逆境特異誘導雙向表達活性的水稻啟動子cpip的鑑定和利用的製作方法

2023-09-19 18:25:15

專利名稱：逆境特異誘導雙向表達活性的水稻啟動子cpip的鑑定和利用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程技術領域。具體地說涉及一種植物逆境特異誘導啟動子的分離鑑定和應用。該啟動子被命名為CPIP，被乾旱或鹽誘導並具有雙向誘導表達活性，將其應用於植物抗逆基因特別是用於重要作物抗逆基因的遺傳轉化，達到提高植物抗逆性的目的。
背景技術：
水稻是最重要的糧食作物之一，我國是世界上第一種稻大國。非生物逆境(乾旱、冷害和土壤鹽漬化等)嚴重威脅著水稻產量和品質。在面臨逆境脅迫時，植物的許多信號傳遞系統被開啟，一批應答基因被誘導，包括直接起保護作用的功能蛋白基因(滲透調節物質、抗氧化物質、功能蛋白等)和在信號傳遞與脅迫應答基因表達中起調節作用的調控基因(轉錄因子、蛋白激酶等)(Xiong等，Cell signaling during cold，droughtand salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。儘管已有文獻報導從植物中分離了大量抗逆相關基因並且在植物中超量表達這些基因對提高植物抗逆性有一定效果(Thomashow等，Plant coldacclimationFreezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol Biol 50571-599，1999；Shinozaki等，Molecular response to dehydration and low temperatureDifferences and cross-talk between two stress signaling pathways.Curr Opin Plant Biol 3217-223.2000；Saijo等，Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold andsalt/drought tolerance on rice plants.Plant J 23319-327，2000；Kim等，CIPK3，a calciumsensor-associated protein kinase that regulates abscisic acid and cold signal transduction inArabidopsis.Plant Cell 15411-423，2003)，但超量表達往往會產生一些負面的影響，如影響植物原來的產量潛力或導致轉基因植株的致死效應或強烈的多重效應(Shavindra等，Transgenic approaches toincrease dehydration-stress tolerance in plants.Mol Breed 5493-503，1999)。利用逆境誘導型啟動子來控制抗逆基因的表達越來越受到重視，一些逆境應答的啟動子，如SalT啟動子(Garcia等，Theexpression of the salt-responsive gene salT from rice is regulated by hormonal and developmentalcues，Planta.207172-180，1998)，RD29A啟動子(Yamaguchi-Shinozaki等，Characterization ofthe expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of itspromoter in transgenic plants.Mol Gen Genet 23331-340，1993；Kasuga等，A combination of theArabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperaturestress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol 45346-350，2004)，HVA1啟動子(Xu等，Expression of a late embryogenesis abundant protein gene，HVA1，from barley conferstolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice.Plant Physiol 110249-257，1996；Ho和Wu等，Production of water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants USpatent，US5981842，1999)也已經鑑定出來並嘗試了在一些作物的抗逆改良中應用。但已經鑑定的啟動子要麼特異性不強(即非誘導情況下表達量較高)，要麼誘導強度不高，使得實際的應用價值大打折扣。另一方面，出於生物安全性的考慮，更是迫切需要條件誘導型(如鹽誘導)啟動子來控制遺傳轉化過程中篩選標記基因的表達。此外，由於到目前為止幾乎所有用於遺傳轉化的啟動子都只有單方向上的表達活性；即使個別啟動子在另一方向有表達活性，但由於活性通常很低而無實際應用價值。具有雙向強誘導表達活性的啟動子不僅在構建遺傳轉化載體時能減少外源片段的數量，而且可以用於控制需要協同表達才能起作用的多基因的載體構建和轉化。但是迄今為止尚無雙向強誘導表達活性的啟動子的鑑定和在遺傳轉化中利用的報導。
本發明是鑑定一個鹽和乾旱等逆境強烈誘導的水稻蛋白酶抑制子基因的啟動子，該啟動子具有雙向逆境強誘導表達活性並且分別控制一個蛋白酶抑制子基因的表達。通過啟動子活性分析，將具有雙向逆境強誘導表達活性的啟動子區段用於調控篩選標記基因和抗逆基因(或同時控制多個抗逆基因)在水稻中的表達，從而有效地提高了植物的抗逆性。

