轉基因鹽藻生物反應器的製作方法

2023-09-19 18:28:50 2

專利名稱：轉基因鹽藻生物反應器的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其是一種建立轉基因鹽藻生物反應器的方法。
眾所周知，植物作為生產藥用蛋白的生物反應器，為人類提供了一個更加安全和廉價的生產系統。與微生物發酵和轉基因動物等生產系統比較，它具有許多優點1、一些微生物系統不能對真核生物蛋白進行準確的翻譯後加工和蛋白糖基化；大腸桿菌發酵過程常常產生一些不溶性聚合物，而將這些聚合物重新溶解並摺疊成天然蛋白質，難度極大；此外發酵常需要龐大的設備投資。2、動物細胞培育所需費用昂貴，用轉基因動物生產重組蛋白，可能會汙染動物病毒，這對人類可能造成潛在威脅。植物病毒不會感染人類，故用轉基因植物生產重組蛋白更為安全。3、植物細胞培養不需要昂貴培養基和複雜的純化系統，也不需要嚴格無菌的生產條件和冷藏保存。
鹽藻(Dunaliella salina)，屬綠藻門團藻目多睫毛藻科。為單細胞真核生物，個體呈梨形或橢圓形，細胞體積50-1000μm3。具有2條長鞭毛，可自由遊動。鹽藻細胞與其它一些單細胞真核藻類最大的不同點是它缺乏細胞壁，細胞外僅包被一薄層彈性漿膜。藻體內有一杯狀葉綠體，內含一個造粉核。藻體前端有一紅色眼點。其繁殖主要靠細胞縱裂的無性繁殖，有性生殖為同配接合。鹽藻是目前所知耐鹽性最強的單細胞真核生物，生長在海水或鹹水湖等高鹽環境下，由於無細胞壁可通過快速的細胞體積變化來適應細胞外滲透壓的變化。因此對環境適應性極強，可在低濃度(0.2％)和接近飽和的高濃度(35％)鹽水中生長。鹽藻具有很強的光合作用能力，能利用水和空氣中的二氧化碳在陽光照射下合成蛋白質等多種有機物，因此鹽藻的養殖容易，成本低廉。
本發明的目的在於建立一種新型高效轉基因鹽藻生物反應器，將來自微生物、動物和植物的外源基因，通過目前國際上公認較為成熟的遺傳轉化技術(電激法，PEG法，基因槍法等)導入鹽藻細胞中，使其表達，建立鹽藻生物反應器，用來製備或生產多種貴重的藥用蛋白及人和獸用疫苗。
本發明以鹽藻為宿主，通過轉基因技術將外源目的基因導入鹽藻細胞中，建立轉基因鹽藻生物反應器系統，通過轉基因鹽藻細胞的大量繁殖，製備或生產目的基因的產物。
本發明的目的是通過以下方式來實現的本發明的轉基因鹽藻生物反應器，它含有外源目的基因和待定的篩選標記基因，並能高效表達外源目的基因，是利用轉基因技術方法，將外源目的基因導入鹽藻，並通過篩選標記建立轉基因鹽藻藻株，以此製備或生產目的基因產物。
在本發明中，可通過轉基因技術中的遺傳轉化生物學方法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達，以獲得轉基因鹽藻藻株。也可用物理和化學方法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達，以獲得轉基因鹽藻藻株。
所述的生物學方法可為用農桿菌Ti質粒轉化系統將外源性目的基因導入鹽藻細胞並得到表達；也可為用植物病毒載體系統將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
所述的物理和化學方法可為下列方法中的任意一種a、用聚乙二醇(PEG)處理法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
b、用脂質體法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
c、用電激法將外源性目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
d、用超聲波導入法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
e、用基因槍法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
