基於在癌症的炎症環境釋放治療性負載的腹膜內給藥的納米載體的製作方法

2023-05-05 04:11:01

基於在癌症的炎症環境釋放治療性負載的腹膜內給藥的納米載體的製作方法
【專利摘要】在一個實施例中，本發明公開了一種納米載體組合物的新設計，其特異性地在腹膜內癌症的位置釋放其治癒性的負載。這些納米載體是向腹膜內給藥的，並且包含多個多孔的納米微粒，其中這些納米微粒(a)負載一種或多種藥學活性試劑，單獨或與顯像劑組合，從而提供一治療診斷值，以及(b)提供並由脂雙層封閉，以中斷與癌症環境中產生的活性氧接觸。在另一個實施例中，本發明提供了治療的方法，以及包含本文描述的納米微粒的藥物組合物。
【專利說明】基於在癌症的炎症環境釋放治療性負載的腹膜內給藥的納米載體
[0001]相關申請
[0002]本申請要求序列號為US61/509，251的美國臨時申請的優先權，申請日2011年7月19日，題目為「用於腹膜內癌症治療的新型納米技術平臺」，所述申請的全部內容以引用的方式併入本文中。
【技術領域】
[0003]在一個實施例中，本發明提供了一種納米載體的新設計，其特異性地在腹膜內癌症的位置釋放其治療性的負載(therapeutic load)。這些納米載體是向腹膜內給藥的，並且包含多個多孔的納米微粒，其中這些納米微粒(a)負載一種或多種藥學活性試劑，單獨或與顯像劑組合，從而提供一治療診斷值，以及(b)由脂雙層封閉並支撐脂雙層，其中，當脂雙層與癌症環境中產生的活性氧接觸時會破壞該脂雙層。
[0004]在另一個實施例中，本發明提供了使用本文描述的納米載體的治療方法和藥物組合物。
【背景技術】
[0005]卵巢癌是婦科腫瘤中導致死亡的頭號殺手，美國在2010年產生大約21，880個新增案例，並且導致了 13，850的死亡人數[30]。大多數的卵巢癌起始於卵巢表面上皮細胞(OSE) [31]，並且臨床上，其通常涉及卵巢和網膜，隨著擴散，涉及多病灶的腹腔內轉移以及惡性腹水[I]。卵巢癌的轉移(圖1)涉及從卵巢癌脫落的細胞，或是單個細胞(SCs)或是球體或多細胞團簇(MCAs)，它們隨後與在腹膜內表面排列的間皮細胞作用，並散布到鄰近的盆腔內器官[9，32，33]。大多數卵巢癌患者(大約75%)診斷得太晚，患有已擴散的腹腔內疾病(IV期)，並且因為這種遲的診斷，他們的存活率很低[34]。至於治療，患者通常會在經歷腫瘤細胞減滅術後給予卡鉬和紫杉醇的標準一線化療組合方案[2，5，35]。然而，大多數的患者最終會遭受治療性抵抗之苦，並且經歷卵巢癌的復發[35，36]。
[0006]證據指向排卵作用和卵巢癌中的炎症所起的作用[13，37]。由於免疫細胞滲透進入卵巢癌的微環境中，卵巢癌的腹膜微環境中出現的炎症促進了卵巢癌的進展[13、14]。已有報導指出，卵巢癌中，腹水中出現的白血球包括活化的巨噬細胞和T細胞，以及少量的自然殺傷細胞、B細胞和肥大細胞[14]。這些激活了的免疫細胞製造出活性氧，並分泌細胞激素和生成血管的以及生長的因子，從而促進OVCA的進展[38]。
[0007]在單線態分子氧(圖2)存在時，抗體，不管其來源或抗原特異性，以及T細胞受體通過水的氧化來催化合成臭氧(具有臭氧的化學特徵的分子)，並導致細菌毒性[16，18，39，40]。在體內，這個反應是由於單線態分子氧的來源——激活了的免疫細胞而發生的[16，17]。在試管中，單線態分子氧是通過加入光敏劑，並將試管內容物靠近紫外線照射暴露，即採用光化學源來產生的[16，18]。然而，眾所周知，單線態分子氧在體內是由激活了的嗜中性粒細胞生成的[25，26]。例如，臭氧在體內以逆轉-被動阿爾圖斯反應形成的，通過在大鼠中皮內注射白蛋白和抗白蛋白抗體來產生，其中在炎症的部位(inf lammatorylegions)檢測到臭氧[16]。此外，Wentworth和他的同事報導了，在激活了的白血球存在下，除了在體內的動脈粥樣硬化斑塊中形成臭氧外，也在體外的動脈粥樣硬化斑塊中形成，其中產生作為膽固醇的臭氧分解產物——atheronals。另一方面，這項研究仍然處於爭論中，因為除了臭氧以外，其中檢測到的atheixmals可通過單線態氧作為膽固醇的臭氧分解唯一產物[41,42]。然而，Wentworth和他的同事對他們第一次研究的樣品進行再評估時，證明了獲得的產物比例表明檢測的atheronals的形成涉及臭氧，而不是單線態氧[43，44]。
[0008]眾所周知，臭氧以及臭氧化的產物能導致磷脂雙分子層和細胞的破壞和溶解[19-21]。此外，活性氧和臭氧能引起有機分子和磷脂質的光分解，該磷脂質位於支撐在球面或平面平臺上的磷脂雙分子層中[22-24]。如果這些雙分子層是脂質體的部分，或是支撐在多孔球體上，那麼，雙分子層的破壞將導致它們的內容物，如化學治療劑的滲漏。
[0009]總而言之，卵巢癌(OVCA)由於其通過腹膜腔發生轉移和擴散到他其他器官，因此是一種腹膜疾病[I]。因此，腹膜內給予化學治療劑治療局部和擴散的0VCA，是因為它是被局限在腹膜的。最近，單獨實施OVCA的腹膜內化學治療或與靜脈化學治療法組合實施時，其治療效率已經被證明[2-5]。這可能由於直接將藥物輸送到多種類型的腹膜OVCA細胞，這些細胞在化學治療抵抗中發揮作用，例如腫瘤幹細胞和球狀體[6-12]。
[0010]由於產生活性氧並分泌因子促進腫瘤進展的免疫細胞的滲透，OVCA的腹膜微環境是炎症性的[13，14]。最近的報導證明，臭氧是在體內的炎症性疾病中產生的[15-17]。這種臭氧的產生是抗體的氧化催化活性的直接結果[16，18]。不管其來源或抗原特異性，抗體通過水氧化途徑催化臭氧和過氧化氫的產生[16，18]。抗體介導這一反應的唯一要求是單線態分子氧源，其在光敏劑的存在下，通過體外靠近紫外線輻射來提供[16，18]。在體內，這一反應發生的唯一要求是激活了的免疫細胞的存在，它們是單線態分子氧的源頭，除此之外，還介導水的氧化路徑和產生臭氧[16，17]。
[0011]眾所周知，臭氧和其他ROS是會引起磷脂雙分子層的過氧化反應，以及自由基的形成，後者導致由磷脂質組成的磷脂雙分子層的分解[19-24]。如果這些雙分子層是脂質體的部分，或是支撐在多孔微球體上，那麼，ROS破壞雙分子層將導致它們的內容物，如化學治療劑的滲漏。
[0012]因此，存在一種用於OVCA的腹膜內治療的納米載體，其能(I)利用通過炎症性疾病如OVCA中的激活了的免疫細胞介導生成的ROS [16，17，25，26] ; (2)允許ROS破壞不論是自由的還是支撐在球面或平面平臺上的磷脂雙分子層[19-24];以及(3)使用強健支撐的磷脂雙分子層組裝在多孔的納米微粒上，其能捕獲化學治療劑[27-29]。

【發明內容】

[0013]在一個實施例中，本發明提供 了一種納米載體的新設計，其特異性地在腹膜內癌症的位置釋放其治癒性的負載。這些作為組合物的納米載體是直接給予到活性位點如癌症或腫瘤的，以及優選地，向腹膜內給藥的，並且包含多個多孔的納米微粒，其中這些納米微粒(a)負載一種或多種藥學活性試劑，單獨或與顯像劑組合，從而提供一治療診斷值，以及
(b)由脂雙層封閉並支撐脂雙層，其中，當脂雙層與癌症環境中產生的活性氧接觸時會破壞該脂雙層。
[0014]優選地:(1)所述納米微粒是由一種或多種選自由二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成；以及(2)當與至少一種活性氧接觸時，所述磷脂雙分子層經受最大程度的破壞。
[0015]在另一個優選的實施例中，
[0016](a)所述納米載體包括至少一種抗癌劑；
[0017](b)在活性氧不存在的情況下，從所述多孔的納米微粒中釋放出少於大約10%到大約20%，或少於大約11%到大約19%，或少於大約12%到大約18%，或少於大約13%到大約17%，或少於大約14%到大約16%，或少於大約15%的所述抗癌劑；以及
[0018](C)基於與活性氧接觸導致磷脂雙分子層的破壞，所述多孔納米微粒釋放一定數量的抗癌劑，其約等於用5% (w/v)的Triton X-100溶解所述磷脂雙分子層後釋放的抗癌劑量的大約60%到大約80%，或大約65%到大約75%，或大約66%到大約74%，或大約67%到大約73%，或大約68%到大約72%，或大約69%到大約71%，或大約大於70%。
[0019]在另外的優選實施例中:
[0020](a)所述納米微粒是由選自由二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成；
[0021](b)所述納米載體包含至少一種用於治療癌症的藥學活性試劑，例如，至少一種抗癌劑，其選自由阿黴素、美法侖、貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、基於紫杉烷的化療試劑，尤其包括紫杉醇/紫杉酚和多烯紫杉醇等，或基於鉬的化療試劑，包括卡鉬或順鉬，以及紫杉酚組成的組；
[0022](C)所述磷脂雙分子層在體內與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子(O2-)和過氧亞硝基組成的組；以及
[0023](d)將所述納米載體給予到對象，直接到達癌症/腫瘤，或優選地，通過腹膜內給藥到達患有腹膜癌的對象的腹膜。
[0024]在另一個實施例中，本發明提供了治療患有癌症的對象的方法，所述方法包括在活性位點，包括在癌症/腫瘤位點直接給藥，或優選地，腹膜內(IP)給予對象一本文所描述的藥學上有效量的納米載體。在一優選的實施例中，給予所述納米載體來治療患有腹膜癌的對象。
[0025]在另一個實施例中，本發明提供一藥物組合物，其包含本文描述的納米載體，並且所述藥物組合物配製成用於腹膜內注射。
[0026]本發明的這些和其他實施例在本發明的詳細說明中進一步描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1.卵巢上皮致癌作用中涉及的步驟。灰色細胞是癌症幹細胞(CSCs)，OSE=卵巢表面上皮細胞，SCs=單個的細胞，MCAs=多細胞團簇或球狀體(spheroids)；
[0028]圖2.由抗體和T細胞受體催化的水氧化反應方程式[40]，其中單線態氧和水為底物，臭氧、過氧化氫和三線態氧為產物，過三氧化氫為中間產物；
[0029]圖3.使用ROS-敏感 型納米載體來治療OVCA的意義在於它會專門地在炎症性的腹膜OVCA微環境中釋放它的內容物，而不是在體循環中釋放；這能增強靶標多種類型的OVCA耐藥性細胞(SCs、MCAs、CSCs)的腹膜內治療，同時減少全身毒性；