發明內容
本發明的目的是克隆、鑑定一個鹽和乾旱強烈誘導且具有雙向表達活性的植物內源啟動子，並利用該啟動子構建抗逆相關基因的表達載體，通過遺傳轉化方法達到提高植物的抗逆性。
本發明通過以下技術方案實現首先是分離鹽和乾旱強烈誘導表達的啟動子。所分離的鹽和乾旱強烈誘導表達的啟動子(該啟動子的序列如SEQ ID NO1所示)來源於水稻。該啟動子控制的水稻內源基因為糜蛋白酶抑制子(ChymotrypsinProteinase inhibitor)家族的兩個成員，即這兩個基因反向串聯排列共同受一個具有雙向表達活性的啟動子控制(如圖2所示)。該啟動子命名為CPIP(Chymotrypsin Proteinase Inhibitor Promoter)。這兩個基因分別命名為OsCPI1(GenBank登錄號AY878695)和OsCPI2(GenBank登錄號AY878694)，它們都能被乾旱、高鹽脅迫、冷害以及脫落酸(ABA)誘導(如圖3所示)。該啟動子CPIP的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，序列全長1893個鹼基，根據現有文獻報導，例如Skriver等，Cis-acting DNA elements responsive togibberellin and its antagonist abscisic acid.Proc Natl Acad Sci USA.887266-7270.1991；Simpson等，Two different novel cis-acting elements of erd1，a clpA homologous Arabidopsis gene functionin induction by dehydration stress and dark-induced senescence.Plant J 33259-270，2003和Urao等，An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.Plant Cell 51529-1539，1993；Abe等，Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcriptional activators in abscisic acid signalling.Plant Cell1563-78，2003，我們得知其中在307-311，423-427，571-575，1173-1177鹼基位含有逆境相關的ABA應答元件ABRELATERD1，並在鹼基位325-330，801-806，878-883，1384-1389，1849-1854含有MYB類轉錄因子結合的乾旱應答順式作用元件。
本發明所提供的啟動子CPIP區域含有多個逆境相關順式作用元件(如圖1所示)，能特異性地對逆境和ABA起應答反應。申請人利用啟動子CPIP的正向和反向構建的誘導性表達載體pCAMBIA1391Z-CPIP(如圖4所示)可以在植物受到逆境脅迫時強烈地誘導報告基因GUS的表達(如圖5、6、7所示)。本發明的效果詳見具體實施方式
。
更詳細的技術方案如下所述一種被乾旱或鹽誘導並具有雙向誘導表達活性的啟動子CPIP，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。具體地說它是SEQ ID NO1所示1-1893位鹼基所示的序列。
如附圖1所述，上述啟動子序列的區域內除含有基本啟動子元件外(例如CAAT-box，TATA-box)，還包含多個逆境應答順式作用元件(例如ACGTATERD1，ABRELATERD1，MYB1AT和MYBCORE)的組合。
申請人將所述的啟動子CPIP全部或部分序列構建成一種植物表達載體pCAMBIA1391Z-CPIP(如附圖4所述)，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將所述的植物表達載體pCAMBIA1391Z-CPIP轉化水稻栽培品種植株，得到耐鹽或抗旱的轉基因水稻植株，從而完成了本發明。
本發明的啟動子可以通過遺傳轉化培育的抗逆植物材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、種子或細胞無性系。
按照以上的技術方案，很顯然，申請人或申請人以外的其他人可以利用本發明所提供的啟動子CPIP構建抗逆相關基因的表達載體轉化植物以提高植物的抗逆性。受體植物可以是包括水稻、小麥、玉米等在內的禾穀類作物，當然也可以包括其他一些重要的經濟作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄作物上的應用。


序列表SEQ ID NO1，公開了本發明克隆的水稻啟動子CPIP的序列。
圖1顯示的是啟動子CPIP序列。下劃線序列為擴增啟動子CPIP所用的引物序列。陰影顯示的是基本啟動子元件序列。ABRE類的逆境應答元件核心序列用文本框表示。MYB類逆境應答元件序列用波浪線表示。
圖2顯示的是啟動子CPIP與OsCPI1和OsCPI2兩個基因在水稻基因組(位於第一染色長臂，加紅框)中的位置關係。啟動子CPIP包含了OsCPI1和OsCPI2兩個基因各自的第一個外顯子以保證轉錄活性。
圖3顯示的是OsCPI1和OsCPI2基因能被多種逆境(乾旱、200mM/L NaCl、100μM/L ABA)誘導表達。
圖4是本發明構建的表達載體pCAMBIA1391Z-CPIP物理圖譜。該載體含潮黴素(HRG)抗性篩選基因，啟動子CPIP被融合到GUS基因5』端非翻譯區。引物CPIP-F/M13F若能擴增出約1900bp片段，即CPIP正向連入；否則CPIP被反向連入。