f、用顯微注射法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
g、用紫外雷射微束法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
h、用玻璃珠攪拌法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
i、用氣溶膠基因導入法將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達。
本發明中，外源目的基因可為來自人或哺乳動物的基因，如血紅蛋白、人凝血因子III、人紅細胞生成素、幹擾素、肥胖蛋白、人白細胞介素、人粒細胞集落刺激因子、人巨噬細胞集落刺激因子、鏈激酶、人蛋白激酶、生長激素、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子、唾液酸醛縮酶、防禦素、血管抑素、內皮抑素、腫瘤壞死因子、表皮生長因子、牛凝乳乳蛋白酶等。
外源目的基因可為來自植物的基因，如超甜定、種子儲藏蛋白。
外源目的基因還可為來自昆蟲的基因，如抗菌肽。
外源目的基因也可為來自微生物的基因，如殺幼蚊毒素、細胞分裂素生物合成、內切幾丁質酶、葡萄糖澱粉酶P。
利用本發明的轉基因鹽藻可製備或生產人或獸用疫苗，如B肝表面抗原(HBsAg)，α-天花粉蛋白，流感病毒血凝素，愛滋病毒抗原(HIV-lgp120)，瘧疾抗原，口蹄疫病毒抗原；以及植物激素等生物活性物質。
篩選標記可用下列物質之一，aadA基因編碼的壯觀黴素/鏈黴素抗性，cat基因編碼的氯黴素抗性，nptII/neo基因編碼的卡那黴素/新黴素抗性，Hyg′基因編碼的潮黴素抗性。
本發明以轉基因鹽藻為生產藥用蛋白的生物反應器，具有以下特點1、鹽藻為單細胞真核生物，無細胞壁，細胞內有一個大的葉綠體，易於遺傳操作，有利於外源基因的轉化，而且不會發生基因沉默。2、母系遺傳，不會對環境造成危害。3、培養條件簡單，生長快，生產成本低，易於工業化生產。4、鹽藻細胞無毒性，基因工程下遊產品純化過程簡便。5、該系統可用於生產多種生物活性物質。
本發明涉及以鹽藻為宿主，通過轉基因技術中的生物學或化學和物理學方法，將外源目的基因導入鹽藻細胞，並通過篩選標記，獲得轉基因鹽藻，使其成為新型高效生物反應器。通過轉基因鹽藻細胞的大量繁殖，可以廉價生產許多人用和獸用藥物或疫苗、植物激素及其他生物活性物質。其特點是由於鹽藻無細胞壁，細胞內有一個大的葉綠體，易於遺傳操作，有利於外源基因的轉化；鹽藻為單細胞真核生物，表達產物可糖基化、磷酸化等，有利於免疫原性和生物活性維持；易於培養，生長快，生產成本低；鹽藻細胞無毒性，基因工程下遊產品純化過程較簡便。
本發明主要包括四方面技術1、鹽藻培養技術。2、鹽藻表達載體構建，權利要求書4-7項所描述的各種外源基因均可單獨構建鹽藻基因組表達載體、葉綠體表達載體和自主複製表達載體三種表達載體中的一種或幾種聯合。3、將外源基因導入鹽藻的技術。4、轉基因鹽藻的篩選。
附圖
為本發明中腫瘤壞死因子(TNF)葉綠體表達載體p64-TNF-AAD的構建本發明結合以下實施例做進一步描述，但並不限制本發明。
實施例一、鹽藻培養技術1、液體培養藻種接種於Mclachlan培養液，培養條件如下溫度20-30℃，光照強度3000勒克司，每天光照培養14小時，黑暗培養10小時。
2、固體培養Mclachlan培養液中加入瓊脂濃度為0.5-0.8％，於超淨臺用消毒白金耳從液體培養液取藻種立即接種到固體培養基面上，置恆溫箱內培養，恆溫箱中需配置螢光管照射，按液體培養條件要求進行培養。
