鹽穩定化酶製劑的製作方法

2023-09-19 18:28:15

專利名稱：：鹽穩定化酶製劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及酶溶液轉化為固體酶製劑的方法，該方法使乾燥收率、及貯存和加工穩定性均得以改善。酶的應用領域很廣，因此酶在當代科學技術中越來越重要。然而這些化合物的主要缺點之一是其容易失活，不但加工時的極端溫度、pH等條件引起失活，而且在其它條件都正常時長期貯存也導致其自發失活。本技術中已知的減輕該問題的應用方法包括在酶的溶液中加入各種添加劑使酶穩定化，或採用冷凍乾燥、噴霧乾燥或適於該目的的其它技術將酶溶液轉化為幹製劑。當應用要求那樣時通常需要將酶溶液轉化為幹製劑(例如適當地與其它幹組分混合)。儘管乾燥法實質上對於改善酶的貯存穩定性是有效方法，但乾燥處理過程中常引起很大程度的活性損失而使終產品仍易於失活。在貯存或加工期間的這種活性損失強烈地依賴於製劑的含溼量，因此，需要最嚴格地控制含溼量以維持如此重要的產品的穩定性。這還包括為了統一標準或其它目的嚴格減少適於加入最終酶產品的化合物的選用。在很多情況下，幹的酶在應用中必須混入含溼量不能如此嚴格地控制的製品中。這些情況下酶的穩定性急劇降低。在乾燥及後續的貯存與加工期間對酶進行穩定化以防活性損失方面已出現了一些發明。這些發明的大多數(如專利(申請)US3515642，EP0501375A1及WO91/14773中提出的)涉及往酶濃縮物中加入糖類(具體地說是糖或多元醇組分)。本技術中已知的方法還有往製劑中加入某些組分使得在貯存溫度下生成玻璃態產物，於是提高酶的穩定性(EP0383569A2)。另一個方法是往製劑中加入一種或數種可結合水分的組分。它將降低最終製劑中水的活力或暫時防止從周圍環境滲入的水與酶相互作用。應用有機和無機鹽作加工助劑(如改善產品的流動性)或填充劑/標定試劑是人們熟知的方法。但是，應用無機鹽提高幹的酶製劑在加工或貯存期間的穩定性在本技術中看來還沒有報導。在某些情況下由於加入鹽而造成的酶的去穩定作用卻被明確提及(例如參見Mikhailova等，1989，VestsiAkadNavukBSSR，SerBiyalNavuk662-65)。EP0522269A2中公開了往有待噴霧乾燥的酶溶液中加入不溶性的碳酸鈣。WO92/11347中公開了往含酶的顆粒中混入水溶性無機鹽。該水溶性無機鹽必須是不影響酶顆粒的貯存穩定性。WO92/11347提出了適合於該目的的數種鈉鹽和鉀鹽。但是應在擠出造粒之前將該水溶性無機鹽以乾燥狀態加入酶中。本發明提出了生產具有較高的乾燥收率及所得產物的較高的貯存和加工穩定性的固體酶製劑的方法。該方法的實施如下配製含酶及水溶性無機鹽(優選是二價陽離子的無機鹽，更優選是鋅、鎂或鈣鹽，最優選是硫酸鋅或鎂)的溶液；接著將該溶液乾燥。混合的鹽及混合的酶也可用於此目的。二價陽離子是優選的，因為它們提供最佳貯存及加工穩定性。作為陰離子的硫酸根是優選的，因為它賦予最高的乾燥收率。本發明還提出按下列方法製備的固體酶製劑，即製備含酶及水溶性無機鹽(優選是二價陽離子的無機鹽，更優選是鋅、鎂或鈣鹽，最優選是硫酸鋅或鎂)的溶液；然後將包括該酶及該水溶性無機鹽的溶液乾燥。在本發明的方法中，當酶仍處於溶液中時、即在乾燥之前鹽就存在了。這不但導致乾燥時更高的收率，而且所得幹的酶製劑的貯存穩定性及其加工穩定性也得到了提高。此處的加工穩定性是指酶製劑在除貯存以外的任意加工過程中的穩定性，例如將酶製劑與其它組分混合時或酶的應用期間。含酶及鹽的溶液乾燥後會形成酶及鹽分布均勻的固體組合物。含酶及鹽的溶液的乾燥可用技術人員能利用的任意乾燥方法來實施，例如噴霧乾燥、冷凍乾燥、真空乾燥、流化床乾燥，以及微波乾燥。酶-鹽溶液的乾燥也可結合粒化方法，該方法包括，例如流化床或多級乾燥機(MSD)的應用。至於應用這些粒化方法，技術人員將明白所得組合物不必是完全均勻的。所得顆粒通常將包括均勻顆粒的聚集物或者有均勻核心和均勻包被的包被顆粒及/或其組合。任何情況下都會存在酶與鹽的相互均勻分散。本發明的具體實施例證實鹽的穩定效果隨著鹽在酶溶液中用量的增加而增大，直至某一點後進一步增加鹽的用量不再提高酶的穩定性。基於該原因，應加入至少5％、優選是至少15％、更優選是至少30％、還要更優選的是至少60％、最優選是至少90％(w/w)的鹽於酶溶液中，其中鹽的用量表示成加入的鹽基於溶液中的酶的重量百分比(w/w)，不包括結晶鹽中結晶水的重量。