圖5顯示的是啟動子CPIP正向控制下的GUS基因在乾旱脅迫處理下的誘導表達。CPIP-GUS融合基因的水稻轉化植株乾旱進行處理後，按圖中標註的時間點取樣，Northern檢測GUS表達量的變化(A)並定量測定對應植株取樣點的GUS蛋白活性(B)。野生型植株(CK)與陽性轉化植株b是在土壤中乾旱脅迫；陽性植株a是在吸乾根部水分後暴露空氣中乾旱脅迫。
圖6顯示的是啟動子CPIP正向控制下的報告基因GUS轉基因水稻在高鹽(200mM/L NaCl)下葉片中GUS表達量(A)和GUS活性分析(B)。圖中CK為野生型對照，a、b為兩棵獨立轉化植株。
圖7顯示的是CPIP反向控制下的報告基因GUS轉基因水稻在乾旱、高鹽(200mM/L NaCl)脅迫下葉片中GUS表達量(A)和GUS活性分析(B)。ck1乾旱處理野生型植株；(a)乾旱處理轉化植株；ck2NaCl處理野生型植株；(b)NaCl處理轉化植株。
具體實施例方式
實施例1、啟動子CPIP分離和鑑定通過水稻品種「中旱5號」(由中國上海農業科學院提供的商業品種)的乾旱誘導基因表達譜分析，發現了一個受乾旱強烈誘導(乾旱脅迫後期表達量提高12倍以上)的cDNA，經序列分析確定該cDNA為一完整的全長cDNA編碼一個糜蛋白酶抑制子基因，在GenBank資料庫中登錄號為AY878695；為方便分析，把該基因命名為OsCPI1。用OsCPI1的DNA序列搜尋水稻基因組序列，在離該基因約1118鹼基對的位置存在一個序列相似性達82％的同源基因(命名為OsCPI2)，其轉錄方向與OsCPI1相反。在KOME資料庫(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中找到一個與該OsCPI2序列100％匹配的全長cDNA編號為AK062495。
在已知OsCPI1和OsCPI2是兩個轉錄方向相反且只間隔1118bp的基因的基礎上，下一步就是分離可能控制這兩個基因的共同啟動子。具體步驟如下根據OsCPI1全長cDNA序列在GeneBank中找到了對應的粳稻「日本晴」的基因組序列(GenBank登錄號為AP002866)並選取該基因的轉錄起始位點上遊2Kb的範圍作為候選啟動子區域進行PCR擴增。設計引物CPIP-F(GGATCCGCTTGCTGTCTGATGAACTC)和CPIP-R(GGATCCAAACAATCGAGAAGATCCAA)斜體下劃線表示添加的限制性酶切位點BamHI。首先利用引物CPIP-F、CPIP-R以日本晴基因組DNA(CTAB法抽提，參照Zhang等報導的方法genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)為模板進行擴增，反應條件是94℃預變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2mim，30個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1.2％瓊脂糖凝膠電泳挖膠回收後連入pGEM-T Easy載體上，篩選陽性克隆並測序(ABI3730測序儀，Applied Biosystem，測序在國家植物基因中心[武漢]完成)，結果證實所擴增序列為預期的後動子CPIP序列，其包含多個旱、ABA逆境應答順式作用元件(如圖1)。
實施例2、檢測水稻內源基因OsCPI1和OsCPI2的誘導表達以水稻品種「珍汕97」(一個中國廣泛推廣栽培的水稻品種)為材料，在3葉期分別進行乾旱、高鹽脅迫以及脫落酸(ABA)處理。乾旱處理是將水稻幼苗根部水分吸乾暴露於空氣中於0h，30min，2h，4h，6h取樣，高鹽脅迫是將土壤中種植的幼苗種灌澆200mM NaCl溶液中並在0h，3h，1h，3d後取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100μM ABA溶液中並在0h，30min，3h，6h，24h和72h後取樣。提取葉片的總RNA(Trizol試劑，Invitrogen)後進行RNA轉膜(參照J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002，北京)，並以OsCPI1、OsCPI2分別為探針做Northern雜交。結果表明，OsCPI1、OsCPI2均能被乾旱、高鹽和ABA誘導表達(如圖3)。
實施例3、啟動子CPIP乾旱誘導活性鑑定本發明的實施方案就是構建啟動子CPIP的GUS基因表達載體並轉化到水稻品種「中花11」(來自中國農業科學院作物研究所商業品種)中定量地檢測啟動子CPIP的乾旱誘導表達活性。具體操作如下首先將實施例1中分離的啟動子CPIP的PCR產物連入pGEM-T Easy載體(購自Promega公司)，轉化大腸桿菌DH10B(購自Promega公司)並藍白斑篩選陽性克隆。因為設計引物時在加入了BamHI酶切位點，通過單酶切連接將產物連入表達載體pCAMBIA1391Z(來自CAMBIA公開使用的載體，載體含有GUS報告基因)的多克隆位點獲得報告基因表達載體pCAMBIA1391Z-CPIP-GUS(推定其正向、反向均有可能實現)。通過酶切驗證陽性克隆確定片段連入載體中後，再通過pCAMBIA1391Z載體上的通用引物M13F與所設計引物CPIP-F(序列同實施例1)做PCR擴增反應，確定啟動子CPIP連入載體中的表達載體正、反方向性(詳見說明書附圖4)。將正、反兩方向報告基因表達載體分別通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系導入到水稻品種中花11中，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有潮黴素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因植株。農桿菌介導的水稻(粳稻亞種)遺傳轉化體系主要應用Hiei等人報導的方法(參見Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA，1994，Plant Journal 6271-282)基礎上進行優化。