用沼液製備生物藥肥的方法

2023-06-21 21:57:16

專利名稱：用沼液製備生物藥肥的方法
技術領域：
本發明涉及一種用沼液製備生物藥肥的方法。屬於農業廢棄物綜合利用領域。
背景技術：
據統計，截至2005年底，我國共有沼氣池1700萬個，年產沼氣65億m3，到2010年，
全國規模化養殖場大中型沼氣工程總數達4700處左右，而截至2008年，僅江蘇省規模化養 殖場已達14萬個，其中大型養殖場4700多個，養殖場的沼氣工程有1000多處，池容在IOOm3 以上的工程有300多處，且80%建在養豬場。畜禽糞便經沼氣工程實現能源化的同時產生 了體積龐大的沼液，如此大量沼液的安全、合理、高效利用必將成為全社會密切關注和亟待 解決的問題。在高效農業發展中，病蟲害發生日趨嚴重，常規的物理、化學防治效果不斷降低， 且化學防治也因環境汙染和食品安全問題逐漸受到限制。因此，亟待尋找安全、高效防治病 蟲害的途徑。國內外的研究和應用表明，沼液作為一種營養豐富的液體肥料，具有「藥肥」 合一的功效對許多植物病原真菌有明顯的生長抑制作用，使用沼液替代化肥和農藥，可減 少20%以上的化肥和農藥施用量，並顯著降低進某些病害的發生率，可以發展成一種替代 化學農藥防治某些植物病害的有效手段。大量的文獻提及沼液含有豐富的有效礦質養分、胺基酸、維生素和激素等活性物 質，並且把沼液對病蟲害的防治作用歸結於其促進作物生長從而間接提高了作物的抗病性 或者歸結為沼液中的抗菌物質起到防病作用，但在廣泛的應用後發現沼液對病害防治效果 穩定性、重複性差。因此，為了提高沼液的肥料及對病蟲害防治效果，前人通過在沼液中添 加化學肥料、農藥、或與其他有機、無機物質復配等方法開展了許多研究。管莉菠等研究報 道將沼液分別與5種化學農藥復配後對小麥葉枯病菌的抑制作用顯著增強。Liu等研究報 道在沼液中強化胺基酸後施用於萵筍明顯降低了萵筍中硝酸鹽的含量。國內以沼液為原料製備肥料或農藥的專利有專利申請號為200510084342. 7的 專利文獻記載的是在沼液中添加硫酸鉀、磷酸二銨、尿素等基本肥料成分和微量元素製備 防治病蟲害的葉面肥；而專利申請號為200810033989. 0的專利文獻記載的是在沼液中 加入煤油0. 16% 0. 3%，洗衣粉0. 04% 0. 製備無公害沼液殺蟲液；專利申請號為 200610106682. X的專利文獻記載的是在沼液中添加萃取的中草藥中的有效毒素製成有 防病效果的葉面肥。而專利申請號為200610031565. 1的專利文獻記載的是在沼液中復配 複合胺基酸粉、乳酸製成一種多效植物防病營養液；還有專利是利用沼液、酒精廢水、味精 廢水製備發酵培養基，以灰色鏈黴菌或乳黃色細菌為菌種，經過發酵及過濾、濃縮、提純制 得生物農藥，(包括專利申請號=200610053322. 8)；申請專利號為200810060161. 4的專利 文獻記載的是在沼液中加入廣譜性殺菌劑及輔料，生產的藥肥能有效防治多種農作物病 害；專利申請號為200810058461. 9的專利文獻記載的是將硅藻土與沼液中混合均勻後得 到具有殺蟲效果的液體有機肥。總觀以上材料可以看出；所有的公開專利文獻都是在沼液中添加化學肥料、農藥或其他營養成分或殺菌物質來生產獲得具有促生長、防病蟲作用的液體肥料或生物農藥， 還沒有通過在沼液中強化來源於沼液、對常見多種作物病害具有較好防治效果的廣譜拮抗 微生物製備生物藥肥的專利和文獻報導。雖有不少應用表明施用沼液可以減輕許多作物病蟲害的發生，也有文章報導沼液 對許多植物病原菌有生長抑制作用，但對沼液中含有的拮抗微生物的研究鮮見報導，而這 些微生物可能在沼液的抑菌、防病功效中發揮著重要作用。

發明內容
