DLK1基因的用途以及siRNA、BM-MSCs和FGF2的製作方法

2023-09-19 18:15:20

專利名稱：DLK1基因的用途以及siRNA、BM-MSCs和FGF2的製作方法
技術領域：
本發明涉及肝臟纖維化治療領域，特別涉及DLKl作為靶點在肝臟纖維化治療中 的用途。
背景技術：
肝炎、肝代謝性疾病以及由此產生的肝纖維化和肝硬化是臨床常見病，近年來調 查顯示，因肝病導致死亡的人數逐年增加，各種肝臟疾病已經成為影響人類壽命的一個重 要原因。對於肝臟疾病仍缺乏理想的治療措施，約10%的病人最終因為肝功能衰竭去世。 目前針對各種急慢性肝病，採取維持和支持療法；原位肝移植因供肝缺乏，費用昂貴，尚存 在免疫排斥問題，故其臨床價值受限，受益者極少；生物人工肝和肝細胞移植同樣因為肝細 胞來源有限而不能在臨床上發揮更大作用。因此尋找有效的肝病治療手段顯得十分迫切。儘管不同的病因導致肝病的發病機制不同，但各種病因引起的慢性肝病大多都伴 有肝纖維化的發生，其中很大一部分會發展成為肝硬化甚至肝癌。肝臟纖維化本身是肝臟 對各種原因所導致慢性損傷的一種修復反應，其實質是肝臟修復過程中產生的細胞外基質 (ECM)過度沉積。眾多研究顯示，肝星狀細胞(HSC)的活化是肝臟纖維化發生和發展的中心 環節。肝星狀細胞又稱儲脂細胞、Ito細胞、維生素A儲存細胞等，是肝臟間質細胞之一，位 於肝細胞與肝竇內皮細胞之間的竇周隙(Disse間隙)內，在正常情況下呈靜止狀態。在肝 髒損傷過程中各種因子能夠刺激下，HSC能夠活化，從而轉化為具有伸縮功能的肌纖維樣母 細胞，表達α -SMA並釋放大量胞外基質，如I型膠原等。因此慢性肝病特別是肝硬化的防 治，其關鍵是降低肝臟纖維化程度，而抑制慢性損傷過程中HSC的活化無疑是一種有效的 治療肝臟纖維化策略。近年來，在抑制HSC活化或誘導活化HSC凋亡方面已有一些研究，如研究表明 IFN-α ,IFN-Y均可抑制HSC增殖、活化；硒、鋅製劑、金屬硫蛋白、白藜蘆醇、水飛薊素及許 多中藥都可通過抗氧化作用抑制HSC增殖、活化；幹預三磷酸肌醇激酶、分裂原活化蛋白激 酶、蛋白激酶C、鈉/氫(Na+/H+)交換及整合素等細胞內信號通路，可在一定程度上進行針 對HSC活化和肝臟纖維化的治療。但總體而言，對於抑制肝損傷過程中HSC的活化仍缺乏 十分有效的藥物或方法，因此發掘有效抑制HSC活化的新靶點，從而研製抗纖維化新藥意 義重大。DLKl，又稱為脂肪前體細胞因子1 (pref-Ι)，是一個具有6個表皮生長因子樣重複 結構的跨膜蛋白，能夠經蛋白酶水解而產生兩種游離形式，大小分別為50kDa和25kDa。以 往眾多研究表明DLKl主要參與脂肪細胞分化，能夠抑制脂肪前體細胞向脂肪細胞分化。其 中主要由50kDa大小的游離形式發揮此項作用，而25kDa形式生物學功能目前還不清楚。此 外也有研究顯示DLKl參與間質細胞定向、基質細胞和pre-B細胞相互作用以及祖細胞(成 肝細胞，肌衛星細胞)發育等生命活動。但目前DLKl是否參與慢性肝病中肝臟纖維化進程 尚不清楚。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種DLKl基因在作為治療肝臟纖維化的靶點的 用途，以及用於治療肝臟纖維化的siRNA、骨髓間充質幹細胞和細胞因子FGF2。為了解決上述技術問題，本發明提供一種DLKl基因的用途作為治療肝臟纖維化 靶點。作為本發明的DLKl基因的用途的改進以DLKl基因為靶點，設計相關藥物降低 DLKl表達，抑制肝星狀細胞活化，從而降低肝臟纖維化。本發明還同時提供了一種用於治療肝臟纖維化的siRNA，其序列為5，-p. CCCUAUUAAUGCAUGAUAAdTdT-3，(正向)5，-P. UUAUCAUGCAUUAAUAGGGAG-3，(反向)。上述序列中P是表示在5』端進行了磷酸化修飾，「.」表示起連接作用；3 『dT懸 垂為了增加RNA穩定性。本發明還同時提供了上述siRNA在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。本發明還同時提供了骨髓間充質幹細胞在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。