本發明的遺傳轉化的主要步驟、培養基及其配製的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青黴素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮黴素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞碸)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培養基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配製)硝酸鉀(KNO3) 28.3克磷酸二氫鉀(KH2PO4) 4.0克硫酸銨((NH4)2SO4) 4.63克硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85克氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66克將上述試劑逐一溶解，然後室溫下用蒸餾水定容至1000毫升。
2)N6培養基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配製碘化鉀(KI) 0.08克硼酸(H3BO3)0.16克硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.44克硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.15克將上述試劑在室溫下溶解並用蒸餾水定容至1000毫升。
3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配製)將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O分別溶解，混合併用蒸餾水定容至1000毫升，至70℃溫浴2小時，4℃保存備用。
4)維生素貯存液(按照100X濃縮液配製)煙酸(Nicotinic acid) 0.1克維生素B1(Thiamine HCl) 0.1克維生素B6(Pyridoxine HCl)0.1克甘氨酸(Glycine) 0.2克肌醇(Inositol) 10克加蒸餾水定容至1000毫升，4℃保存備用。
5)MS培養基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配製)硝酸銨(NH4NO3) 16.5克硝酸鉀 19.0克磷酸二氫鉀 1.7克硫酸鎂 3.7克氯化鈣 4.4克將上述試劑在室溫下溶解，並用蒸餾水定容至1000毫升。
6)MS培養基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配製)硫酸錳(MnSO4·4H2O) 2.23克硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.86克硼酸(H3BO3) 0.62克碘化鉀(KI) 0.083克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.025克硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025克氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.0025克將上述試劑在室溫下溶解，並用蒸餾水定容至1000毫升。
7)2，4-D貯存液(1毫克/毫升)的配製秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，於室溫下保存。
8)6-BA貯存液(1毫克/毫升)的配製秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升 蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，室溫保存。
9)萘乙酸(NAA)貯存液(1毫克/毫升)的配製秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升 蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，4℃保存備用。
10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1毫克/毫升)的配製秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升 蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，4℃保存備用。
11)葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配製秤取葡萄糖125克，然後用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌後4℃保存備用。
12)AS貯存液的配製秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分裝至1.5毫升離心管內，4℃保存備用。
13)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存備用。
(3)用於水稻遺傳轉化的培養基配方1)誘導培養基