[0030]圖4.在10 μ M的6-生物蝶呤以及UVA輻照下，由無細胞系統中的胺基酸催化臭氧的生產。試管中還包含30 μ M的靛藍胭脂紅(indigo carmine),其被臭氧轉化成靛紅磺酸，且檢測到在610nm處的吸收值降低；測試了在磷酸鹽緩衝劑中的ImM每種胺基酸和5mg/ml的BSA ;誤差線表不二個重複的標準差；
[0031]圖5.UVA和6BP均為色氨酸生成臭氧所需要的；測試了 ImM的色氨酸。誤差線表示三個重複的標準差；
[0032]圖6.通過增加色氨酸的濃度，臭氧生成的劑量響應曲線；測試的色氨酸濃度為O、10、20、40、80&160、500、1000μΜ ;更高濃度500 μ M和ImM的色氨酸沒有顯示，因為它們與160 μ M濃度點的結果相似；誤差線表示三個重複的標準差；
[0033]圖7.通過Triton X-100破壞磷脂雙分子層；具有50 A標稱孔徑的3 μ m 二氧化矽微球與5mM的螢光素一起孵育，然後包被由卵磷脂醯膽鹼製成的磷脂雙分子層；部分微球不經過處理，而部分微球則用Triton X-100 (TX100)來處理，最終濃度為5% (w/v);檢測微球沉澱後上清液的螢光值，從而檢查螢光素的釋放；
[0034]圖8.針對目的I的方法涉及通過SLB脂質構成的優化，從而選擇通過臭氧實現的最大程度的溶解，該臭氧是由試管中的色氨酸光化學生成的；通過臭氧實現的SLB溶解將釋放捕獲的螢光素(綠色星型)，並且這種二氧化矽的螢光降低可通過流式細胞術檢測到；
[0035]圖9.採用佛波醇酯(PMA)激活巨噬細胞後，使用螢光染料檢測ROS ；
[0036]圖10.採用PMA激活後，巨噬細胞破壞多種磷脂雙分子層；
[0037]圖11.在沒有巨噬細胞的情況下，培養基中的螢光值增加可以忽略不計，其為培養基中酚紅存在的直接結果；採用以下條件:(1)納米載體在磷酸鹽緩衝液(PBS)中，對比在培養基中，(2)在室溫(RT)下孵育，對比在37°C下，以及(3)存在PMA，對比不存在PMA ；
[0038]圖12.卵巢癌特異性受體，葉酸受體a (FRa )在多種卵巢癌細胞中的表達；頂部:RT-PCR 1=0VCA433，2=SK0V-3，3=0VCA420，4=0VCA429，5=0VCA432，6=D0V13，以及 7=0VEA6 ；底部:對SK0V3、0VCA433和0VEA6中FRa的流式細胞術，採用的是鼠抗FR a (Sig-3619)和抗鼠FITC ;流式細胞術確定高表達FR a蛋白的是SK0V-3 ；
[0039]圖13.FR a的基因敲除以及由FR(+)細胞，而不是FR㈠細胞特異攝取葉酸功能化的納米載體；(A)流式細胞術顯示FRa的蛋白水平；(B)腹膜細胞系SK0V-3 (FR(+))中以及敲除FRa (FR(_))表達的細胞中FRa的RT-PCR結果，18S作為內標；(C、D)FR(+)細胞(左)和FR㈠細胞(右)的共聚焦顯微圖證明由FR(+)細胞，而不是FR㈠細胞特異攝取葉酸功能化的納米載體；比例尺=20nm。
【具體實施方式】
[0040]在整個說明書中使用下列術語來描述本發明。當一術語在本文中沒有給出具體定義時，其具有本領域技術人員所理解的相同含義。採用根據本發明的一種或多種化合物治療的病狀或病況(disease states or conditions)的定義是本領域一般熟知的含義。
[0041]必須注意的是，除在一個參考中清楚、明確地限制外，本說明書及附帶的權利要求中使用的單數形式「一(a)」、「一(an)」和「所述(the)」包括複數形式。因此，例如，對於「一化合物」，則包括兩種或多種化合物。如此處所使用的術語「包括」及其語法上的變形，都不旨在限制，這樣，列舉中的所詳述的術語並不排除其他可以替換的術語，或其他可以添加到列舉中的術語。
[0042]分子氧(雙氧；02)是所有好氧微生物生存必不可少的。需氧能量代謝依賴於氧化磷酸化，而線粒體電子傳輸(通過一多元NADH脫氫酶複合體)的氧化還原能通過氧化磷酸化過程被轉化為ATP的高能磷酸鍵。O2充當這一線粒體酶複合體的終端酶成分——細胞色素C氧化酶的最終電子受體，這一過程催化O2四電子還原，變成H20。在這些(和其他)電子轉移反應過程中可形成O2的部分還原代謝產物和高活性代謝產物。這些O2代謝產物包括超氧陰離子(02_)和過氧化氫(H2O2),它們分別有O2的單電子還原和雙電子還原形成。在過渡金屬離子存在時，甚至會形成更多的活性羥基自由基(0H.)。這些O2的部分還原代謝產物通常被稱為「活性氧」(R0S)，是因為它們比分子O2具有更高的反應活性。
[0043]「活性氧」(ROS)包括，但不限於在 Afanas』 ev, 「Reactive Oxygen SpeciesSignaling in Cancer:Comparison with Aging，，, Aging Dis.2011June ；2 (3):219—230 中描述的活性氧。活性氧(ROS)的例子包括，但不限於臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子(02_)和過氧亞硝基。
[0044]術語「納米微粒」指的是多微粒，其中，這些微粒的「有效平均粒徑」是粒徑小於大約2000nm (2微米)。本文描述的包含納米微粒的組合物稱為「納米微粒組合物(nanoparticulate composition)，，。
[0045]術語「納米微粒」和「多孔納米微粒」在本文中可交換使用，並且這些顆粒可以是以結晶相、非晶相、半結晶相、半非晶相或它們的混合形式存在。，
[0046]—納米顆粒可具有不同的形狀和橫截面幾何形狀，這在某種程度上取決於生產該微粒所使用的工藝。在一個實施例中，一納米微粒可具有的形狀有球體、杆狀、管狀、片狀、纖維狀、盤狀、線狀、立方形或須狀(whisker)。一納米顆粒可包含顆粒具有兩種或多種的上述形狀。在一個實施例中，該顆粒的橫截面幾何形狀可以是圓形、橢圓形、三角形、長方形或多邊形的一種或多種。在一個實施例中，一納米顆粒主要由非球形的顆粒組成。例如，這種顆粒可具有橢圓形的形狀，其可具有不同長度的三條主軸，或可以是扁圓的或扁長的(prelate)迴轉橢球。替換地，非球形納米顆粒可以是層狀形狀，其中，層狀指的是顆粒沿一條軸線的最大尺寸大大小於沿另外兩條軸線中的每一條的最大尺寸。非球形納米顆粒還可以具有錐體或錐形體的平截頭墩的形狀，或細長杆形。在一個實施例中，納米顆粒的形狀是不規則的。在一個實施例中，多數的納米顆粒主要由球形的顆粒組成。
[0047]本文使用的用於描述多微粒(例如，一多孔納米微粒)的詞組「有效平均粒徑」指的是其中至少50%的顆粒是公稱尺寸(specified size)。因此，「有效平均粒徑是直徑小於大約2000nm」指的是至少50%的顆粒直徑小於大約2000nm。在某些實施例中，通過光散射法、顯微鏡或其他合適的方法測量，納米微粒的有效平均粒徑是小於大約2000nm (即2微米)，小於大約1900nm,小於大約1800nm,小於大約1700nm,小於大約1600nm,小於大約1500nm,小於大約1400nm，小於大約1300nm，小於大約1200nm，小於大約llOOnm，小於大約lOOOnm，小於大約900nm，小於大約800nm，小於大約700nm，小於大約600nm，小於大約500nm，小於大約400nm,小於大約300nm,小於大約250nm,小於大約200nm,小於大約150nm,小於大約lOOnm，小於大約75nm，小於大約50nm。「D50」指的是多微粒中50%的顆粒低於粒徑。類似地，「D90」指的是多微粒中90%的顆粒低於粒徑。
[0048]在某些實施例中，多孔納米微粒是由一種或多種選自由二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成。
[0049]本發明納米載體中使用的多孔納米微粒包括介孔二氧化矽納米顆粒和核殼式納米顆粒。
[0050]所述多孔納米微粒也可以是生物可降解的聚合物納米微粒，其包含由以下組中的一種或多種成分，所述組由脂肪族聚酯、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚已酸內酯(PCL)、聚酸酐、聚(正)酯、聚氨酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(丙交酯-Co-己內酯)、褐藻膠(alginate)和其他多糖、膠原蛋白和它們的化學衍生物，白蛋白、親水蛋白、玉米蛋白(一種玉米的儲藏蛋白)、醇溶谷蛋白、疏水蛋白(hydrophobicprotein)以及它們的共聚物和混合物組成。
[0051]或者，所述多孔納米顆粒可由溶膠凝膠混合物組成，該溶膠凝膠混合物通過在水的存在下，加入有機溶劑和金屬烷氧化物形成。在一純粹示例性的實施例中，金屬烷氧化物的金屬氧化物為T1、Zr、Sn、B、Al，以及可以使用Y，而在另外的實施例中，也可以採用由金或銀製成的納米顆粒。
[0052]在另外的示例性實施例中，所述多孔納米顆粒由溶膠凝膠混合物組成，該溶膠凝膠混合物通過在水的存在下，加入有機溶劑和矽烷氧化物形成。
[0053]在又一些另外的實施例中，所述多孔納米顆粒的每個均包含一具有核表面的核以及附著在所述核表面的殼，所述核表面本質上沒有二氧化矽，其中，所述殼包含選自由氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、硼化物、滷化物、硒化物、碲化物、氧化鉭、氧化鐵或它們的混合物組成的組中的一過渡金屬化合物。
[0054]本發明中使用的二氧化矽納米顆粒可以是，例如，介孔二氧化矽納米顆粒和核殼式納米顆粒。所述納米顆粒可以包含一吸收分子，例如，一吸收染料。在合適的條件下，所述納米顆粒由於化學發光發出電磁輻射。
[0055]例如,介孔二氧化娃納米顆粒的尺寸可以從大約5nm到大約500nm,包括其間的所有整數和範圍。所述尺寸是測量所述顆粒的最長軸。在不同的實施例中，所述顆粒的尺寸是從大約IOnm到大約500nm,以及從大約IOnm到大約lOOnm。所述介孔二氧化娃納米顆粒具有多孔結構，其具有至少一個孔，以及優選地，在所述納米顆粒的表面具有多個孔開口。所述孔的直徑可以從大約Inm到大約20nm，包括其間的所有整數和範圍。在一個實施例中，所述孔的直徑是從大約Inm到大約10nm。在一個實施例中，大約90%的所述孔的直徑是從大約Inm到大約20nm。在另一個實施例中，大約95%的所述孔的直徑是從大約Inm到大約20nmo