本發明的目的在於針對目前沼氣工程大量建設、沼液產生量不斷增加，而沼液作 為一種營養豐富的生物藥肥，在農業生產上應用效果不穩定、對病害防治效果較低以及防 病範圍窄等問題，提出通過添加複合、廣譜拮抗芽孢細菌，製備防病功能增強的生物藥肥。為了實現上述目的，江蘇省農科院通過對江蘇省運行穩定的20多個沼氣工程採 樣、分析、研究發現，所有沼液對草莓枯萎病菌的菌絲生長都有不同程度的抑制作用，但沼 液的無菌濾液或沼液經輻照滅菌後對草莓枯萎病菌沒有生長抑制效果，由此初步推斷，沼 液中的微生物是沼液抑菌防病的主要因子。隨後，從多個以牛糞或豬糞為原料的沼液中分 別分離到了多株數量上佔優勢的芽孢細菌，並將這些芽孢細菌分別與生產上常見的十多種 病原菌進行了平板對峙培養實驗，結果表明分離到的多株芽孢細菌對病原菌的生長抑制 效果與相應沼液的生長抑制效果相一致，說明分離到的芽孢細菌在沼液的抑菌功能中發揮 主要作用。根據我們研究的初步結果，可以在沼液中強化來源於沼液並對常見植物病原菌有 生長抑制作用並對作物病害有良好防效的微生物，從而提高沼液抑菌防病的效果並拓寬其 殺菌防病的範圍，不但解決了沼液的高端利用問題，而且對全國沼氣工程的進一步擴大推 進、實現農業廢棄物的循環利用以及保護和改善農村生態環境具有重大意義。本發明的目的是這樣實現的一種用沼液製備生物藥肥的方法，以沼液為主體原 料，其特徵在於將沼液過120目篩，加入拮抗芽孢細菌製備的複合微生物菌劑，製成生物 藥肥，所述的生物藥肥中，拮抗芽孢細菌的數量達到5 6X IO7CFU/毫升，所述的拮抗芽孢 細菌為土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。在本發明的製備方法中，土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌在複合微生 物菌劑中的數量分別為4 8X IO9CFU/克、2 4X IO9CFU/克和2 4X IO9CFU/克。在本發明的製備方法中，所述的土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌是由 大型沼氣工程的沼液中分離獲得。在本發明的製備方法中，沼液中N P2O5 K2O的養分含量質量比，為1 0. 5 0. 8 0. 8 1. 2。在本發明的製備方法中，用45%的硫酸鉀複合肥或45%的氯化鉀複合肥或尿素 或它們的組合，將沼液中N P2O5 K2O的養分含量質量比調節到1 0.5 0.8 0.8 1. 2。在本發明的製備方法中，所述複合微生物菌劑的製備方法為分別對土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌進行純培養，獲得三種獨立的 液體純培養物；
將所述的各液體純培養物分別與過60目篩的沸石混合，各液體純培養物與沸石 的體積/重量比均為20 30% ；將混合後的混合物自然風乾或30°C烘乾後過40目篩，即獲得三種分別吸附不同 芽孢細菌的固體微生物菌劑，每個固體微生物菌劑中的含菌量為1 2X109_1(lCFU/g ；將吸附有土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的固體微生物菌劑按 2:1: 1的重量比混合均勻，形成複合微生物菌劑。在本發明的製備方法中，分別對土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌進行 純培養，獲得三種獨立的液體純培養物是指分別將三種芽孢細菌接種到各自的試管斜面 培養基中進行活化培養，再將斜面培養好的三個菌株分別接種到對應的容量為250ml且裝 有80ml液體種子培養基的三角瓶中，將三角瓶置於轉速180r/min、溫度為28 士 2°C的搖床 上培養24 36小時，然後再以體積比5 10%的接種量分別接入到容量為2000ml且裝有 800ml液體生產培養基的大三角瓶中，將大三角瓶置於轉速160r/min、溫度為28士2°C的搖 床上培養72 96小時，顯微鏡檢查芽孢形成率大於95%時即可結束培養，獲得三種含有不 同芽孢細菌的液體純培養物。在本發明的製備方法中，所述的試管斜面培養基為牛肉膏3克，蛋白腖10克，氯 化鈉5克，溶解在1000毫升水中，調節pH 7. 4 7. 6，瓊脂15 20克；所述的液體種子培養基為牛肉膏3克，蛋白腖10克，氯化鈉5克，溶解在1000毫 升水中，調節PH 7. 4 7.6 ；所述的液體生產培養基包括土芽孢細菌的液體生產培養基和解澱粉芽孢桿菌及 枯草芽孢桿菌的液體生產培養基，所述土芽孢細菌的液體生產培養基為酵母粉4. 5 5. 5 克，豆粕4 5克，K2HPO4為8 9克，溶解在1000毫升水中，調節pH 7. 4 7. 