ g/L, ▲表不乙醯膽鹼的濃度為5 μ g/L, I表示乙醯膽鹼的濃度為10 μ g/L。數據為3次平行取樣的平均值。
[0044]圖2在微藻生長的對數期，即OD68tl = 1.5，加入不同濃度的乙醯膽鹼，小球藻生物質數量的變化。其中，橫坐標為培養時間，縱坐標為小球藻的生物質數量，用藻細胞在680nm波長下的吸光度來表不，表不不加入乙醯膽鹼，表不乙醯膽鹼的濃度為0.5μ g/L, I表示乙醯膽鹼的濃度為5 μ g/L, +表示乙醯膽鹼的濃度為10 μ g/L。數據為3次平行取樣的平均值。
[0045]圖3不同種小球藻添加乙醯膽鹼和未添加乙醯膽鹼乾重比較。在微藻生長的調整期，加入0.5μ g/L的乙醯膽鹼，不同小球藻生物質數量的變化。其中，橫坐標為不同小球藻，依次是C.sorokiniana為小麥根腐小球藻，C.kessleri為凱斯勒小球藻，C.vulgaris為普通小球藻，C.protothecoides為原始小球藻；縱坐標為小球藻的生物質數量變化,數據為3次平行取樣的平均值。
[0046]圖4不同種小球藻添加乙醯膽鹼和未添加乙醯膽鹼油脂積累比較。在微藻生長的調整期，加入0.5 μ g/L的乙醯膽鹼，小球藻中油脂積累的變化。其中，橫坐標為不同小球藻，依次是C.sorokiniana為小麥根腐小球藻，C.kessleri為凱斯勒小球藻，C.vulgaris為普通小球藻，C.protothecoides為原始小球藻；縱坐標為小球藻的油脂積累變化,數據為3次平行取樣的平均值。
[0047]圖5乙醯膽鹼類似物在小球藻調整期添加時對小球藻生物質數量影響的比較。在微藻生長的調整期，分別加入50 μ g/L、150 μ g/L和200 μ g/L的乙醯膽鹼類似物，不同小球藻生物質數量的變化。其中，橫坐標為空白對照和不同乙醯膽鹼類似物，依次是CHOL為膽鹼，CH為氯化膽鹼，PC為氫氧化膽鹼，INN為胞磷膽鹼，CHCL為磷脂醯膽鹼；縱坐標為小球藻的生物質數量變化，數據為3次平行取樣的平均值。
[0048]圖6乙醯膽鹼類似物在小球藻調整期添加時對小球藻油脂積累影響的比較。在微藻生長的調整期，分別加入50 μ g/L、150 μ g/L和200 μ g/L的乙醯膽鹼類似物，不同小球藻油脂積累的變化。其中，橫坐標為空白對照和不同乙醯膽鹼類似物，依次是CHOL為膽鹼，CH為氯化膽鹼，PC為氫氧化膽鹼，INN為胞磷膽鹼，CHCL為磷脂醯膽鹼；縱坐標為小球藻油脂積累的變化，數據為3次平行取樣的平均值。
【具體實施方式】
[0049] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0050]以下實施例中微藻按照以下方法培養:將新鮮微藻細胞按照5%的體積分數接種到裝有10ml新鮮的基礎Tap培養基的250ml三角瓶中，靜置培養，並在微藻生長的不同時期添加乙醯膽鹼，其間，每天搖動三角瓶3~5次，當微藻細胞增殖到最大密度的穩定期時採收微藻細胞，藻液離心濃縮，用去離子水洗滌、離心，去除微藻細胞培養鹽，製備成無培養鹽的溼藻，作為萃取油脂之用。
[0051]以下實施例中所用的基礎Tap培養基(每升)配方如下:400.0Omg NH4Cl,50.0OmgCaCl2.2H20, 100.0Omg MgSO4.7Η20，98.80mgNa2HP04, 61.73mg KH2PO4,50.0OmgNa2EDTA.2H30,22.0Omg ZnSO4.7H20, 11.40mg H3BO3, 5.1Omg MnCl2.4H20,5.0OmgFeSO4.7H20,1.60mg CoCl2.6H20,1.16mg CuSO4.5H20,1.1Omg(NH4)6Mo7O24.4H20,2420.0Omg Trisma Base,Iml Glacial Acetic。
[0052]以下實施例中微藻的油脂通過以下方法得到:向所得的Ig微藻幹品中加入5ml濃鹽酸(質量濃度36% -38% )，混勻，70°C水浴中放置20min，加入5ml無水乙醇，靜置冷卻後再向體系中加入5mL乙醚,振蕩lmin, 4000rpm離心2min,獲得上層乙醚相和下層沉澱,將上層乙醚相移出，向下層沉澱中加入5mL的乙醚,振蕩lmin, 4000rpm離心2min,再將上層乙醚相移出，合併所有上層乙醚相，減壓濃縮脫除溶劑，獲得藻油。微藻細胞油脂含量表達為mg.g^dw,即微藻油脂含量)=油脂重量/微藻幹品重量*100。
[0053]以下實施例中微藻幹品的重量指用於提油的微藻藻粉質量，通過微藻細胞在680nm下的吸光度可以判斷微藻的生長狀況，待微藻生長至穩定期，將藻細胞搖勻，取1ml藻液SOOOrpm離心3min，去除培養液，將所獲得的藻泥在70°C下乾燥12h，獲得微藻幹品，得到每ml藻液中微藻幹品質量,表達為mg/ml,即用於提油的微藻幹品質量(mg)=每ml藻液中微藻幹品質量*用於提油的微藻藻液體積。
[0054]實施例1:
[0055]為了考察乙醯膽鹼對小球藻生長和油脂積累的影響，我們配置的特定培養基是在基礎Tap培養基中加入不同濃度的乙醯膽鹼，控制培養基中乙醯膽鹼的濃度為O μ g/L、
0.125 μ g/L、0.25 μ g/L、0.5 μ g/L、I μ g/L、5μ g/L、10 μ g/L。