[0056]所述介孔納米顆粒可根據本領域已知的方法合成。在一個實施例中，所述納米顆粒是採用溶膠凝膠法合成的，其中，在微膠粒形式的模板分子(templates)存在的情況下，將一種或多種二氧化矽前體和連接(conjugated)(共價結合)到吸收分子的一種或多種二氧化矽前體水解。所述模板分子是採用表面活性劑如溴化十六烷基三甲銨(CTAB)製成的。可以預期採用能製成微膠粒的任何表面活性劑。 [0057]所述核殼式納米顆粒包含一核以及殼。所述核包含二氧化矽以及一吸收分子。所述吸收分子在該分子和二氧化矽網格之間通過共價鍵或化學鍵摻入到所述二氧化矽網格中。所述殼包含二氧化矽。
[0058]在一個實施例中，所述核是採用已知的溶膠凝膠化學，例如通過一種或多種二氧化矽前體的水解獨立地合成的。所述二氧化矽前體呈現為一二氧化矽前體和連接到一吸收分子(本文稱為「結合的二氧化矽前體」)的二氧化矽前體的混合物，例如通過共價鍵連接。在鹼性的(鹼的)條件下能進行水解形成一二氧化矽核和/或二氧化矽殼。例如，通過向包含二氧化矽前體和結合的二氧化矽前體的混合物中加入氫氧化銨來進行水解。
[0059]二氧化矽前體是在水解條件下能形成二氧化矽的化合物。二氧化矽前體的例子包括，但不限於有機矽烷，例如，四乙氧基矽烷(TEOS )、四甲氧基矽烷(TMOS )等等。
[0060]用於製備結合的二氧化矽前體的所述二氧化矽前體具有一官能團或多官能團，其能與一吸收分子或多個吸收分子反應，形成一共價鍵或多個化學鍵。這類二氧化矽前體的例子包括，但不限於，異氰酸丙基三乙氧基矽烷(ICPTS)、氨丙基三甲氧基矽烷(APTS)、巰丙基三甲氧基矽烷(MPTS)等等。
[0061]在一個實施例中，用於形成所述核的有機矽烷(可結合的二氧化矽前體)具有通式R4nSiXn,其中X是一可水解的基團，如乙氧基、甲氧基或2-甲氧基-乙氧基；R可以是具有I到12個碳原子的單價有機基團，其可任選地包含，但不限於一功能有機基團，如巰基、環氧基、丙烯醯基、甲基丙烯醯基或氨基；以及η是從O到4的整數。所述可結合的二氧化矽前體結合到一吸收分子，並隨後共縮聚來形成具有二氧化矽前體如TEOS和TMOS的核。用於形成所述二氧化矽殼的一矽烷的η等於4。採用功能化單、二和三烷氧基矽烷用於連接以及修飾共 反應性官能團或羥基功能化表面，包括玻璃表面也是已知的，參考Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Vol.20, 3rd Ed., J.Wiley, N.Y.;也參考 E.Pluedemann, Silane Coupling Agents, Plenum Press, N.Y.1982.該有機矽烷會引起形成膠體，因此採用乙醇或其他已知的穩定劑是有利的。合成核殼式納米顆粒的方法可以使用在美國專利申請序列號為10/306，614和10/536，569中能找到的修改過的Stoeber方法，這些方法的公開內容以參考的形式併入本文。
[0062]本發明納米載體的一些實施例中，磷脂雙分子層是由一種或多種選自以下組中的磷脂組成的，所述組由包括磷脂醯膽鹼的磷脂質和如DOTAP以及膽固醇的其他磷脂質組成。
[0063]在另外的一些實施例中，所述磷脂雙分子層由一種或多種包括磷脂醯膽鹼(PCs)的磷脂質組成，其中所述磷脂質是選自由以下物質組成的組，包括1，2- 二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DMPC)、1，2- 二油醯-3-三甲胺-丙烷(D0TAP)、1-棕櫚醯基-2-油醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(P0PC)、卵磷醯膽鹼(egg PC)(優選地，至少卵磷醯膽鹼)和一脂質混合物，其中包含大約25%到大約55%或更高之間、大約35%到大約50%、大約36%到大約49%、大約37%到大約48%、大約40% (通常少於大約50%)的卵磷醯膽鹼，大約50%到大約70%、大約51%到大約69%、或大約52%到大約68%、或大約53%到大約67%、或大約54%到大約66%、或大約55%到大約65%、或大約56%到大約64%、或大約57%到大約63%、或大約58%到大約62%、或大約59%到大約61%、或大約60%的一種或多種不飽和磷脂，碳鏈長為14且沒有不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2- 二棕櫚醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DPPC) [16:0]、I, 2- 二硬脂醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DSPC) [18:0]、1，2- 二油醯-sn-丙三基_3_磷酸膽鹼(DOPC) [18:1 ( Λ 9-Cis]、POPC [16:0-18:1]和 DOTAP [18:1]、或它們的混合物。[0064]在其他的實施例中:
[0065](a)所述磷脂雙分子層由混合物組成，該混合物為(I)卵磷醯膽鹼和(2) —種或多種磷脂質，該磷脂質選自由以下物質組成的組:1，2- 二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DMPC)U, 2- 二油醯-3-三甲胺-丙烷(DOTAP)、1-棕櫚醯基_2_油醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(P0PC)，和一脂質混合物，其中包含大約25%到大約55%或更高之間、大約35%到大約50%、大約36%到大約49%、大約37%到大約48%、大約40%到大約49% (通常少於大約50%的卵磷醯膽鹼)、大約50%到大約70%或大約51%到大約69%、或大約52%到大約68%、或大約53%到大約67%、或大約54%到大約66%、或大約55%到大約65%、或大約56%到大約64%、或大約57%到大約63%、或大約58%到大約62%、或大約59%到大約61%、或大約60%的一種或多種不飽和磷脂，優選一不飽和的磷脂醯膽鹼，碳鏈長為14且沒有不飽和鍵的DMPC[14:0]、I, 2- 二棕櫚醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DPPC) [16:0]、1，2- 二硬脂醯-sn-丙三基_3_磷酸膽鹼(DSPC) [18:0]、1，2- 二油醯-sn-丙三基 _3_ 磷酸膽鹼(DOPC) [18:1 ( Λ 9_Cis]、P0PC[16:0-18:1] DOTAP[18:1];以及其中
[0066](b)卵磷醯膽鹼的摩爾濃度佔混合物的大約10%到大約75%之間、或大約15%到大約70%、或大約25%到大約68%、或大約30%到大約67%、或大約34%到大約66%、或大約40%到大約65%、或大約45%到大約64%、或大約47%到大約63%、或大約48%到大約62%、或大約49%到大約61%、或大約50%到大約60%、或大約51%到大約59%、或大約52%到大約58%、或大約53%到大約57%、或大約54%到大約62%、或大約55%到大約65%、或大約56%到大約64%、或大約57%到大約63%、或大約58%到大約62%、或大約29%到大約31%、或大約30%，以及所述雙分子層的剩餘部分包含
[0067]在另外優選的方面，所述磷脂雙分子層包含摩爾濃度為大約40%到大約60%的卵磷醯膽鹼，以及摩爾濃度為大約40%到大約60%的至少一種上面列舉的額外磷脂。在一些優選的實施例中，所述磷脂雙分子層包含摩爾濃度為大約40%到大約60%的卵磷醯膽鹼，以及摩爾濃度為佔磷脂雙分子層大約40%到大約60%的一種或多種不飽和磷脂、碳鏈長為14且沒有不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2- 二棕櫚醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DPPC) [16:0]、I, 2- 二硬脂醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DSPC) [18:0]、1，2- 二油醯-sn-丙三基_3_磷酸膽鹼(DOPC) [18:l(A9-Cis]、P0PC[16:0-18:l] DOTAP [18:1]的混合物。
[0068]在一些實施例中，所述磷脂雙分子層是由一種或多種組分組成的，所述組分選自由磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯二乙醇胺、磷脂醯肌醇、鞘脂和乙氧基化留醇或它們的混合物組成的組。在這類實施例的示例性例子中，磷脂可以是卵磷脂；磷脂醯肌醇可以是來源於大豆、油菜、棉籽、卵和它們的混合物；鞘脂可以是神經醯胺、腦苷脂、鞘氨醇和鞘磷脂以及它們的混合物；乙氧基化留醇可以是植物留醇、PEG-(聚乙二醇)-5-大豆甾醇和PEG-(聚乙二醇)-5-油菜籽留醇。在一些實施例中，所述植物留醇包含以下組分的至少兩種的混合物:谷留醇、菜油留醇和豆甾醇。
[0069]在另外一些示例性實施例中，所述磷脂雙分子層由一種或多種磷脂醯基組成，該磷脂醯基選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯肌醇和溶血磷脂醯肌醇組成的組。
[0070]在其他一些示例性實施例中，所述磷脂雙分子層由選自單醯基或二醯基磷酸甘油脂的磷脂組成。[0071]在其他一些示例性實施例中，所述磷脂雙分子層由一種或多種磷酸肌醇類組成，該磷酸肌醇類選自由磷脂醯-肌醇-3-磷酸(P1-3-P)、磷脂醯-肌醇-4-磷酸(P1-4-P)、磷脂醯-肌醇-5-磷酸(P1-5-P)、磷脂醯-肌醇-3，4- 二磷酸(P1-3，4-P2)、磷脂醯-肌醇-3，5- 二磷酸(P1-3，5-P2)、磷脂醯-肌醇-4，5- 二磷酸(PI_4，5-P2)、磷脂醯-肌醇-3，4，5-三磷酸(P1-3，4，5-P3)、溶血磷脂醯-肌醇_3_磷酸(LP1-3-P)、溶血磷脂醯-肌醇-4-磷酸(LP1-4-P)、溶血磷脂醯-肌醇-5-磷酸(LP1-5-P)、溶血磷脂醯-肌醇_3，4- 二磷酸0^1-3，4-?2)、溶血磷脂醯-肌醇-3，5-二磷酸(LP1-3，5-P2)、溶血磷脂醯-肌醇-4，5- 二磷酸(LP1-4，5-P2)和溶血磷脂醯-肌醇_3，4，5-三磷酸(LP1-3，4，5-P3)，以及磷脂醯-肌醇(PI)和溶血磷脂醯-肌醇(LPI)組成的組。