二、腫瘤壞死因子(TNF)葉綠體表達載體p64C-TNF-AAD的構建(1)載體pSK-atpX上克隆有葉綠體atpA的5′啟動子序列和rbcL的3′終止子序列，可以在葉綠體中高效表達插入的外源基因。質粒pUC19-TNF上含有人腫瘤壞死因子α(TNF-α)的cDNA基因片斷，長度約為600bp，兩端分別為BamH I和Xba I酶切位點，將載體pSK-atpX和質粒pUC19-TNF均用BamH I和Xba I雙酶切割後，將TNF-α的cDNA基因片斷插入到pSK-atpX上atpA的5′啟動子序列和rbcL的3′終止子序列之間，構成含有人TNF-α基因表達盒(atpA5′-TNF-rbcL3′)的中間載體pSK-atpX-TNF。
(2)載體p64C上克隆有葉綠體同源片段clpP-trnl-petB基因及chlL基因的5′和3′非編碼區。將載體p64C和第(1)項得到的中間載體pSK-atpX-TNF均用EcoR V和Sac I雙酶切割後，將切下的TNF-α基因表達盒插入到p64C中，構成葉綠體中間表達載體p64C-atpX-TNF。其中TNF-α基因表達盒位於chlL和atpA的雙重啟動子下遊，使TNF-α基因增強表達。
(3)載體pUC-atpX-AAD上克隆有aadA基因表達盒(atpA5′-aadA-rbcL3′)，可以表達氨基糖苷-3′-腺苷酸轉移酶(壯觀黴素抗性選擇標記)。將載體pUC-atpX-AAD以EcoR V和Sac I雙酶切割，切下1.9kb的aadA基因表達盒，同時將第(2)項得到的葉綠體中間表達載體p64C-atpX-TNF用Not I切割後經T4DNA聚合酶補成平端，再用Sac I切割，最後將aadA基因表達盒插入到p64C-atpX--TNF中，構成葉綠體表達載體p64C-TNF-AAD(如圖所示)，其中含有人TNF-α基因表達盒(atpA5′-TNF-rbcL3′)和aadA基因表達盒(atpA5′-aadA-rbcL3′)，且TNF-α基因表達盒直接位於chlL5′下遊，使TNF-α基因在chlL和atpA的雙重啟動子作用下得到增強表達，同時aadA基因表達盒可表達壯觀黴素抗性，便於重組子的篩選。
三、將外源目的基因導入鹽藻1、用電激法將外源目的基因導入鹽藻取培養第5天的鹽藻培養液，1000rpm離心15min，棄上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇液處理後加入電激緩衝液，調整鹽藻密度在108個/mm3。繼之加入終濃度為10μg/ml的含外源基因的質粒及25μg/ml的鮭精DNA，混勻後，置冰上5-10min，吸取0.5ml置於轟擊小室中待用。電激儀(Backon 2000型)電激時電壓為9.5KV，每次電激時間為0.05μs，次數為210，循環次數100次，電激高度2mm，每次電激間隔時間為62.5sec。
2、用基因槍法將外源目的基因導入鹽藻取培養第5天的鹽藻培養液，1000rpm離心15min，棄上清，用鹽藻培養液將鹽藻密度調整在108個/mm3，再取0.5ml鹽藻培養液鋪於含抗生素的固體培養基中央，直徑為3cm的圓形有效轟擊範圍內，置超淨臺下吹乾待用。
在無菌條件下，用基因槍(Bio-Rod公司產的PDS-1000型)轟擊。具體步驟如下取50μl(60μg/ml)金粉懸浮液加入6μg含有外源基因的質粒以及50μl 2.5M Cacl2和20μl 0.1M亞精胺，振蕩3min，12000rpm離心10sec，棄上清。用無水乙醇洗一次，振蕩，12000rpm離心，棄上清，共二次。最後將附有金粉的質粒懸浮於60μl無水乙醇中。每次轟擊取6-8μl，每皿轟擊3次，轟擊後將培養皿放入鹽藻適宜培養條件下培養。
3、用PEG法將外源目的基因導入鹽藻取0.5ml鹽藻培養液(細胞密度107-108個/ml)，在超淨臺內接種於含抗生素的固體培養基上，直徑為3cm，吹乾待用。
構建攜帶外源目的基因的農桿菌Ti質粒和鹽藻細胞原生質體。爾後將新製備的原生質體懸浮液與Ti質粒DNA一起保溫培養，同時加入分子量4000-6000的PEG，在pH8-9下促進原生質體攝取DNA，從而使細胞轉化，為促進轉化，在轉化培養時加入運載DNA(小牛胸腺DNA)，培養後離心收集原生質體，並重新懸浮到原生質體培養基中繼續培養。