[0056]在上述各組培養液中分別以體積分數5%的接種量接種新鮮的小球藻，在25°C，30001ux的恆溫光照培養箱中培養至穩定期後，獲得藻液。培養過程中，每隔24h取藻液，於680nm下測定藻液的吸光度，得到小球藻的生長曲線。
[0057]將上述所得藻液搖勻，取1ml藻液SOOOrpm離心3min，去除培養液，將所獲得的藻泥在70°C下乾燥12h，獲得微藻幹品，得到每ml藻液中微藻幹品質量，表達為mg/ml，即用於提油的微藻幹品質量(mg)=每ml藻液中微藻幹品質量*用於提油的微藻藻液體積。
[0058]小球藻生長調整期加入不同濃度乙醯膽鹼對其生物質數量和油脂含量的影響見表1和表2所示。小球藻生長調整期加入不同濃度乙醯膽鹼對其生物質數量的影響見圖1。結果顯示相對於對照組(乙醯膽鹼的濃度為O μ g/L)，在小球藻生長的調整期加入乙醯膽鹼能夠明顯提高小球藻的生物質數量和油脂含量，小球藻生物質和油脂含量的提高程度與乙醯膽鹼的濃度有很大的關係，乙醯膽鹼濃度為5 μ g/L時，小球藻的生物質數量和油脂含量都達到最高，分別為對照組的1.26倍和1.42倍。
[0059]表1小球藻生長調整期加入不同濃度乙醯膽鹼對其生物質數量的影響
[0060]
【權利要求】
1.乙醯膽鹼及其類似物在同時促進微藻生長和微藻油脂積累中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的微藻為小球藻、螺旋藻、衣藻、微綠球藻、紅球藻、富油新綠藻、多核綠藻、多形柵藻、掌網藻和葡萄藻中的任意一種。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，在微藻生長的調整期、對數期向培養基中添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物；乙醯膽鹼在微藻生長的調整期添加量為0.1~5μ g/L，乙醯膽鹼在微藻生長的對數期添加量為0.1~5 μ g/L ;乙醯膽鹼類似物在微藻生長的調整期添加量為50~200 μ g/L,乙醯膽鹼類似物在微藻生長的對數期添加量為50~200 μ g/L0
4.根據權利要求1或3所述的應用，其特徵在於，所述的乙醯膽鹼的類似物為膽鹼、氯化膽鹼、氫氧化膽鹼、胞磷膽鹼或磷脂醯膽鹼。
5.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，微藻培養溫度為25~30°C,培養光照強度為 2000 ~40001ux。
6.乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻油脂積累中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的微藻為小球藻、螺旋藻、衣藻、微綠球藻、紅球藻、富油新綠藻、多核綠藻、多形柵藻、掌網藻和葡萄藻中的任意一種。
8.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，在微藻生長的調整期、對數期向培養基中添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物；乙醯膽鹼在微藻生長的調整期添加量為0.1~5μ g/L，乙醯膽鹼在微藻生長的對數期添加量為0.1~5 μ g/L ;乙醯膽鹼類似物在微藻生長的調整期添加量為50~200 μ g/L,乙醯膽鹼類似物在微藻生長的對數期添加量為50~200 μ g/L0
9.根據權利要求6或8所述的應用，其特徵在於，所述的乙醯膽鹼類似物為膽鹼、氯化膽鹼、氫氧化膽鹼、胞磷膽鹼或磷脂醯膽鹼。
10.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，微藻培養溫度為25~30°C,培養光照強度為 2000 ~40001ux。
11.乙醯膽鹼及其類似物在促進微藻生長中的應用。
12.根據權利要求11所述的應用，其特徵在於，所述的微藻為微藻為小球藻、螺旋藻、衣藻、微綠球藻、紅球藻、富油新綠藻、多核綠藻、多形柵藻、掌網藻和葡萄藻中的任意一種。
13.根據權利要求11所述的應用，其特徵在於，在微藻生長的調整期、對數期向培養基中添加乙醯膽鹼或乙醯膽鹼類似物；乙醯膽鹼在微藻生長的調整期添加量為0.1~10 μ g/L，乙醯膽鹼在微藻生長的對數期添加量為0.1~10 μ g/L ;乙醯膽鹼類似物在微藻生長的調整期添加量為50~200μ g/L，乙醯膽鹼類似物在微藻生長的對數期添加量為50~200 μ g/L。
14.根據權利要求11或13所述的應用，其特徵在於，所述的乙醯膽鹼類似物為膽鹼、氯化膽鹼、氫氧化膽鹼、胞磷膽鹼或磷脂醯膽鹼。
15.根據權利要求11所述的應用，其特徵在於，微藻培養溫度為25~30°C,培養光照強度為2000~40001ux。
【文檔編號】C12N1/12GK104178446SQ201410421791
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月25日 優先權日:2014年8月25日
【發明者】陳以峰, 阿里帕薩愛默爾, 孫芝蘭, 竇曉 申請人:江蘇省農業科學院