[0072]在其他一些示例性實施例中，所述磷脂雙分子層由一種或多種磷脂質組成，該磷脂質選自由PEG-聚(乙二醇)_衍生化的二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE)、聚(乙二醇)-衍生化的神經醯胺(PEG-CER)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、卵磷脂(EPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯甘油(PG)、磷脂醯肌醇(PI)、單唾液酸神經節苷脂(monosialogangolioside)、鞘磷脂(SPM)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蘧醯磷脂醯膽鹼(DMPC)和二肉豆蘧醯磷脂醯甘油(DMPG)組成的組。
[0073]在本發明的一個納米載體的示例性實施例中:
[0074](a)所述一種或多種藥學活性試劑包括至少一種抗癌劑；
[0075](b)在沒有活性氧存在時，從所述多孔納米微粒中釋放出少於大約10%到大約20%的所述抗癌劑；以及 [0076](C)基於與活性氧接觸導致磷脂雙分子層的破壞，所述多孔納米微粒釋放一定數量的抗癌劑，其約等於用5%(w/v)的Triton X-100溶解所述磷脂雙分子層後釋放的抗癌劑量的大約60%到大約80%，或大約61%到大約79%，或大約62%到大約78%，或大約63%到大約77%，或大約64%到大約77%，或大約65%到大約76%，或大約66%到大約75%，或大約67%到大約74%，或大約68%到大約73%，或大約69%到大約72%，或大約70%到大約71%，或大約大於70%。
[0077]本發明納米載體可包含廣泛的藥學活性成分。優選地，所述活性成分是抗癌劑，其選自由抗代謝物，拓撲異構酶I和II的抑制劑、烷化劑、微管抑制劑、小分子抑制劑，生物治療藥物和單克隆抗體，阿黴素、阿地白介素；阿侖單抗；阿利維A酸；別嘌呤醇；六甲蜜胺；阿米福汀；阿那曲唑；三氧化二砷；天冬醯胺酸酶；卡介苗活菌；蓓薩羅丁膠囊；蓓薩羅丁凝膠；博來黴素；白消安靜脈注射劑；白消安口服劑；卡普睪酮；卡培他濱；卡鉬；卡莫司汀；以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑；塞來昔布；苯丁酸氮芥；順鉬；克拉屈濱；環磷醯胺；阿糖孢苷；達卡巴嗪；更生黴素；放線菌黴素D ;阿法達貝泊汀；道諾黴素；道諾黴素；地尼白介素；右雷佐生；多烯紫杉醇；阿黴素；屈他雄酮丙酸酯；Elliott』 s BSolution ;表柔比星；阿法依泊汀；雌莫司汀；依託泊苷磷酸酯；依託泊苷(VP-16);依西美坦；非格司亭；氟尿苷(動脈注射)；氟達拉濱；氟尿嘧啶(5-FU);氟維司群；吉西他濱；吉妥單抗；奧佐米星；醋酸戈舍瑞林；羥基脲；替伊莫單抗；伊達比星；異環磷醯胺；甲磺酸伊馬替尼；幹擾素a _2a;幹擾素a _2b;伊立替康；來曲唑；亞葉酸；左旋四咪唑；洛莫司汀(CCNU);氮芥(氮芥)；醋酸甲地孕酮；美法侖(L-PAM);巰嘌呤(6-MP);美司鈉；氨甲蝶呤；甲氧沙林；絲裂黴素C ;米託坦；苯丙酸諾龍；巰諾莫單抗(Nofetumomab) ；LOddC ;奧普瑞白介素；奧沙利鉬；紫杉醇；帕米膦酸鹽；培加酶；培門冬酶；聚乙二醇化非格司亭；噴司他丁 ；喊泊漠燒；普卡黴素；光神黴素；口卜吩姆納；甲節餅；查納克林；拉布立酶；利妥昔單抗；沙格司亭；鏈佐星；替比夫定(LDT);滑石(talc);他莫昔芬；替莫唑胺；替尼泊苷(VM-26)；睪內酯；硫鳥嘌呤(6-TG);塞替派；拓撲替康；託瑞米芬；託西莫單抗；曲妥單抗；維甲酸(ATRA);烏拉莫司汀；戊柔比星；伐託他濱(一價LDC);長春花鹼；長春瑞濱；唑來膦酸及它們的混合物等。
[0078]更優選地，本發明的納米載體包含在卵巢癌或腹膜癌的治療中有用的抗癌劑。這種抗癌藥物的非限制性例子包括阿黴素、美法侖、貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、紫杉醇、卡鉬、順鉬和紫杉酚。
[0079]本發明的一些實施例公開了治療患有癌症的對象的方法，其中，本文描述的多個納米載體是腹膜內給藥(例如，通過注射包含多個所述納米載體和一藥學上可接受的稀釋液和/或賦形劑的藥物製劑)到患有腹膜癌的對象的腹膜中的。
[0080]在這些治療方法的一些實施例中:
[0081]Ca)所述納米載體包含納米微粒,所述納米微粒是由一種或多種選自由二氧化娃、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成；
[0082](b)給藥後，所述納米載體的磷脂雙分子層與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子(O2-)和過氧亞硝基組成的組；以及
[0083](c)所述納米載體的一種或多種藥學活性試劑包括一抗癌劑，該抗癌劑選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、紫杉烷化療劑如紫杉醇/紫杉酚或多烯紫杉醇等，或基於鉬的化療劑如卡鉬、順鉬等組成的組。
[0084]在上面段落描述的示例性製劑和方法中，所述納米載體可包含多個多孔二氧化矽納米微粒，
[0085](a)所述納米載體負載有一種或多種藥學活性試劑，優選地，該藥學活性試劑選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、紫杉烷化療劑如紫杉醇/紫杉酚或多烯紫杉醇，或基於鉬的化療劑如卡鉬、順鉬組成的組；以及
[0086](b)所述納米載體由磷脂雙分子層封裝，並支撐磷脂雙分子層，所述磷脂雙分子層是由一種或多種組分組成的，所述組分選自由磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯二乙醇胺、磷脂醯肌醇、鞘脂和乙氧基化留醇或它們的混合物組成的組；
[0087]其中，給藥後，所述納米載體的磷脂雙分子層在體內與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子(O2-)和過氧亞硝基組成的組。
[0088]在本發明的治療方法的其他實施例中，將一種或多種額外的抗癌劑或抗癌治療法(如，輻射)與所述納米載體組合物共同給予所述對象。所述額外的抗癌劑或抗癌治療法(如，輻射)與所述納米載體組合物可在不同的時間或一起給予所述對象。一些實施例需要腹膜內給予一藥物製劑 到患有腹膜癌的對象的腹膜中，所述藥物製劑包含多個納米載體和一藥學上可接受的稀釋劑和/或賦形劑。[0089]在其他一些實施例中，本發明公開了一種藥物組合物，其包含:
[0090](a)包含多個多孔納米微粒的腹膜內給藥的納米載體組合物，所述多孔納米微粒(I)負載有一種或多種藥學活性試劑，以及(2)由磷脂雙分子層封裝，並支撐磷脂雙分子層，所述磷脂雙分子層在體內與活性氧接觸而被破壞；以及
[0091](b)至少一種藥學上可接受的稀釋液或藥學上可接受的賦形劑。
[0092]在本發明的藥物組合物的一個例子中:
[0093](a)納米載體組合物包含納米顆粒，納米微粒是由一種或多種選自由二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成；
[0094](b)所述納米微粒磷脂雙分子層在體內與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子(02_)和過氧亞硝基組成的組；以及
[0095](c)所述一種或多種藥學活性試劑包括一抗癌劑，該抗癌劑選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、紫杉烷化療劑如紫杉醇/紫杉酚或多烯紫杉醇，或基於鉬的化療劑如卡鉬、順鉬或奧沙利鉬組成的組。
[0096]在整個說明書中使用的術語「患者」或「對象」是指動物，優選地指使用本發明公開的組合物治療(包括預防性治療)的人類。當治療針對某種具體動物如人類患者的這些感染、疾病或疾病狀態時，術語「患者」是指該特定動物。
[0097]在整個說明書中使用的術語「有效量」，在它們使用的背景中，根據本發明是描述劑型或以量來使用的其他成分的濃度或量，從而引起預期的效果。根據所治療的病狀或病況，可使用這些劑型或成分來使所治療的疾病或病狀產生有利的改變，不論該改變是否是一種緩解、一種有利的生理結果、一種病狀或病況的逆轉或減弱、病狀或病況發生可能性的預防或減少。當組合使用劑型時，每種劑型均以其有效量使用，其中有效量可包括協同作用的量。本發明中使用的劑型的量可根據劑型的性質、患者的年齡和體重以及許多其他會影響該劑型的生物利用度和藥物代謝動力學的因素而改變，給予患者的劑型的量一般地從每天大約0.0Olmg/kg到大約50mg/kg或更多，大約0.5mg/kg到大約25mg/kg,大約0.1到大約15mg/kg,大約Img到大約10mg/kg,以及本文其他地方描述的。本領域技術人員很容易想到在治療過程中使用變化的劑量方案或量。
[0098]術語「預防性的」是用於描述本文描述的劑型的用途，其可降低患者或對象中病狀或病況的發生的可能性。術語「降低可能性」指的是在一給定人數的患者群體中，可採用本發明來降低所有患者人數中的一個或多個患者的疾病發生、復發或轉移的可能性，而不是預防其在所有患者中疾病的發生、復發或轉移。
[0099]術語「藥學上可接受的」的意思是如本文描述的納米載體，或其成分，或包括這一納米載體的劑型，或本文描述的劑型的添加劑、稀釋劑或賦形劑，對於給藥的對象來說，並非不能接受的毒物。
[0100]術語「紫杉烷」或「紫杉烷化療劑」包括，但不限於紫杉醇(Taxoi?)、多烯紫杉醇n』axubd瓦: >、紫杉烷衍生物如IDN5390、GRN1005, EP2330100A1中描述的紫杉烷衍生物和Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.76 (2012), N0.2pp.349-352 中描述或引用的紫杉烷衍生物。優選的紫杉烷包括紫杉醇和多烯紫杉醇。[0101]術語「基於鉬的化療試劑」是用於描述包含鉬的化療試劑。優選的基於鉬的化療試劑包括順鉬、奧沙利鉬和卡鉬。