本發明還同時提供了細胞因子FGF2在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。本發明的發明人在肝臟損傷修復研究中，發現DLKl是一個與肝纖維化密切相關 的調控因子，是肝纖維化治療的一種新分子靶點。表現在DLKl在正常肝臟中基本不表達， 慢性肝損中，DLKl表達明顯上調且持續表達。體外實驗證明DLKl能夠促進HSC活化。體 內研究進一步表明，針對DLKl基因的化學合成siRNA、骨髓間充質肝細胞幹細胞(BM-MSCs) 和細胞因子FGF2都能以DLKl為靶點，顯著降低其表達，同時明顯抑制HSC活化、降低肝臟 纖維化程度。由此說明，DLKl基因是肝臟損傷過程中抑制HSC活化、降低纖維化的有效靶 點，針對DLKl的siRNA、BM-MSCs和FGF2都是降低DLKl表達，從而治療肝臟纖維化的有效 製劑。在本發明中，SiRNA可通過化學合成獲得，骨髓間充質幹細胞、鹼性成纖維細胞生 長因子(FGF2)均可通過市購方式獲得。本發明利用小鼠CCl4慢性肝損傷模型，首次證明以DLKl基因為靶點，通過尾靜脈 注射針對DLKl基因的siRNA、BM-MSCs和FGF2能夠抑制DLKl表達，從而顯著抑制HSC活 化、降低肝纖維化程度。本發明的DLKl基因作為肝臟纖維化治療新靶點的優勢在於降低 DLKl基因的表達能夠顯著抑制HSC的活化、降低肝臟纖維化水平。siRNA的實際用法和用量如下將siRNA溶於PBS緩衝液中，然後按照4 6mgsiRNA/kg (體重)進行靜脈注射。一般情況下，每50 μ g的siRNA溶解於Iml的PBS緩 衝液中。骨髓間充質幹細胞的實際用法和用量如下將骨髓間充質幹細胞懸浮於PBS緩衝 液中，然後按照3 3.5X107個將骨髓間充質幹細胞/kg(體重)進行靜脈注射。一般情 況下，每IO6個骨髓間充質幹細胞溶解於100微升PBS緩衝液中。鹼性成纖維細胞生長因子(FGF2)的實際用法和用量如下將細胞因子FGF2溶於 PBS緩衝液中，然後按照40 60 μ g細胞因子FGF2/kg體重進行靜脈注射。一般情況下，每 50 yg的細胞因子FGF2溶解於3. 3ml的PBS緩衝液中。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是慢性肝損傷小鼠肝臟中DLKl表達檢測圖；圖1中，Normal和CC14分別表示正常和CCl4損傷小鼠肝臟。A, western blot檢 測慢性損傷2天(2D)、1周(IW)、2周(2W)、3周(3W)和4周(4W)DLK1蛋白表達；B，對上面 western blot結果的光密度統計，以β -actin為內參。圖2是體外DLKl活化HSC情況檢測圖；圖2中，control、L和S分別表示正常HEK293細胞上清處理組、轉染DLK1-L和 DLKl-S的HEK293上清處理組。A，RT-PCR檢測新鮮分離和處理7天的HSC中脂肪性質基因 (PPAR γ )和活化標誌基因(α -SMA和col I ( α 1))表達；B，螢光定量PCR檢測α -SMA和 col Ι(α 1)基因表達變化，*表示與control組比較差顯著(P < 0. 05) ；C,形態學觀察處 理7天後HSC細胞中脂滴情況，免疫螢光檢測α-SMA蛋白水平變化，Bar = IOOym5D,對於 C中α -SMA單位面積細胞上螢光強度進行統計，**表示與control組比較差異極顯著(P < 0. 01)。圖3是注射DLKl siRNA後DLKl表達檢測圖；圖3中，CC14、PBS和siRNA分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照 組、CCl4損傷後注射SiRNA的實驗組。**表示實驗組與CC14損傷組比較差異極顯著(P < 0. 01)。圖4是注射DLKl siRNA後肝星狀細胞活化標誌檢測圖；圖4中，CC14、PBS和siRNA分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後注射SiRNA的實驗組。