6，瓊脂15 20克；所述解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的液體生產培養基為酵母粉6克，蛋白腖6 克，NaCl 3克，K2HPO4O. 2克，溶解在1000毫升水中，調節pH 7. 0 7. 6。本發明的優點在於本發明以大量廉價易得的沼液為原料，製備的生物藥肥除了 含有多種作物生長所必須的氮、磷、鉀、胺基酸、有機酸及其他其他礦物元素外，還含有三種 外源加入的對常規作物病害有顯著防治效果的拮抗芽孢細菌，製備的生物藥肥功能更加明 確，靶標性更強，效果更加穩定；另外，這三種芽孢細菌均分離自沼液，菌株本身已經適應了 沼液中的物理(如氧化還原電位)、化學(高COD)和營養環境(如高氨態氮含量)，添加到 沼液中不會由於沼液的特殊環境引起菌株的死亡和功能退化，並且在施用到田間後與沼液 有更好的協同增效作用；整個製備過程設備、工藝簡單，易於操作；施用後能顯著改良土壤 質量、平衡土壤養分及豐富土壤微生物的種群結構，發揮對作物促生、防病的效果，從而減 少化肥、農藥的使用量，為資源循環利用、環境保護及農產品的安全生產開闢新的思路。本發明的優點還在於這三個菌株在液體純培養狀態下，均能分泌多種抗菌物質， 如抗菌蛋白、小分子抗生素等；而且分泌的小分子抗生素經100°C處理30分鐘仍然有生物 活性，具有極好的溫度穩定性；試驗證明三種芽孢細菌製備的複合微生物菌劑對生產中 常見的枯萎病菌、疫黴病菌、立枯病菌、黃萎病菌、菌核病菌、灰黴病菌等十多種病原真菌和 青枯病菌、潰瘍病菌、根腫病菌等病原細菌有強烈的生長抑制作用，為廣譜拮抗細菌。
具體實施例方式實施例1三個芽孢細菌菌株的獲得及菌株特性沼液取自南京山田奶牛場沼氣工程。採集沼液8 10毫升於25毫升試管中， 將試管放在80°C水浴中加熱15分鐘後取出冷卻至室溫，在無菌狀態下，吸取200微升沼 液加到直徑9釐米的培養皿中，再迅速加入20毫升、55-60°C的PDA培養基，二者充分混 合後放置等到培養基完全凝固，再向培養皿中加入15毫升、55 60°C的PDA培養基，水 平輕輕搖勻後水平放置，再等到培養基完全凝固，在培養基上均勻接種5個直徑為7毫 米、新鮮的草莓枯萎病菌菌絲塊，將培養皿置於28士2°C培養4 5天，用接種環挑取產 生抑菌圈的菌落2環接種在250毫升、盛有80毫升NB液體培養基的三角瓶中，將三角 瓶置於轉速160r/min、溫度為28士2°C的搖床上培養20 24小時，將培養物在轉速為 6000r/min下離心15分鐘，去掉上清液，收集菌體，採用OMIGA公司生產的專門用於細 菌DNA提取的試劑盒Bacterial DNA Kit，提取獲得細菌16SrDNA，再採用細菌通用引物 27f(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，1492r(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)進行 16S rDNA的PCR擴增，將PCR產物進行鹼基序列測定，獲得16S rDNA的鹼基序列，然後即可 登陸GENBANK，輸入鹼基序列進行BLAST查詢，獲得序列號分別為NC013406、NC009725、 ABQN01000001的菌株就分別是本發明中的土芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。該實施例中的PDA培養基配製方法為馬鈴薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，瓊脂 15-20克，水1000毫升，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然後用2層紗布過濾，再 加糖及瓊脂，溶化後補足水至1000毫升，121°C高壓滅菌20min。該實施例中的NB培養基配製方法為牛肉膏3克，蛋白腖10，氯化鈉5克，溶解在 1000毫升水中，調節pH 7. 4 7. 6，然後分裝，裝液量為80/250ml三角瓶，用棉塞塞好瓶 口，121°C高壓滅菌25min，冷卻後備用。草莓枯萎病菌可以從中國科學院微生物菌種保藏中心自行引進。實施例2三個芽孢細菌培養基的配製試管斜面培養基的配製稱取牛肉膏3克，蛋白腖10克，氯化鈉5克，溶解在1000 毫升水中，調節PH 7. 4 7. 