[0102]在整個說明書中使用的術語「癌」指的是導致癌或惡性瘤的形成和生長的病理過程，即，通過細胞增殖生長的異常組織，其生長通常比正常組織更快，並且在引起該新的生長停止的刺激後繼續生長。惡性腫瘤呈現部分或完全的失去結構組織和與正常組織的功能協作，以及大部分入侵到周圍的組織中，轉移到多個部位，並且在嘗試切除後可能復發，且除非適當地治療，否則會導致患者死亡。本文使用的術語「腫瘤」是用於描述所有癌的病狀，並包括或包含與惡性造血瘤、腹水(ascetic)瘤和實體瘤相關的病理過程。
[0103]採用根據本發明的不同實施例治療的癌症的例子包括，但不限制，癌(例如，鱗狀細胞癌、基細胞癌、腺癌、肝細胞癌和腎細胞癌)，特別地，膀胱、腸、乳房、宮頸、直腸、食道、頭、腎臟、肝、肺、頸、卵巢、胰腺、前列腺和胃的那些細胞；良性和惡性淋巴瘤，特別地，伯基特淋巴瘤和非霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤和B-細胞淋巴瘤；良性和惡性的黑素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤,特別是尤因氏肉瘤、血管內皮瘤、卡波濟氏肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、外周神經上皮瘤和滑膜肉瘤；中樞神經系統的腫瘤(例如,神經膠質瘤、星型細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、膠質母細胞瘤、成神經細胞瘤、神經節細胞瘤、神經節神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、松果體細胞瘤、腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經纖維瘤和神經鞘瘤)；生殖細胞和非生殖細胞腫瘤(例如，腸癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星型細胞瘤、食道癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、結腸癌和黑素瘤)；混合類型的瘤，特別地，癌肉瘤和霍奇金氏病；混合起源(origin)的腫瘤，例如維爾姆斯瘤和畸胎癌(Beers andBerkow(eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed.(ffhitehouseStation, N.J.:Merck Research Laboratories, 1999) 973-74，976，986，988，991)。應當注意的是，在腹膜癌的例子中，優選的給藥途徑是腹膜內(腹膜內注射)。在不是腹膜癌的癌症例子中，根據本發明的組合物的優選給藥途徑是直接到達癌症/腫瘤。
[0104]術語「腹膜癌」指的是在位於腹腔組織的薄層(稱為腹膜)中某種程度上罕見發展的癌症。它還覆蓋子宮、膀胱和直腸。腹膜癌經常與腸癌或胃癌混淆。因為腹膜癌是在腹膜內開始的，所以腹膜癌不同於那些轉移到腹膜中的癌症。因此，其通常指的是原發性腹膜癌。原發性腹膜癌(PPC或PPCa)是細胞位於腹膜或腹膜腔的癌症。腹膜癌的表現和外觀很像卵巢癌。這主要是因為卵巢的表面是由表皮細胞組成的，腹膜也是一樣。原發性腹膜癌或腫瘤(carcinoma)也被稱為:漿液性表面乳頭狀癌、原發性腹膜癌、卵巢外漿液性癌、原發性漿液性乳頭狀癌、沙樣瘤。
[0105]根據本發明的劑型可與額外的抗癌劑聯合給藥。這些試劑包括，例如，抗代謝物，拓撲異構酶I和II的抑制劑、烷化劑、微管抑制劑(如紫衫酚)、小分子抑制劑，生物治療藥物和單克隆抗體。本發明中使用的用於特定的抗癌協同治療劑包括，例如阿黴素、阿地白介素；阿侖單抗；阿利維A酸；別嘌呤醇；六甲蜜胺；阿米福汀；阿那曲唑；三氧化二砷?』天冬醯胺酸酶；卡介苗活菌；蓓薩羅丁膠囊；蓓薩羅丁凝膠；博來黴素；白消安靜脈注射劑；白消安口服劑；卡普睪酮；卡培他濱；卡鉬；卡莫司汀；以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑；塞來昔布；苯丁酸氮芥；順鉬；克拉屈濱；環磷醯胺；阿糖孢苷；達卡巴嗪；更生黴素；放線菌黴素D ;阿法達貝泊汀；道諾黴素；道諾黴素；地尼白介素；右雷佐生；多烯紫杉醇；阿黴素；屈他雄酮丙酸酯；Elliott』 s B Solution ;表柔比星；阿法依泊汀；雌莫司汀；依託泊苷磷酸酯；依託泊苷(VP-16);依西美坦；非格司亭；氟尿苷(動脈注射)；氟達拉濱；氟尿嘧啶(5-FU);氟維司群；吉西他濱；吉妥單抗；奧佐米星；醋酸戈舍瑞林；羥基脲；替伊莫單抗；伊達比星；異環磷醯胺；甲磺酸伊馬替尼；幹擾素a -2a ;幹擾素a -2b ;伊立替康；來曲唑；亞葉酸；左旋四咪唑；洛莫司汀(CCNU);氮芥(氮芥);醋酸甲地孕酮；美法侖(L-PAM)A^嘌呤(6-MP);美司鈉；氨甲蝶呤；甲氧沙林；絲裂黴素C ;米託坦；苯丙酸諾龍；巰諾莫單抗(Nofetumomab)5LOddC ;奧普瑞白介素；奧沙利鉬；紫杉醇；帕米膦酸鹽；培加酶；培門冬酶；聚乙二醇化非格司亭；噴司他丁 ；哌泊溴烷；普卡黴素；光神黴素；卟吩姆鈉；甲苄肼；奎納克林；拉布立酶；利妥昔單抗；沙格司亨；鏈佐星；替比夫定(LDT);滑石(talc);他旲昔分；替莫唑胺；替尼泊苷(VM-26);睪內酯；硫鳥嘌呤(6-TG);塞替派；拓撲替康；託瑞米芬；託西莫單抗；曲妥單抗；維甲酸(ATRA);烏拉莫司汀；戊柔比星；伐託他濱(一價LDC);長春花鹼；長春瑞濱；唑來膦酸及它們的混合物等。
[0106]本發明的劑型可包括一藥學上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、防腐劑和/或佐齊?。可接受的劑型材料優選是採用的劑量和濃度對接受者無毒性。所述藥物劑型可包含，用於改變、維持或保持例如PH值、摩爾滲透壓濃度、粘度、清澈度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放的速度、組分的吸附或滲透的材料。合適的劑型材料包括，但不限於，胺基酸(如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸)；抗菌劑；抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；填充劑(如甘露醇或甘氨酸)；螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA));配位劑(咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β -環糊精或羥丙基-β -環糊精)；填充劑；單糖；二糖，以及其他糖類(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(如血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白)；著色劑、調味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；鹽形成的抗衡離子(如鈉)；防腐劑(如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙 酯、雙氯苯雙胍己烷、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤溼劑(如普朗羅尼類、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80、Triton、三羧甲基氨基甲烷(trimethamine)、卵磷脂、膽固醇、四丁酚醛)；穩定性增強劑(如蔗糖或山梨醇)；緊張性增強劑(如鹼金屬滷化物，優選氯化鈉或氯化鉀、甘露醇或山梨醇)；運送載體；稀釋劑、賦形劑和 / 或藥物佐劑。參考，例如，REMINGTON』 S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.sup.thEdition, (A.R.Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing。
[0107]藥物製劑中的原始媒介或載體可包括，但不限於，注射用水、生理鹽水或人工腦脊液，可能補充通常用於腸胃外給藥的組合物中的其他材料。中性緩衝鹽水或混合有血清白蛋白的鹽水是另外的典型載體。藥物劑型可包含PH值為7.0-8.5的Tris緩衝液，或pH值為4.0-5.5的醋酸鹽緩衝液，其可進一步包括山梨醇或合適的替代物。本發明的藥物劑型可通過將選擇的具有要求純度的組分和任選的製劑(REMINGTON』 S PHARMACEUTICALSCIENCES, Id.)混合製備，形成凍幹的塊狀或水溶液，用於儲存。進一步地，採用合適的賦形劑，如蔗糖，該劑型可配製成冷凍乾產物。
[0108]劑型組分的濃度是給藥位點可接受的。有利地，緩衝液用於維持所述組合物在生理pH值，或在稍微低的pH值，通常pH值範圍在大約5到大約8。
[0109]本發明使用的治療劑型可以為無熱原，腸胃外可接受的水溶液形式。製備過程涉及期望的納米載體的配製，該納米載體可提供受控的或持續的產物釋放，隨後，產物通過積存注射法來提供。具有透明質酸的劑型在循環中具有促進持續時間的效果。
[0110]在體內施用的藥物組合物通常是無菌的。在一些實施例中，這可通過無菌濾膜的過濾來完成。在一些實施例中，當所述組合物是凍幹的，可在冷凍乾燥和復水(reconstitution)前或後使用這種方法來過濾。在一些實施例中，用於腹膜給藥的所述組合物以凍幹形式或溶液形式保存。在一些實施例中，腹膜組合物通常放置在具有無菌進入口的容器中，例如，靜脈輸液包或瓶，其具有通過皮下注射器的針頭可刺破的塞子。
[0111]一旦本發明的劑型配製好，其可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體，或作為脫水的或凍幹的粉末來無菌儲存。這些劑型以即用型的形式，或在給藥前復水的形式(例如，凍幹的)來儲存。
[0112]本發明的這些和其他方面在下面的非限制性例子中進一步描述。
[0113]實施例1
[0114]阜氣的牛成和SLB的破壞