*表示實驗組與CC14損傷組比較差顯著(P <0.05)，** 表示實驗組與CC14損傷組比較差異極顯著(P <0.01)；左圖代表a-SMA(a平滑肌肌動 蛋白)mRNA表達變化，右圖代表col I ( α 1) (I型膠原)mRNA表達變化。圖5是注射DLKl siRNA後天狼猩紅染色檢測肝臟纖維化圖；圖5中，CC14、PBS和siRNA分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後注射SiRNA的實驗組。Bar = 50 μ m。圖6是移植MSCs後DLKl表達檢測圖；圖6中，CC14、PBS和MSCs分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後移植MSCs的實驗組。**表示實驗組與CC14損傷組比較差異極顯著(P <0.01)。圖7是移植MSCs後肝星狀細胞活化標誌檢測圖；圖7中，CC14、PBS和MSCs分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後移植MSCs的實驗組。**表示實驗組與CC14損傷組比較差異極顯著(P<0.01)； 左圖代表a-SMA(a平滑肌肌動蛋白)mRNA表達變化，右圖代表col I ( a 1) (I型膠原) mRNA表達變化。圖8是移植MSCs後天狼猩紅染色檢測肝臟纖維化圖；圖8中，CC14、PBS和MSCs分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後移植MSCs的實驗組。Bar = 50 μ m。圖9是注射FGF2後DLKl表達檢測圖；圖9中，CC14、PBS和FGF2分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、CCl4損傷後注射FGF2的實驗組。**表示實驗組與CC14損傷組比較差異極顯著(P <0.01)。
圖10是注射FGF2後肝星狀細胞活化標誌檢測圖；圖10中，CC14、PBS和FGF2分別表示CCl4損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後注射FGF2的實驗組。**表示實驗組與CC14損傷組比較差異極顯著(P<0.01)； 左圖代表a-SMA(a平滑肌肌動蛋白)mRNA表達變化，右圖代表col I ( a 1) (I型膠原) mRNA表達變化。圖11是注射FGF2後天狼猩紅染色檢測肝臟纖維化圖；圖11中，CC14、PBS和FGF2分別表示014損傷組、CCl4損傷後注射PBS的對照組、 CCl4損傷後注射FGF2的實驗組。Bar = 50 μ m。
具體實施例方式實施例1 慢性肝損傷小鼠模型製備和DLKl表達檢測利用10% (體積濃度)四氯化碳(溶劑為橄欖油)對八周鼠齡的ICR小鼠(體 重約30克)誘導化學肝損傷，每隻小鼠腹腔注射0. 25ml 10% CCl4，每周2次，連續注射4 周，建立肝纖維化模型，注射後的小鼠在無菌環境下正常飼喂。提取正常、損傷2天、1、2、3和4周小鼠肝臟總蛋白，Western blot檢測DLKl表 達取50 μ g蛋白上樣，跑SDS-PAGE電泳；冰浴中恆流200mA轉膜(硝酸纖維素膜)2小時； 按照0. lml/cm2膜面積加入封閉液，BP 2% BSA(2g BSA溶於100ml PBST，其中PBST為PBS 加0.05% (體積比)的TWEEN20)，室溫平緩搖動2小時；棄封閉液，以0. lml/cm2膜面積加 ADLKl (Rat anti mouse, Enzo Life Sciences), 4 if ^ ；If—㈱，PBST Μ^Ξ.^, 每次IOmin ；以0. lml/cm2膜面積加二抗，室溫平緩搖動1小時；棄二抗，PBST洗膜三次，每 次IOmin ；以0. lml/cm2膜面積加顯色液。結果表明正常肝臟幾乎檢測不到DLKl表達，慢性損傷過程中，DLKl易於誘導且 持續表達，且Western blot檢測顯示DLKl蛋白以50kDa和25kDa左右兩種形式存在(如 圖1所示)。實施例2 體外實驗證明DLKl促進HSC活化HSC細胞分離培養正常小鼠肝臟，膠原酶-鏈蛋白酶灌流，收集單個分散肝細胞， 將細胞懸液小心加至8. 