6，加入瓊脂15 20克，加熱煮沸至瓊脂溶化，補足體積至 1000毫升，適當冷卻後分裝到試管中，裝量為試管高度的1/5 1/6，用試管塞塞好試管口， 121°C高壓滅菌25min，趁熱取出後擺斜面至冷卻備用，斜面高度不超過試管高度的1/3。液體種子培養基的配製牛肉膏3克，蛋白腖10，氯化鈉5克，溶解在1000毫升水 中，調節pH 7. 4 7. 6，然後分裝，裝液量為80/250ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121 °C高壓 滅菌25min，冷卻後備用。土芽孢細菌液體生產培養基的配製酵母粉20克，豆粕18克，K2HPO4為34克，溶 解在4000毫升水中，調節pH 7. 4 7. 6，然後分裝，裝液量為800ml/2000ml三角瓶，用棉塞 塞好瓶口，121°C高壓滅菌25min，冷卻後備用。所述的解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的液體生產培養基的配製酵母粉24克， 蛋白腖24克，NaCl 12克，K2HPO4O. 8克，溶解在4000毫升水中，調節pH 7.0 7.6。然後分 裝，裝液量為800ml/2000ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121 °C高壓滅菌25min，冷卻後備用。
實施例3 複合微生物菌劑的製備分別將實施例1中的三種芽孢細菌的保藏菌種接種到試管斜面培養基中進行試管斜面活化，然後，用接種環將活化好的菌種接種到裝有80ml液體種子培養基的250ml三 角瓶中，將三角瓶置於搖床培養24小時，搖床的轉速160r/min，培養溫度為28士2°C ；結束 後以5%接種量(V/V)接入裝有800ml液體生產培養基的2000ml三角瓶中，將三角瓶置於 搖床培養，搖床的轉速160r/min，培養溫度為28士2°C，培養3 4天後顯微鏡檢查芽孢的 形成率在95%以上時即可結束培養；將各個芽孢細菌的液體培養物以20 30%的體積/ 重量比均勻噴灑在過60目篩的沸石中，自然風乾或30°C烘乾，過40目篩，即獲得三種分別 吸附不同芽孢細菌的固體微生物菌劑，每種固體菌劑中的含菌量為1 2X109_1(lCFU/g ；再 根據三種微生物菌劑的實際含菌量，將三種菌劑按一定比例混合，最後使得複合菌劑中土 芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的數量分別為4 8X IO9CFU/克、2 4X IO9CFU/ 克、2 4X IO9CFU/ 克。實施例4複合微生物菌劑對病原真菌和病原細菌的生長抑制作用所有參加試驗的病原真菌和病原細菌都可以從中科院微生物菌種保藏中心獲得。 將所有參加試驗的病原真菌接種到PDA平板中，28-30°C培養5天後用打孔器打孔獲得直徑 4毫米的菌絲塊備用。將所有參加試驗的病原細菌接種到試管斜面培養基中進行試管斜面 活化後用無菌水做成2 X IO7CFU/毫升的菌懸液備用。對病原真菌的抑制作用分別將實施例1中的三種芽孢細菌的保藏菌種接種到試 管斜面培養基中進行試管斜面活化，然後，用接種環將活化好的三個菌株分別接種在直徑9 釐米的PDA平板培養基一側的中間，菌斑直徑5毫米左右，在平板的另一側的中間分別接種 新鮮培養的直徑4毫米的病原真菌的菌絲塊，28-30°C培養5天-7天，觀察抑菌帶的有無或 抑菌帶的寬度。對病原細菌的抑制作用用接種環將活化好的三個芽孢細菌菌株分別接種在直徑 9釐米的PDA平板培養基正中間，菌斑直徑5毫米左右，在平板的其餘部分用塗棒分別塗上 病原細菌的菌懸液，28 30°C培養2 3天，觀察抑菌帶的有無或抑菌帶的寬度。表1複合微生物菌劑對病原真菌和病原細菌的生長抑制作用(表中數據為抑菌帶寬度，單位毫米)
權利要求
1.一種用沼液製備生物藥肥的方法，以沼液為主體原料，其特徵在於將沼液過120目 篩，加入拮抗芽孢細菌製備的複合微生物菌劑，製成生物藥肥，所述的生物藥肥中，拮抗芽 孢細菌的數量達到5 6X IO7CFU/毫升，所述的拮抗芽孢細菌為土芽孢菌、解澱粉芽孢杆 菌和枯草芽孢桿菌。