[0115]1.概沭。
[0116]由於OVCA是一種腹膜疾病，那麼，邏輯上，將治療藥物直接地腹腔內給藥(IP)到達疾病的位點必然比通過靜脈注射(IV)途徑具有更高的效率。此外，臨床前試驗已經證實，腹膜內給藥途徑允許給予比靜脈注射途徑濃度更高的化療試劑[45]。事實上，單獨通過腹膜內給藥途徑，或與靜脈注射途徑聯用來進行化療給予更高的總體生存率[2-5];然而，與腹膜內給藥相關的主要問題是更高的系統毒性比例[2，35，46]。為了克服與腹膜內給藥相關的系統毒性的存在問題，我們計劃設計一種納米載體，其僅在腹膜釋放它的治療性內容物，而不在循環中釋放。我們的載體將由ROS敏感型的磷脂雙分子層來製成，其被支撐在多孔二氧化矽納米球上(圖3)。作為ROS敏感型的意義在於它的治療性內容物能專門地在OVCA炎症性的腹膜微環境中釋放出來，該環境富含有導致磷脂雙分子層溶解的激活的免疫細胞。同時，當通過腹膜腔進入循環，面對較低的ROS濃度時，擁有靠二氧化矽球體支持的磷脂雙分子層將穩定它們。血液中較低的且受控的ROS水平，是由於抗氧化劑抑制循環中的ROS作用，包括防止其細菌毒性[47，48]。
[0117]大多數的納米載體將定位在腹膜中(圖3)，因此，防止藥物在除靶標部位外的炎症性部位有效釋放。由於OVCA轉移被大大地限制在腹膜中(圖1)，藥物通過腹膜內給藥的意義在於，其治療局部及隨著SCs、MCAs和CSCs擴散的疾病。由於這些細胞的存留是已知產生治療抗性和復發的原因[6-12]，因此在腹膜內直接靶標這些細胞是很重要的。因此，這種治療模式應當克服OVCA的化療抗性，而我們的納米技術平臺的意義在於可以降低系統毒性。
[0118]因此，根據本發明的納米載體給藥:(1)通過如OVCA的炎症性疾病中的激活的免疫細胞介導，由單線態氧產生ROS ;(2)R0S破壞並導致磷脂雙分子層的溶解；以及(3)強健支撐的磷脂雙分子層組合可容易地形成在能包埋化療試劑的多孔二氧化矽上[27-29]。
[0119]2.方法。
[0120]初步的試驗支持以下目標:
[0121]通過採用光化學源，即通過加入光敏劑以及將試管內容物暴露到UVA輻照下，我們成功在無細胞系統中生成了臭氧(具有臭氧化學特徵的分子)。在這一部分對我們的發現進行總結。報告顯示 ，四種胺基酸(色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和組氨酸)，但不包括其他胺基酸，與通過採用光化學源氧化水產生臭氧，伴隨增加嗜中性粒細胞的抗菌活性需要的抗體具有相同的催化活性[49]。我們的初步試驗採用胺基酸作為最簡單的機制來產生臭氧。我們使用的光敏劑是6-生物蝶呤(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) [49],而通過一無臭氧的1000W氙弧燈作為太陽光模擬器來提供UVA輻射(315-400nm)，其中通過合適的過濾器(Oriel Instruments, Stratford, CT)來阻斷UVB福射。UVA的輸出通過UV福照計(Model3D, Solar Light, Glenside, PA)來確認，並測量出為6mW/cm2 ;我們將樣品暴露4分鐘。通過臭氧將靛藍胭脂紅(吸收峰在610nm的藍色染料)轉化成靛紅磺酸(無色)來檢測臭氧，如之前描述的，我們通過測量在610nm處的光吸收值來檢測這種轉化[16，49]。圖4顯示了我們通過光化學在色氨酸催化的反應中生成的臭氧，以及在蛋氨酸催化中較少程度生成，這與以前的報導一致[49]，其中當磷酸鹽緩衝液充當陰性對照時，牛血清白蛋白(BSA)僅輕微生成臭氧，如以前所報導[49]。
[0122]由於色氨酸(Trp)生成最高水平的臭氧，我們在下一步試驗中繼續採用它，並且採用磷酸鹽緩衝液和BSA來作為陰性對照。圖5證明了色氨酸單獨是不能氧化水的，但對於該反應，6-生物蝶呤(6-BP)存在作為光敏劑同時暴露到UVA是需要的，因為已經報導了它們的存在生成這一反應所需要的除了水以外的底物——單線態氧。此外，色氨酸以劑量依賴方式將單線態氧轉化成臭氧(圖6)。所有這些試驗證明了我們成功地在無細胞和無球體系統中，通過胺基酸——色氨酸生成臭氧(具有臭氧化學特徵的分子)。我們計劃使用的這一平臺在多孔二氧化矽上採用支撐的磷脂雙分子層(SLBs)。我們將採用上面描述的系統，通過色氨酸光化學生成臭氧，並用來測試SLBs的破壞。對於SLB破壞的檢測，如前所描述，通過向在3微米的多孔二氧化娃(Macherey-Nagel, Germany)中裝有突光素的球體加入Triton X-100 (TX-100)，然後形成SLB來測試概念驗證。ΤΧ100破壞SLB會導致封裝的螢光素釋放(ΤΧ100處理的螢光值是沒有處理的球體的14倍)。這證明了我們通過螢光染料能檢測到SLB的破壞和多孔球的內容物的釋放。
[0123]總的來說，我們初步的數據顯示通過光化學我們成功利用胺基酸生成了臭氧，並且我們擁有系統檢測SLBs溶解和它們的封裝內容物釋放。
[0124]實施例2
[0125]多孔二氣化矽球體。
[0126]圖7中描述的系統是暴露在由色氨酸光化學(即，通過暴露到UVA以及使用6ΒΡ)產生的臭氧中的。粒徑範圍為200-500nm的多孔二氧化矽球體根據公開的工藝進行合成
[50]。流式細胞術檢測該納米載體的螢光內容物(圖8)。除了膽固醇外，還評價了多種磷脂醯膽鹼(均購自Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)來優化由SLB製成的磷脂。PCs檢測了磷脂混合物，包括作為一個例子的卵磷脂醯膽鹼，其內含~54%的不飽和磷脂醯膽鹼。評估的另外的磷脂醯膽鹼具有不同的鏈長，並且具有不同的飽和度用以優化因臭氧產生而出現的溶解，同時保持在二氧化矽上的穩定性。據報導，所使用的一些磷脂醯膽鹼當它們是SLBs—部分時，由於臭氧生成而受到溶解，SLBs包括1，2-二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DMPC)、1，2- 二油醯-3-三甲胺-丙烷(DOTAP)和1-棕櫚醯基_2_油醯-sn_甘油-3-磷醯膽鹼(POPC) [23，24]。卵磷脂醯膽鹼具有低的轉變溫度(Tm)，並且因此能在室溫下保持液相，這使得它容易在室溫下用於在納米球上產生SLBs。
[0127] 根據卵磷脂醯膽鹼和上面列出的其他具有不同鏈長及飽和度的磷脂醯膽鹼的轉變溫度，調節它們的製備溫度，將它們混合。這些磷脂醯膽鹼包括DMPC[14:0] (即:碳鏈長為14且沒有不飽和鍵)、1，2- 二棕櫚醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DPPC) [16:0]、1，2- 二硬脂醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DSPC) [18:0]、1，2- 二油醯-sn_丙三基-3-磷酸膽鹼(DOPC) [18:1(A9-Cis]、P0PC[16:0-18:1]和 DOTAP [18:1]。測試每一個具有卵磷脂醯膽鹼佔磷脂醯膽鹼含量為10摩爾％、20摩爾％和40摩爾％的這些磷脂混合物。在測試這些SLBs響應於由色氨酸光化學生產的臭氧前，通過流式細胞術檢測螢光素隨時間推移的滲出量來確認SLBs在納米二氧化矽上的穩定性。任何不穩定的磷脂醯膽鹼將被排除在進一步的試驗中。
[0128]對支撐在封裝有螢光素的多孔二氧化矽納米球體上的穩定磷脂醯膽鹼混合物進行臭氧水解試驗，其中，臭氧由色氨酸光化學生產，並且通過流式細胞術檢測螢光素的釋放。所有樣品均和通過5% (w/v)TX100破壞的SLB陽性對照進行比較。陰性對照包括(I)相同的樣品沒有暴露到UV ;以及(2)相同的樣品沒有6BP的存在。其他陰性對照僅具有緩衝液或BSA來替代色氨酸。選擇最好的磷脂醯膽鹼混合物，其在缺乏臭氧時提供穩定性，但在臭氧存在時受到最大程度的溶解。最大程度的溶解定義為，當與TX100溶解(被認為是100%溶解)相比較時，該溶解釋放出~70%的螢光內容物。這樣的合理性在於，在我們的經驗中，TX100能導致最大程度的磷脂雙分子層的溶解，然而，生物分子通常導致減弱的溶解，例如，蜂毒肽(一種膜活性肽)導致70-80%的溶解(相對於TX100) [27，51]。
[0129]選擇最優的混合物後，測試將膽固醇加入到磷脂醯膽鹼混合物中，使其佔5摩爾％、10摩爾％或20摩爾％，從而評估在臭氧存在下，是否將增強溶解或具有相反的效果(即，穩定)。對於所有的試驗，收集3個重複的數據，並採用非參數Welch’s兩樣品t-檢驗來進行對比，其中任何低於0.05的P值均認為是統計學上顯著的。
[0130]確定捕獲在球體中的、流式細胞術可檢測的螢光素的優化量，應當是不會導致自淬滅[50]。如果需要，採用電暈放電臭氧發生器來生成臭氧，該臭氧發生器具有一整合的氧化還原控制器，用於控制生成的臭氧量，以及一氧化還原電位電極，用於測量輸出的臭氧量。
[0131]實施例3
[0132]在ROS存在的情況下，DOX的細胞毒性。
[0133]在OVCA治療中觀察到的一個改進是由於使用納米載體，使得OVCA的靶標加強了，以及使用化療試劑，而不是基於鉬和基於紫杉烷的治療(0VCA對此可變成抵抗性)。例如，採用由聚乙二醇(PEG )功能化的裝載有阿黴素的脂質體來治療OVCA，例如，Cadyx?(Schering-Plough)和LV,xiI 丨0 (Centocor Ortho Biotech) [5，52-54]。雖然 DOX 沒有在通常用於治療OVCA的化療試劑當中，但是，這些納米載體證明了在OVCA中使用阿黴素(DOX)的效力。正因為這樣，除了 DOX的螢光性質很容易使用螢光顯微法在細胞內檢測外，我們還計劃採用我們的系統來測試D0X。目標2測試由我們在ROS存在的情況下，本實驗方案中開發的載體中釋放的DOX的細胞毒性。因為這一理由，我們將對培養在OVCA細胞中的裝載有DOX的納米載體進行測試。臭氧通過共同培養巨噬細胞與OVCA細胞生成，巨噬細胞通過加入佛波醇酯(PMA)來激活[15-17，43，49]。這一系統將經過評估，因為它會刺激OVCA的體內炎症性環境。