2% Nycodenz (Axis-shield)上，800g離心25分鐘，收集中間層HSC 細胞，IMDM(supplemented with 10% FBS and 1 % penicillin/streptomycin) 37°C, 5% CO2條件培養。DLKl蛋白製備克隆DLKl基因胞外區和信號肽及鄰近1_3個EGF樣結構；將克隆 片段插入載體P⑶ΝΑ6中；質粒用脂質體2000轉染ΗΕΚ293細胞；收集轉染72小時後無血 清細胞上清液，500g離心IOmin ；western blot檢測表達蛋白；其中胞外區表達所得蛋白為 DLKl大片段(DLKl-L)游離蛋白，信號肽及鄰近1_3個EGF樣結構表達所得蛋白為小片段 (DLKl-S)游離蛋白。DLKl蛋白處理HSC細胞新鮮分離HSC細胞用DLKl-L和DLKl-S處理(約40ng/ ml)，7-14天後，顯微鏡觀測、RT-PCR、real-time PCR和免疫螢光檢測HSC活化情況。正常 HEK293細胞無血清上清液處理組作為對照。其中HSC活化標誌性基因a-SMA(a平滑肌肌 動蛋白)和col I(Cil) (I型膠原)，引物分別是
α -SMA, GGGAGTAATGGTTGGAATGG (sense)GGCAGTAGTCACGAAGGAATAG (antisense)，coll(α 1), AACTTTGCTTCCCAGATGTCCT(sense)TCGGTGTCCCTTCATTCCAG(antisense)，由上海英俊公司合成。結果表明培養7天後，HSC明顯活化，脂肪類基因PPARY表達下調，而活化標誌 基因α -SMA和col Ι(α 1)表達明顯上調，其中DLKl-L組相比較對照組，基因表達水平顯著 提高，而DLKl-S組無顯著差異。形態學觀察顯示處理7天後，對照組和DLKl-S組細胞仍有 明顯脂滴存留，而DLKl-L組細胞中幾乎觀察不到脂滴。處理14天後，免疫螢光檢測α-SMA 表明相比於對照組，DLKl-L組有更強的α -SMA表達，而DLKl-S組無顯著差異(如圖2所 示)。由此證明DLKl體外能夠促進HSC活化，且起作用的主要是DLK1-L。實施例3 =SiRNA抑制DLKl表達，降低HSC活化和肝臟纖維化上述肝纖維化模型小鼠，CCl4注射第2周，尾靜脈注射針對DLKl的siRNA，序列 為5，-P. CCCUAUUAAUGCAUGAUAAdTdT-3，(正向)，SEQ ID NO 1 ；5，-P. UUAUCAUGCAUUAAUAGGGAG-3，(反向) SEQ ID NO :2。由上海吉瑪製藥技術有限公司合成。50 yg siRNA溶解在ImlPBS中快速通過尾靜脈注射，然後8小時和24小時後 每隻小鼠再分別注射一次(50yg siRNA)；同時對其他同樣損傷的小鼠注射Iml PBS作 為對照。之後對所有小鼠繼續按上述方法進行肝損傷2周，取小鼠的肝臟組織，一部分用 TRizol(Invetigen)提取總RNA，提取方法按說明書進行，然後用逆轉錄試劑盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. O(TaKaRa)進行逆轉錄。real time-PCR檢測DLKl基因表達，引物序列為 GGAGAAAGGCCAGTACGAATG(sense), CTGTTGGTTGCGGCTACGAT (antisense) ；real time-PCRit 一步檢測肝星狀細胞活化的標誌性基因α-SMA和col I (a 1)，引物如上所述；另一部分石 蠟包埋後進行組織切片，切片厚度5 μ m，天狼猩紅染色，直觀展示纖維化程度。上述引物由 上海英俊公司合成。結果表明，siRNA注射組小鼠，DLKl基因表達明顯受到抑制(如圖3所示)，同時 與對照組小鼠相比，實驗組小鼠肝星狀細胞活化標誌a-SMA和col I(a 1)表達顯著下降， 表明肝星狀細胞活化受到抑制(如圖4所示)，天狼猩紅染色隨後也證明肝臟纖維化程度明 顯得到改善(如圖5所示)。由此說明尾靜脈注射針對DLKl基因的siRNA能夠抑制DLKl 表達，從而有效抑制肝星狀細胞活化、降低肝臟纖維化。