N6max母液(取已經製備好的10X濃縮液，下同)100毫升N6mix母液(取已經製備好的100X濃縮液，下同) 10毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經製備好的100X濃縮液，下同) 10毫升維生素貯存液(取已經製備好的100X濃縮液，下同)10毫升2，4-D貯存液(取上述製備好的)2.5毫升脯氨酸(Proline) 0.3克CH 0.6克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口後按常規方法滅菌(例如121℃下滅菌25分鐘，下述的培養基滅菌方法與本培養基的滅菌方法相同)。
2)繼代培養基N6max母液(10X)100毫升N6mix母液(100X) 10毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 10毫升維生素貯存液(100X)10毫升2，4-D貯存液 2.0毫升脯氨酸0.5克CH0.6克蔗糖 30克Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
3)預培養基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X) 1.25毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液 0.75毫升CH0.15克蔗糖 5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。
4)共培養基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X) 1.25毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液 0.75毫升CH0.2克蔗糖 5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升/每皿)。
5)懸浮培養基N6max母液(10X)5毫升N6mix母液(100X) 0.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 0.5毫升維生素貯存液(100X)1毫升2，4-D貯存液 0.2毫升CH0.08克蔗糖 2克加蒸餾水至100毫升，調節pH值到5.4，分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入1毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。
6)選擇培養基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X) 2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液 0.625毫升CH0.15克蔗糖 7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，調節pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養基羧苄青黴素濃度為400毫克/升，第二次及以後選擇培養基羧苄青黴素濃度為250毫克/升)。
7)預分化培養基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X) 2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升6-BA貯存液0.5毫升KT貯存液 0.5毫升
NAA貯存液50微升IAA貯存液50微升CH 0.15克蔗糖 7.5克瓊脂粉 1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。
8)分化培養基N6max母液(10X)100毫升N6mix母液(100X) 10毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 10毫升維生素貯存液(100X)10毫升6-BA貯存液2毫升KT貯存液 2毫升NAA貯存液 0.2毫升IAA貯存液 0.2毫升CH1克蔗糖 30克Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸並用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
9)生根培養基MSmax母液(10X)50毫升MSmix母液(100X) 5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 5毫升維生素貯存液(100X)5毫升蔗糖 20克Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸並用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。
(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟3.1愈傷誘導(1)將成熟的中花11水稻種子去殼，然後依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)將接種後的培養基置於黑暗處培養4周，溫度25±1℃。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度25±1℃。
3.3預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養2周，溫度25±1℃。