[0134]採用修改的Boyden室試驗[55]，因為我們會在24孔板的插入膜上培養單層的OVCA細胞 (待測試的細胞包括0VCA433、0VCA429和SK0V_3ip)，而巨噬細胞(腹膜巨噬細胞系H36.12j)將以細胞懸浮液的狀態一起培養在插入膜放置的孔中。將納米載體加入到該插入膜上，而巨噬細胞將如前所述通過加入PMA來激活[15-17，43，49]。孵育24小時後，插入膜上細胞固定了，並且用DAPI將膜上的細胞的核進行染色，然後封固在玻片上通過螢光顯微鏡檢查。除了肉眼觀察細胞核外，可通過其螢光(480nm激發，550nm放射)檢測細胞中細胞DOX的攝取,該細胞攝取DOX但是還沒有死亡。細胞核的數目反應活細胞的數目，因此，對細胞的毒性是指減少的細胞核數目。
[0135]對於以上所有試驗，在確定使用藥物的最佳濃度後，向細胞中直接加入DOX使得細胞毒性達到至少70%來作為陽性對照。我們的數據表明，96%的細胞在與最終濃度為I μ M的DOX孵育72小時後死亡(參考下面的定量的重要事件)。陰性對照包括(I)沒有R0S，也沒有巨噬細胞激活；以及(2)加入缺乏DOX的納米載體，但能生產R0S。收集3個重複的數據，並採用非參數Welch’s兩樣品t-檢驗來進行對比，其中任何低於0.05的P值均認為是統計學上顯著的。以上描述的所有試驗，對於存在模仿體內炎症和ROS的生成的系統時，對於建立開發的納米載體在體內釋放其細胞毒性治療內容物到OVCA細胞的能力的概念驗證目的是至關重要的。
[0136]在這個目的中，我們建立了存在生成ROS的激活的巨噬細胞時，從本試驗方案開發的納米顆粒中釋放化療試劑到體外細胞的概念驗證。對於這個概念驗證,在體外使用的是微米球體，而不是納米球體。我們預期能溶解磷脂雙分子層的ROS將使得導致OVCA細胞死亡的細胞毒性DOX的釋放。這一目的僅有的潛在問題是激活的巨噬細胞可能會不足以產生R0S，因為體內的OVCA微環境富含包括自身抗體在內的抗體[57-59]和許多導致炎症性環境和ROS產生的多肽。如果是這樣的話，除了激活巨噬細胞外，我們會在培養基中加入色氨酸來產生R0S，從而測試釋放DOX的效果。
[0137]實施例4
[0138]定暈的重要事件
[0139]選擇最好的磷脂醯膽鹼混合物，其在缺乏ROS時提供穩定性，但在ROS存在時受到最大程度的溶解。在不存在ROS的情況下,最大穩定性被定義為< 15%的突光素洩露,而最大溶解被定義為當與採用5% (w/v)的TX100溶解(被認為是溶解100%)對比時，溶解釋放~70%的螢光內容物。這樣的合理性在於，在我們的經驗中，TX100能導致最大程度的磷脂雙分子層的溶解，然而，生物分子通常導致減弱的溶解，例如，蜂毒肽(一種膜活性肽)涉及70-80%之間的溶解(相對於TX100) [27，51]。
[0140]實施例3的試驗中證明了我們的平臺在24小時的孵育後，能製造至少70%的細胞毒性。我們的經驗中，僅用I μ M的DOX處理，24小時孵育後導致~45%的細胞毒性，並在72小時孵育後，導致~96%的細胞毒性(數據沒有顯示)。然而，對於納米載體，72小時可運行該納米載體的內在化，並且不論是否存在R0X，都會釋放D0X。正因如此，我們選擇24小時的孵育時間，因為此時的效果才會單單是ROS的作用，並且我們預期能達到~70%的細胞毒性。如果我們成功在體外進行，則為將來的R33應用提供了概念驗證，其中，這一平臺可以在OVCA的腹膜癌小鼠模型中進行體內測試。
[0141]結果。
[0142]在體外測試由激活的巨噬細胞產生的臭氧和活性氧對磷脂雙分子層的破壞。[0143]細朐:
[0144]H36.12j和RAW264.7巨噬細胞系從美國細胞培養收藏中心(ATCC，Manassas, VA)獲得。H36.12 j細胞在Delbecco改良的Eagles培養基(ATTC, Manassas, VA)中培養，其中補充有10%(v/v)熱滅活的補鐵小牛血清。在37°C，5% 二氧化碳的環境下進行繁殖。RAW264.7細胞在Delbecco改良的Eagles培養基(ATTC, Manassas, VA)中培養,其中補充有10% (v/v)胎牛血清。在37°C，10% 二氧化碳的環境下進行繁殖。
[0145]由激活的巨噬細胞來確定ROS的生成:
[0146]將細胞(0.2X IO6個細胞在500 μ I培養基中)移液到24孔板的每個孔中。採用最終濃度為I μ M的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA) (Sigma-Saint Louis, MO)刺激細胞30分鐘，然後與5 μ M的CellROX (Invitrogen)孵育30分鐘，從而檢測R0S。隨後，由流式細胞術檢測螢光值。結果顯示，PMA激活後，由巨噬細胞生成ROS (圖9)。
[0147]由激活的巨噬細胞來測試脂質的破壞:[0148]將細胞(I X IO5個細胞在500 μ I培養基中)移液到24孔板的每個孔中。向每個孔中加入色氨酸的PBS溶液，最終濃度為ImM。然後，向孔中加入包覆有脂質並封裝有螢光素的微米球。最後，加入最終濃度為50ng/ml的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Saint Louis, MO)或 DMSO 對照(Sigma-Saint Louis, MO)。孵育細胞 I 小時，並且收集上清液，使用流式細胞術檢查微米球的螢光值。測試的脂質是，卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的DOPC ;卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的D0TAP、卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的DMPC、卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的DSPC以及卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的DPPC。對照包括沒有細胞的球體，以及在PBS中的球體，而不是在培養基中。圖10顯示了在使用PMA激活巨噬細胞闡釋活性氧後，因為檢測到兩個脂質組分:卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的DOTAP和卵磷脂醯膽鹼中40摩爾％的DMPC的螢光值下降，表面支撐的磷脂雙分子層被明顯破壞了。
[0149]評估培養基、溫度和PMS對卵磷脂醯膽鹼組成的磷脂雙分子層的影響:
[0150]在沒有巨噬細胞的情況下，我們對加入PMA並在37°C孵育細胞是否對卵磷脂醯膽鹼組成的磷脂雙分子層產生影響進行評估。因此，我們重複了圖10的試驗，除了沒有加入任何的巨噬細胞。我們進行這些具有納米載體的試驗，評估以下條件:(I)納米載體在磷酸鹽緩衝液(PBS)中，對比在培養基中，(2)在室溫(RT)下孵育，對比在37°C下，以及(3)存在PMA，對比不存在PMA ;圖11顯示這些試驗的結果，表明在培養基中，培養基中的螢光值增加可以忽略不計，這是培養基中酚紅存在的直接結果。由於這種增加是可以忽略不計的，並且由於培養基的存在對於我們的細胞實驗是一個常量，因為其存在於每個樣品中，因此，這種極小的增加可以忽略。PMA的存在對納米載體沒有影響。溫度升高明顯降低螢光值，這對於卵磷脂醯膽鹼是預期的結果，並且對於其他脂質是需要進行評估的。
[0151]卵巢癌細胞中敲除葉酸受體a (FRa ):
[0152]我們的目的是為卵巢癌細胞系試驗進行挑選，選擇表達高水平的FRa的細胞系，同時選擇不表達FR a的細胞系作為陰性對照。RT-PCR檢查的卵巢癌細胞系包括0VCA432、0VCA420、SK0V-3、D0V13、0VCA433、0VCA429 和 0VEA6。圖 12 顯示了過度表達 FRa 的候選者:SK0V-3和0VCA432。以前報導了在0VCA432和SK0V-3中高水平的FRa，而其他細胞系在之前沒有進行過研究。我們將使用SK0V-3細胞作為後續試驗的陽性細胞系。
[0153]我們採用RNAi (01^861^，1?0010^116，]\?)敲除了51(0￥-3細胞中的？1^ 的表達，並且發現這消除了對葉酸-PEG功能化的納米載體的攝取，這表明通過FRa攝取這些納米載體的特異性(圖13)。
[0154]參考文獻:
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【權利要求】
1.一種納米載體組合物，其包含多個多孔納米微粒，所述多孔納米微粒(a)負載有一種或多種藥學活性試劑，以及(b)由磷脂雙分子層封裝，並支撐磷脂雙分子層，所述磷脂雙分子層與活性氧接觸而被破壞。
2.根據權利要求1所述的組合物，其適合於腹膜內給藥。
3.根據權利要求1所述的組合物，其適合於直接給藥到對象的癌或腫瘤中。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述納米微粒是由一種或多種選自由二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成。
5.根據權利要求1或2所述的組合物，其中當與臭氧或一活性氧接觸時，所述磷脂雙分子層受到最大程度的破壞。
6.根據權利要求1所述組合物，其中: Ca)所述一種或多種藥學活性試劑包括至少一種抗癌劑； (b)在沒有活性氧存在時，從所述多孔納米微粒中釋放出少於大約10%到大約20%的所述抗癌劑；以及 (c)基於與活性氧接觸導致磷脂雙分子層的破壞，所述多孔納米微粒釋放一定數量的抗癌劑，其約等於用5% (w/v)的Triton X-100溶解所述磷脂雙分子層後釋放的抗癌劑量的大約60%到大約80%。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米微粒是直徑在大約I到大約5微米之間的多孔二氧化矽納米微粒。
8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層由一種或多種選自由磷脂質和膽固醇組成的組中的脂質組成。