2.根據權利要求1所述的用沼液製備生物藥肥的方法，其特徵在於土芽孢菌、解澱 粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌在複合微生物菌劑中的數量分別為4 SXlO9CFU/克、2 4 X IO9CFU/ 克和 2 4 X IO9CFU/ 克。
3.根據權利要求2所述的用沼液製備生物藥肥的方法，其特徵在於所述的土芽孢菌、 解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌是從大型沼氣工程的沼液中分離獲得。
4.根據權利要求1或2或3所述的用沼液製備生物藥肥的方法，其特徵在於用45% 的硫酸鉀複合肥或45%的氯化鉀複合肥或尿素或它們的組合，將沼液中N P2O5 K2O的 養分含量質量比調節到1 0.5 0.8 0.8 1.2。
5.根據權利要求1或2或3所述的用沼液製備生物藥肥的方法，其特徵在於所述復 合微生物菌劑的製備方法為分別對土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌進行純培養，獲得三種獨立的液體 純培養物；將所述的各液體純培養物分別與過60目篩的沸石混合，各液體純培養物與沸石的體 積/重量比均為20 30% ；將混合後的混合物自然風乾或30°C烘乾後過40目篩，即獲得三種分別吸附不同芽孢 細菌的固體微生物菌劑，每個固體微生物菌劑中的含菌量為1 2X109_1(lCFU/g ；將分別吸附有土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的固體微生物菌劑按 2:1: 1的重量比混合均勻，形成複合微生物菌劑。
6.根據權利要求5所述的用沼液製備生物藥肥的方法，其特徵在於分別對土芽孢菌、 解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌進行純培養，獲得三種獨立的液體純培養物是指分別將 三種芽孢細菌接種到各自的試管斜面培養基中進行活化培養，再將斜面培養好的三個菌株 分別接種到對應的容量為250ml且裝有80ml液體種子培養基的三角瓶中，將三角瓶置於轉 速180r/min、溫度為28士2°C的搖床上培養24 36小時，然後再以體積比5 10%的接 種量分別接入到容量為2000ml且裝有800ml液體生產培養基的大三角瓶中，將大三角瓶置 於轉速160r/min、溫度為28士2°C的搖床上培養72 96小時，顯微鏡檢查芽孢形成率大於 95%時即可結束培養，獲得三種含有不同芽孢細菌的液體純培養物。
7.根據權利要求6所述的用沼液製備生物藥肥的方法，其特徵在於所述的試管斜面培養基為牛肉膏3克，蛋白腖10克，氯化鈉5克，溶解在1000毫升水 中，調節PH 7. 4 7. 6，瓊脂15 20克；所述的液體種子培養基為牛肉膏3克，蛋白腖10克，氯化鈉5克，溶解在1000毫升水 中，調節PH 7. 4 7. 6 ；所述的液體生產培養基包括土芽孢細菌的液體生產培養基和解澱粉芽孢桿菌及枯草 芽孢桿菌的液體生產培養基，所述土芽孢細菌的液體生產培養基為酵母粉4. 5 5. 5克， 豆粕4 5克，K2HPO4為8 9克，溶解在1000毫升水中，調節pH 7. 4 7. 6，瓊脂15 20 克；所述解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的液體生產培養基為酵母粉6克，蛋白腖6克，NaCl 3克，K2HPO4O. 2克，溶解在1000毫升水中，調節pH 7. 0 7. 6。
全文摘要
本發明涉及一種用沼液製備生物藥肥的方法，以沼液為主體原料，其特徵在於將沼液過120目篩，加入拮抗芽孢細菌製備的複合微生物菌劑，製成生物藥肥，所述的生物藥肥中，拮抗芽孢細菌的數量達到5～6×107CFU/毫升，所述的拮抗芽孢細菌為土芽孢菌、解澱粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。
文檔編號C05F11/08GK102001869SQ201010512670
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月20日 優先權日2010年10月20日
發明者常志州, 張建英, 徐躍定, 馬豔 申請人:江蘇省農業科學院