儘管從本發明來看鹽的加入沒有上限，但鹽在酶濃縮物中的最大溶解度使之有物理限度。因此只能通過稀釋酶溶液或應用鹽的複合物來實現較高的鹽/酶比。另一需考慮的要點可能是酶被「鹽析」時的用量，這取決於鹽的類型及所考慮的特定的酶。本發明不排除引起「鹽析」現象的鹽和酶的複合物。本發明可用於任何類型的酶或酶的混合物，包括但不局限於植酸酶及其它的磷酸酶、澱物酶、蛋白酶、脂肪酶及磷脂酶、纖維素酶如β-葡聚糖酶、果膠酶、半纖維素酶如木聚糖酶及其它的植物細胞壁降解酶、酯酶、粗製凝乳酶如真菌蛋白酶或凝乳酶、以及β-半乳糖苷酶。應注意，每當談到「酶」或「一種酶」時，這些術語也包括酶的混合物，而不考慮這類混合物是從單一發酵直接得到的、還是從不同的發酵中得到的酶混合而成的；還包括重組生物體的發酵得到的酶。酶優選選自真菌植酸酶、真菌半纖維素酶、真菌纖維素酶及細菌蛋白酶。酶更優選地選自從屬於Raper和Fennell定義的(1965，InTheGenusAspergillus，TheWilliamsWilkinsCompany，Baltimore，pp293-344)黑曲酶(Aspergillusniger)類型的真菌得到的植酸酶及內切木聚糖酶、從木黴菌屬(Trichoderma)菌種得到的β-葡聚糖酶及內切木聚糖酶、以及從芽胞桿菌屬(Bacillus)菌種得到的蛋白酶。本發明還公開了包括至少一種酶及一種無機鹽的固體組合物，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％(w/w)。無機鹽優選是二價陽離子的鹽，更優選是鋅、鎂或鈣鹽，最優選是硫酸鋅或鎂。無機鹽在組合物中的用量至少是酶重量的5％(w/w)、優選至少是15％，更優選至少是30％，還要更優選的是至少60％以及最優選的是至少90％。可製成本發明的組合物的酶包括上述的所有那些酶、尤其是那些優選的酶。在本發明的另一個實施方案中，上述固體組合物被用於製備動物飼料。動物飼料的製備常包括造粒步驟，在此期間酶活性會大量降低。應用本發明的固體組合物會減少造粒期間酶活性的損失。典型的動物飼料組合物包括供給能量的植物來源原料及有助於生長的代謝物。飼料中添加礦物質及維生素，並且通常把動物脂肪及動物蛋白加入飼料中。在本發明的又一個實施方案中，公開了包括具有改善了的貯存穩定性的植酸酶的固體組合物。固體組合物中植酸酶的貯存穩定性是這樣的在30℃下、優選是在密閉容器中、貯存8周期間，初始植酸酶活性的損失少於35％、優選少於20％、更優選少於10％且最優選少於5％。植酸酶組合物可以包括生理上可接受的有機或無機載體(例如基於穀類的載體如粗麥粉、小麥麵粉、稻殼等等，其它的有機載體如木薯澱粉、馬鈴薯澱粉、蔗糖等等，無機載體如氯化鈉、硫酸鉀、二氧化矽等等)，以及植酸酶，為了官能性或方便的緣故可能混有其它酶，以及進一步改善產品的外觀或官能性如顏色、流動性、物理、化學或微生物穩定性、氣味、味道、粉塵形成等等的試劑。技術人員會明白除了植酸酶外還可製備用作飼料酶的類似組合物。提出下述實施例作為對本發明的闡述。實施例實施例1將含大約11wt％的酶的真菌植酸酶濃縮物(Gistbrocades生產並提供)分為兩份。在其中的一份中加入240g/l的MgSO4·7H2O。待鹽溶解後得澄清溶液。將兩份溶液用Buchi試驗規模噴霧乾燥機噴霧乾燥，乾燥機入口溫度為130℃、出口溫度為85℃。將所得粉狀物與粗麥粉以1∶10的重量比混合以抵銷兩份製劑間存在的水分活度的任何差異。平衡後通過測定水份活度即可證實這一點，測得二者在室溫下水分活度為0.45。然後將終產物於30℃下貯存於密閉的罈子裡，貯存後同時分析產物的酶活性。貯存8周之後，未加鹽的製劑的活性損失達35％，而加鹽的製劑只損失5％。實施例2在兩份大約含12wt％的酶蛋白質的由芽胞桿菌得到的鹼性蛋白酶濃縮物(GenencorInternationalInc.生產並提供)中，分別溶解0和85g/l的MgSO4·OH2O。然後用NiroSTREA-1實驗室規模流化床塗布機將這些濃縮物塗到硫酸鈉載體上。該處理過程的活性損失分別為28％和14％。將所得顆粒與過量的含漂白劑的歐洲市場上的商品化洗滌劑粉混合後，置於開口罈子內，於35℃及55％的相對溼度下保溫。貯存6周後，加鹽和未加鹽的製劑的殘餘酶活性分別為42％和30％。實施例3將240g/l的MgSO4·7H2O溶於一份總的乾物質含量為25wt％、含β-葡聚糖酶及內切木聚糖酶、由木黴菌屬得到的酶濃縮物(Gist-brocades生產並提供)中。