實施例4 骨髓間充質幹細胞(BM-MSCs)移植抑制DLKl表達，降低HSC活化和肝 髒纖維化如實施例1所述的連續注射CC142周的小鼠，尾靜脈注射第三代BM-MSCs(lX IO6 個細胞/只小鼠)，隨後對所有小鼠繼續按上述方法進行肝損傷2周，取小鼠的肝臟組織，一 部分用TRizol (Invetigen)提取總RNA，提取方法按說明書進行，然後用逆轉錄試劑盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. O(TaKaRa)進行逆轉錄。real time-PCR檢測DLKl基因表達，引物如上 所述；real time-PCR進一步檢測肝星形細胞活化的標誌性基因α -SMA和col I ( α 1)表 達，引物如上所述；另一部分石蠟包埋後進行組織切片，切片厚度5 μ m,天狼猩紅染色，直 觀展示纖維化程度。引物由上海英俊公司合成。
結果表明，BM-MSCs移植組小鼠，DLKl基因表達明顯受到抑制(如圖6所示)，同 時與對照組小鼠相比，小鼠肝星狀細胞活化標誌α-SMA和col I(a 1)表達顯著下降，表明 肝星狀細胞活化受到抑制(如圖7所示)，天狼猩紅染色隨後也證明肝臟纖維化程度明顯得 到改善(如圖8所示)。由此說明尾靜脈移植BM-MSCs能夠抑制DLKl表達，從而有效抑制 肝星狀細胞活化、降低肝臟纖維化。實施例5 :FGF2抑制DLKl表達，降低HSC活化和肝臟纖維化如實施例1所述的連續注射CC142周小鼠，按50ng/g體重劑量對實驗組小鼠尾靜 脈注射FGF2，另外取對照組注射PBS。然後對所有小鼠繼續按上述方法進行肝損傷2周， 取小鼠的肝臟組織，一部分用TRizol (Invetigen)提取總RNA，提取方法按說明書進行，然 後用逆轉錄試劑盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. O(TaKaRa)進行逆轉錄。real time-PCR檢測 DLKl基因表達，引物如上所述；real time-PCR進一步檢測肝星形細胞活化的標誌性基因 α-SMA和col I(Cil)表達，引物如上所述；另一部分石蠟包埋後進行組織切片，切片厚度 5 μ m，天狼猩紅染色，直觀展示纖維化程度。引物由上海英俊公司合成。結果表明，FGF2注射組小鼠，DLKl基因表達明顯受到抑制(如圖9所示)，同時與 對照組小鼠相比，實驗組小鼠肝星狀細胞活化標誌α-SMA和col I(a 1)表達顯著下降，表 明肝星狀細胞活化受到抑制(如圖10所示)，天狼猩紅染色隨後也證明肝臟纖維化程度明 顯得到改善(如圖11所示)。由此說明尾靜脈注射FGF2能夠抑制DLKl表達，從而有效抑 制肝星狀細胞活化、降低肝臟纖維化。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
DLK1基因的用途，其特徵是作為治療肝臟纖維化的靶點。
2.根據權利要求1所述的DLKl基因的用途，其特徵是以DLKl基因為靶點，設計相關 藥物降低DLKl表達，抑制肝星狀細胞活化，從而降低肝臟纖維化。
3.一種用於治療肝臟纖維化的siRNA，其特徵是序列為 5，-P. CCCUAUUAAUGCAUGAUAAdTdT-3，(正向)5，-P. UUAUCAUGCAUUAAUAGGGAG-3，(反向)。
4.如權利要求3所述的siRNA在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。
5.骨髓間充質幹細胞在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。
6.細胞因子FGF2在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了DLK1基因的用途作為治療肝臟纖維化的靶點；即以DLK1基因為靶點，設計相關藥物降低DLK1表達，抑制肝星狀細胞活化，從而降低肝臟纖維化。本發明還同時公開了siRNA、骨髓間充質幹細胞和細胞因子FGF2在製備治療肝臟纖維化的藥物中的應用。
文檔編號A61K48/00GK101940795SQ20101021282
公開日2011年1月12日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者潘若浪, 王萍, 董偉仁, 邵健忠, 項黎新 申請人:浙江大學