3.4農桿菌培養1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基(LA培養基的配製參照J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002，北京)上預培養農桿菌EHA105(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株)兩天，溫度28℃；2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28℃搖床上培養2-3小時。
3.5農桿菌侵染1)將預培養的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；2)調節農桿菌的懸浮液至OD600.8-1.0；3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20℃。
3.6愈傷洗滌和選擇培養1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧苄青黴素(CN)的滅菌水中30分鐘；3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2-3次，每次2周。
3.7分化1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上於黑暗處培養5-7天；2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26℃。
3.8生根1)剪掉分化時產生的根；然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26℃。
3.9移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。
申請人採用構建的pCAMBIA1391Z-CPIP載體(圖4)轉化水稻。對產生的抗性植株進行乾旱、高鹽脅迫，通過檢測脅迫後的植株中GUS蛋白活性來評價啟動子CPIP受逆境脅迫誘導強度。其中高鹽處理是將培養水稻抗性植株的水培液中加入200mM NaCl；乾旱處理及取樣方法參照實施例2進行。水培培養液各元素濃度N40ppm；P10ppm；K40ppm；Ca40ppm；Mg40ppm；Mn0.5ppm；Mo0.05ppm；B0.2ppm；Zn0.01ppm；Cu0.01ppm；Fe2ppm。
將對照與脅迫後植株各時間點所取樣品在液氮中磨成粉末，分成兩管。一管抽提RNA(Trizol試劑，Invitrogen)，轉膜後以GUS基因為探針進行Northern雜交(方法同實施例2)來分析逆境脅迫後啟動子CPIP控制的報告基因的表達情況。對應另一管樣品通過GUS提取緩衝液(50mM Na2HPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na2EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提蛋白質，從樣品蛋白質提取物中取10μl進行GUS活性的定量分析。具體操作如下將10μl樣品蛋白質提取物+0.4mlGUS提取緩衝液+10μl 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl-β-D-glucuronide)在37℃水浴20min後，加入1.6ml反應終止液(0.2M Na2CO3)；DyNA Quant 200螢光計調零後，將50nM MU的滅光吸收值定為500作為參比，測出這2ml反應液反應所生成4-MU(4-methylumbelifferyl)的相對螢光吸收值，；然後對各樣品的總蛋白質通過Bradford法(參見A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding.1976，Anal Biochem，72248-254)進行濃度測量以便對各樣品的GUS活性相對值進行比較分析。綜合以上數據得出各個樣品的GUS活性的絕對值(pmol MU/min/mg protein)。
通過在p1391Z-CPIP轉化植株中GUS的Northern雜交和GUS蛋白活性測定發現，啟動子CPIP正、反兩方向均具備受乾旱和高鹽誘導表達活性。在p1391Z-CPIP正向轉化植株中，啟動子在乾旱脅迫下呈現梯度上升趨勢(附圖5)，高鹽脅迫6小時後，啟動子正向控制的GUS活性是脅迫前的三倍(附圖6)。同時，啟動子CPIP反向控制下的GUS表達量也受到乾旱、高鹽強烈誘導，轉化植株的GUS蛋白活性在乾旱脅迫下比脅迫前升高達到四倍，鹽脅迫後誘導量上升將近六倍(如附圖7所示)。
序列表110華中農業大學120逆境特異誘導雙向表達活性的水稻啟動子CPIP的鑑定和利用130
1412006-01-131601170PatentIn version 3.121012111893212DNA213水稻(Oryza sativa)220
221promoter222(1)..(1893)223
220
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220
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220
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220
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223
220
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220
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220
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220
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220