四、轉基因鹽藻的篩選取電激法、基因槍法或PEG介導基因轉化法的鹽藻細胞團，鋪於含有適當選擇標記的固體培養基上進行篩選培養。在適宜培養條件，2-4周後出現若干藻落，再將此藻落懸浮培養於不含抗生素的液體培養液中，3-5天後再在抗生素的固體培養基上進行二次篩選，以後經10次以上繼代培養，即可大量繁殖。
權利要求
1.一種轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於它含有外源目的基因和特定的篩選標記基因，並能高效表達外源目的基因，是利用轉基因技術方法，將外源目的基因導入鹽藻，並通過篩選標記建立轉基因鹽藻藻株，以此製備或生產目的基因產物。
2.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於利用轉基因技術中的生物學法，例如農桿菌Ti質粒轉化系統、植物病毒載體介導的轉化技術，將外源目的基因導入鹽藻細胞並得到表達，以獲得轉基因鹽藻藻株。
3.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於利用轉基因技術中的物理和化學方法，例如聚乙二醇(PEG)、脂質體法、電激法、超聲波導入法、基因槍法、顯微注射法、紫外雷射微束法、玻璃珠攪拌法、氣溶膠基因導入法，將外源性目的基因導入鹽藻細胞並得到表達，以獲得轉基因鹽藻藻株。
4.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於外源目的基因為來自人或哺乳動物的基因，如血管抑素、內皮抑素、血紅蛋白、人凝血因子III、人紅細胞生成素、幹擾素、肥胖蛋白、人白細胞介素、人粒細胞集落刺激因子、人巨噬細胞集落刺激因子、鏈激酶、人蛋白激酶、生長激素、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子、唾液酸醛縮酶、防禦素、腫瘤壞死因子、表皮生長因子、牛凝乳乳蛋白酶。
5.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於外源目的基因為來自植物的基因，如超甜定、種子儲藏蛋白基因。
6.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於外源目的基因為來自昆蟲的基因，如抗菌肽基因。
7.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於外源目的基因為來自微生物的基因，如殺幼蚊毒素基因、細胞分裂素生物合成基因、內切幾丁質酶基因、葡萄糖澱粉酶P基因。
8.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於篩選標記為以下物質之一，aadA基因編碼的壯觀黴素/鏈黴素抗性，cat基因編碼的氯黴素抗性，nptII/neo基因編碼的卡那黴素/新黴素抗性，Hyg′基因編碼的潮黴素抗性。
9.根據權利要求1所述的轉基因鹽藻生物反應器，其特徵在於利用本發明的轉基因鹽藻可製備或生產人或獸用疫苗。
全文摘要
一種轉基因鹽藻生物反應器,它含有外源目的基因和特定的篩選標記基因,並能高效表達外源目的基因。是利用轉基因技術方法,將外源目的基因導入鹽藻,並通過篩選標記建立轉基因鹽藻藻株,以此製備或生產目的基因產物。本發明的優點是:鹽藻為單細胞真核生物,無細胞壁,細胞內有一個大的葉綠體,易於遺傳操作,有利於外源基因的轉化,不會對環境造成危害。培養條件簡單,生長快,成本低,易於工業化生產。鹽藻細胞無毒性,下遊產品純化過程簡便。
文檔編號A61K39/395GK1356388SQ0013121
公開日2002年7月3日 申請日期2000年12月3日 優先權日2000年12月3日
發明者薛樂勳, 潘衛東, 姜國忠, 鄭合明, 張貴星, 呂玉民, 魯照明, 王建民, 牛向麗, 王筠, 陳佔寬, 王建人, 杜保華 申請人:薛樂勳