將所得溶液及原濃縮物用GlattWSG-60流化床塗布機分別塗到硫酸鈉載體上。該處理過程中加鹽的酶濃縮物中β-葡聚糖酶和內切木聚糖酶的活性損失分別為5％和10％，而未加鹽的酶濃縮物中兩種酶的活性損失分別為10％和25％。將所得顆粒在30℃及62％的相對溼度下保溫。貯存12周之後加鹽和未加鹽的酶製劑中β-葡聚糖酶活性損失分別為10％和不能檢出的，而內切木聚糖酶活性損失分別為10％和25％。還將該顆粒與飼料混合物摻混並於70℃下進行中試規模的造粒處理。加鹽和未加鹽的顆粒中β-葡聚糖酶的活性損失分別達46％和59％、而內切木聚糖酶的活性損失分別為37％和66％。造粒處理中應用的飼料混合物組成如下成分％(w/w)玉米50.00豌豆(22.9％粗蛋白質)3.50脫脂黃豆(45.5％粗蛋白質)28.00木薯澱粉2.38動物粉(58％粗蛋白質)3.60魚粉(72.7％粗蛋白質)1.00水解羽毛粉1.00豆油1.75動物脂肪3.50維生素/礦物質預混合物3.15石灰石0.86磷酸一鈣0.96氯化鈉0.30實施例4將不同量的硫酸鎂各溶於100ml的軟化水中，然後各加入100ml的約含17wt％純酶的真菌植酸酶濃縮物(Gist-brocades生產並提供)。混勻後用實驗室規模Buchi900MiniSprayDryer將所得溶液噴霧乾燥，乾燥機的入口/出口溫度各為140和80℃。將所得顆粒與粗麥粉以1∶9的比率混合。平衡後測定對照樣及最高鹽用量的試樣35℃下的水分活度值、以除去水分活度效應。接著將混合物置於密封瓶中於35℃下保溫8周，隨後測定活性損失值。將測得的結果列於下表實施例5按實施例4中所述方案，每100ml植酸酶濃縮物中各加入80mmol用量的不同的鹽而製備穩定化酶顆粒。與粗麥粉的混合及穩定性測試均類似於實施例4。將結果列於下表權利要求1.通過乾燥含酶和水溶性無機鹽的溶液來改善固體酶製劑的加工穩定性或貯存穩定性的方法，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％(w/w)。2.製備貯存穩定且加工穩定的含酶固體組合物的方法，該方法包括下列步驟a)製備包括酶和水溶性無機鹽的溶液，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％，以及b)將該溶液乾燥。3.按權利要求1或2的方法，其中的無機鹽包括二價陽離子。4.按權利要求3的方法，其中的二價陽離子選自鋅、鎂和鈣。5.按權利要求1-4任一項的方法，其中的無機鹽包括硫酸根陰離子。6.按權利要求1-5任一項的方法，其中的酶選自下列酶優選得自麴黴屬的植酸酶、優選得自芽胞杆屬的蛋白酶、優選得自麴黴屬的半纖維素酶、優選得自木黴屬的半纖維素酶及纖維素酶。7.按權利要求1-6任一項的方法，其中含酶和無機鹽的溶液的乾燥包括採用選自噴霧乾燥機、流化床乾燥機及冷凍乾燥機的乾燥機。8.包括至少一種酶和水溶性無機鹽的固體組合物，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％(w/w)且其中的無機鹽包括二價陽離子。9.通過下列步驟得到的固體組合物a)製備含酶和水溶性無機鹽的溶液，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％，以及b)將該溶液乾燥。10.按權利要求8或9的固體組合物，其中的鹽是權利要求3-5中任一項所定義的鹽。11.按權利要求8-10中任一項的固體組合物，其中的酶是權利要求6中定義的酶。12.按權利要求8-11中任一項的固體組合物，其中的組合物中無機鹽與酶是均勻分布的。13.按權利要求8-11的固體組合物，其特徵在於該組合物包括其中的無機鹽和酶是均勻分布的顆粒。14.按權利要求8-11的固體組合物，其特徵在於該組合物包括其中的無機鹽和酶是均勻分布的塗層。15.含植酸酶、具有貯存穩定性的固體組合物，其特徵在於該固體組合物在30℃下貯存8周後，活性損失低於初始植酸酶活性的35％。16.包括如權利要求8-15中任一項定義的固體組合物的動物飼料。全文摘要本發明公開幹的酶製劑的加工和貯存穩定性的改善方法。也就是說，將某無機鹽例如MgSO文檔編號A23K1/165GK1159208SQ96190833公開日1997年9月10日申請日期1996年7月24日優先權日1995年7月28日發明者R·C·M·巴蘭德斯,H-P·哈勒茨,R·J·貝茨申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司