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220
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220
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222(578)..(584)223
220
221TATA_signal222(377)..(383)223
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221primer_bind222(1)..(20)223
4001gcttgctgtc tgatgaactc attctggtca cagcaaatta atgaagcaaa attcctgcaa 60atatagctag gattaatttg ttgttgtgta cacgcaaggc acttaattcg aaacactctt120tcatcaaatt aagatcagaa caggtactta caaccaattg aaactgcttg ctatcgagac180tgaaacgggt gttattgtcc agcagaatga tagatgctct attgatcgat tcttaagttg240tgtgtgcgtt tggtgtatga gggatggagt tgtgtggtgt atttataaga tgagaaaaga300agcaaaacgt gcaatttttc ggtgccgtta atggataggc ttcccagttt gctgagatga360gatatacttg tagacttatt aatccttctg gactcagaaa attcacggat gtaaagggtg420gcacgtgtgt gtggtggaga ctctactagt cagagaaaga aagtgtcaat ttgttaaggt480agtactcttc tgcatatacc acttggtgcc cagatttgca gaaaacgata tgattaataa540acattttaca ggtcaaattt acaatgtgca acgtggatat aaatatgatt cattggatca600tgccattgta acttcttcaa tactaaaata taccactaca atttatggaa ttttagacat660gcttaattta ataggtattt caaatatgcc actacatgtg tatttcttcg atgaaccaac720ttgtccatgt cttctttttt ttttttcatc ccctcctcct gttcatcttc tgcaccatta780ccatcagaga tggactcggc cagttatcag catggagcta tagcttagag cagcactgca840gcaggcagcc aaatccatcc aagcttgttg ccgctgcctg ttaaatgcat cgaatagcta900agcactgaca tatcactaat gcttattttt ggttctacca tgattatggt ttcatttcct960ctctgcgcca catagctact actattattt agctcgaaat taattaaatc ttcctagctc 1020caaatgcgtt tagaagaatt aattatactc agctctatat gtgcaaggtt catcgtcaaa 1080attcaaatct gcaacccaca agtagccacg caccatatgg ccaaatgtcc ccatgtccaa 1140atcgttgaat atgcatccaa caacccctct acacgtgggt gcacatgcat gaagattgaa 1200
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1.一種被乾旱或鹽誘導並具有雙向誘導表達活性的啟動子CPIP，它的核苷酸序列如SEQID NO1所示。
2.權利要求1所述的啟動子CPIP，它是SEQ ID NO1所示1-1893位鹼基所示的序列。
3.權利要求1或2所述的啟動子CPIP的全部或部分序列構建的植物表達載體。
4.權利要求3所述的植物表達載體為啟動子CPIP的全部序列。
5.權利要求4所述的植物表達載體，該載體是pCAMBIA1391Z-CPIP。
6.權利要求1或2所述的啟動子CPIP在培育抗逆植物中的應用。
7.權利要求6的應用，其中包括在培育耐旱或抗鹽植物中的應用。
8.權利要求6或7的應用，其中包括在培育耐旱或抗鹽水稻中的應用。
全文摘要
本發明屬於植物基因工程技術領域。從水稻(Oryza Sativa L.)中分離克隆並鑑定了一種被乾旱或鹽誘導並具有雙向誘導表達活性的啟動子CPIP，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，能同時控制兩個糜蛋白酶抑制子基因。由啟動子CPIP在正反方向控制的糜蛋白酶抑制子基因都能特異性地對乾旱、鹽脅迫和對脫落酸(ABA)起應答反應，所述的啟動子區域含有多個逆境應答順式作用元件。將啟動子CPIP以正反兩個方向分別控制GUS報告基因轉化水稻，GUS轉基因在乾旱、鹽脅迫時都能強烈地誘導表達。本發明還公開了利用該啟動子構建逆境特異誘導的遺傳轉化載體以及通過農桿菌介導方法培育耐鹽、抗旱等抗逆植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1807629SQ20061001815
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月13日 優先權日2006年1月13日
發明者熊立仲, 黃越敏 申請人:華中農業大學