9.根據權利要求1所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層由一種或多種選自以下組中的磷脂質組成，所述組由1，2- 二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DMPC)、1，2- 二油醯-3-三甲胺-丙烷(D0TAP)、1-棕櫚醯基-2-油醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(P0PC)、卵磷醯膽鹼,和一脂質混合物,其中按重量算,包含大約40%到大約60%之間的一種或多種不飽和磷脂醯膽鹼，碳鏈長為14且沒有不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2- 二棕櫚醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DPPC) [16:0]、1，2- 二硬脂醯-sn-丙三基 _3_ 磷酸膽鹼(DSPC) [18:0]、1，2- 二油醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(D0PC)[18:l(A9-Cis]、P0PC[16:0-18:l]和 DOTAP [18:1]組成。
10.根據權利要求1所述組合物，其中: Ca)所述磷脂雙分子層由混合物組成，該混合物為(I)卵磷醯膽鹼和(2) —種或多種磷脂質，所述磷脂質選自由以下物質組成的組:1，2- 二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DMPC)U, 2- 二油醯-3-三甲胺-丙烷(DOTAP)U-棕櫚醯基_2_油醯-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(P0PC)，和一脂質混合物，其中一種或多種不飽和磷脂，優選磷脂醯膽鹼，碳鏈長為14且沒有不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2- 二棕櫚醯-sn-丙三基_3_磷酸膽鹼(DPPC) [16:0]、I,2- 二硬脂醯-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DSPC) [18:0]、1，2- 二油醯-sn-丙三基_3_磷酸膽鹼(DOPC) [18:l(A9-Cis]、P0PC[16:0-18:l]和 DOTAP [18:1];以及其中 (b)卵磷醯膽鹼在所述混合物在的摩爾濃度是佔所述磷脂雙分子層的大約40%到大約60%之間；以及 (c)所述一種或多種磷脂的摩爾濃度是佔所述磷脂雙分子層的大約40%到大約60%之間。
11.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米微粒的有效平均粒徑是小於大於 500nmo
12.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米微粒以結晶相、非晶相、半結晶相、半非晶相或它們的混合形式存在。
13.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米微粒是，介孔二氧化矽納米顆粒或核殼式納米顆粒。
14.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米微粒是生物可降解的聚合物納米微粒，其包含以下組中的一種或多種成分，所述組由脂肪族聚酯、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚已酸內酯(PCL)、聚酸酐、聚正酯、聚氨酯、聚丁酸、聚戍酸、聚(丙交酯-Co-己內酯)、褐藻膠(alginate)和其他多糖、膠原蛋白和它們的化學衍生物，白蛋白、玉米蛋白、醇溶谷蛋白、疏水蛋白以及它們的共聚物和混合物組成。
15.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米微粒由溶膠凝膠混合物組成，所述溶膠凝膠混合物通過在水的存在下，加入有機溶劑和金屬烷氧化物形成，並且其中所述金屬烷氧化物的金屬選自由T1、Zr、Sn、B、Al、Y、Au、Ag及它們的混合物組成的組。
16.根據權利要求1所述 的組合物，其中所述多孔納米顆粒由溶膠凝膠混合物組成，所述溶膠凝膠混合物通過在水的存在下，加入有機溶劑和矽烷氧化物形成。
17.根據權利要求1所述的組合物，其中所述多孔納米顆粒的每個均包含一具有核表面的核以及附著在所述核表面的殼，所述核表面本質上沒有二氧化矽，並且，其中所述殼包含選自由氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、硼化物、滷化物、硒化物、碲化物、氧化鉭、氧化鐵或它們的混合物組成的組中的一過渡金屬化合物。
18.根據權利要求1所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層是由一種或多種組分組成的，所述組分選自由磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯二乙醇胺、磷脂醯肌醇、鞘脂和乙氧基化留醇，以及它們的混合物組成的組。
19.根據權利要求18所述組合物，其中: Ca)所述磷脂是卵磷脂； (b)所述磷脂醯絲氨酸是來源於大豆、油菜、棉籽、卵和它們的混合物； (C)所述鞘脂是選自由神經醯胺、腦苷脂、鞘氨醇和鞘磷脂以及它們的混合物組成的組； Cd)所述乙氧基化留醇是選自由植物留醇、PEG-(聚乙二醇)-5-大豆留醇和PEG-(聚乙二醇)-5_油菜籽留醇組成的組。
20.根據權利要求17所述的組合物，其中所述植物留醇包含以下組分的至少兩種的混合物:谷留醇、菜油留醇和豆甾醇。
21.根據權利要求17所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層由一種或多種磷脂醯基組成，所述磷脂醯基選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯肌醇和溶血磷脂醯肌醇組成的組。
22.根據權利要求1所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層由選自單醯基或二醯基磷酸甘油脂的磷脂組成。
23.根據權利要求1所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層由一種或多種磷酸肌醇類組成，所述磷酸肌醇類選自由磷脂-醯肌醇-3-磷酸(P1-3-P)、磷脂醯-肌醇-4-磷酸(P1-4-P)、磷脂醯-肌醇-5-磷酸(P1-5-P)、磷脂醯-肌醇-3，4- 二磷酸(PI_3，4-P2)、磷脂醯-肌醇_3，5- 二磷酸(P1-3，5-P2)、磷脂醯-肌醇-4，5- 二磷酸(PI_4，5-P2)、磷脂醯-肌醇一3，4，5-三磷酸(P1-3，4，5-P3)、溶血磷脂醯-肌醇_3_磷酸(LP1-3-P)、溶血磷脂醯-肌醇-4-磷酸(LP1-4-P)、溶血磷脂醯-肌醇-5-磷酸(LP1-5-P)、溶血磷脂醯-肌醇_3，4- 二磷酸(LP1-3, 4-P2)、溶血磷脂醯-肌醇一3，5- 二磷酸(LP1-3，5-P2)、溶血磷脂醯-肌醇_4，5- 二磷酸(LP1-4，5-P2)和溶血磷脂醯-肌醇-3，4，5-三磷酸(LP1-3, 4，5-P3)，以及磷脂醯-肌醇-(PI)和溶血磷脂醯_肌醇(LPI)組成的組。
24.根據權利要求1所述的組合物，其中所述磷脂雙分子層由一種或多種磷脂質組成，所述磷脂質選自由PEG-聚(乙二醇)_衍生化的二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE)、PEG-聚(乙二醇)_衍生化的神經醯胺(PEG-CER)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、卵磷脂(EPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯甘油(PG)、磷脂醯肌醇(PI)、單唾液酸神經節苷脂、鞘磷脂(SPM)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蘧醯磷脂醯膽鹼(DMPC)和二肉豆蘧醯磷脂醯甘油(DMPG)組成的組。
25.根據權利要求1所述的組合物，其中一種或多種藥物活性試劑包括一抗癌劑，其選自由聚乙二醇功能化的裝載有阿黴素的脂質體、抗代謝物，拓撲異構酶I和II的抑制劑、烷化劑、微管抑制劑、小分子抑制劑，生物治療試劑和單克隆抗體，阿黴素、阿地白介素；阿侖單抗；阿利維A酸；別嘌呤醇；六甲蜜胺；阿米福汀；阿那曲唑；三氧化二砷；天冬醯胺酸酶；卡介苗活菌；蓓薩羅丁膠囊；蓓薩羅丁凝膠；博來黴素；白消安靜脈注射劑；白消安口服劑；卡普睪酮；卡培他濱；卡鉬；卡莫司汀；以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑；塞來昔布；苯丁酸氮芥；順鉬；克拉屈濱；環磷醯胺；阿糖孢苷；達卡巴嗪；更生黴素；放線菌黴素D ;阿法達貝泊汀；道諾黴素；道諾黴素；地尼白介素；右雷佐生；多烯紫杉醇；阿黴素；屈他雄酮丙酸酯；Elliott』 s B Solution ;表柔比星；阿法依泊汀；雌莫司汀；依託泊苷磷酸酯；依託泊苷(VP-16);依西美坦；非格司亭；氟尿苷(動脈注射);氟達拉濱；氟尿嘧啶(5-FU);氟維司群；吉西他濱；吉妥單抗；奧佐米星；醋酸戈舍瑞林；羥基脲；替伊莫單抗；伊達比星；異環磷醯胺；甲磺酸伊馬替尼；幹擾素a -2a ;幹擾素a -2b ;伊立替康；來曲唑；亞葉酸；左旋四咪唑；洛莫司汀(CCNU);氮芥(氮芥);醋酸甲地孕酮；美法侖(L-PAM)；巰嘌呤(6-MP );美司鈉；氨甲蝶呤；甲氧沙林；絲裂黴素C ;米託坦；苯丙酸諾龍；巰諾莫單抗(Nofetumomab)；LOddC ;奧普瑞白介素；奧沙利鉬；紫杉醇；帕米膦酸鹽；培加酶；培門冬酶；聚乙二醇化非格司亭；噴司他丁 ；哌泊溴烷；普卡黴素；光神黴素；卟吩姆鈉；甲苄肼；奎納克林；拉布立酶；利妥昔單抗；沙格司亭；鏈佐星；替比夫定(LDT);滑石(talc);他莫昔芬；替莫唑胺；替尼泊苷(VM-26);睪內酯；硫鳥嘌呤(6-TG);塞替派；拓撲替康；託瑞米芬；託西莫單抗；曲妥單抗；維甲酸(ATRA);烏拉莫司汀；戊柔比星；伐託他濱(一價LDC);長春花鹼；長春瑞濱；唑來膦酸及它們的混合物等。
26.根據權利要求25所述的組合物，其中所述納米微粒是由一種或多種選自由二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成。
27.根據權利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種藥學活性試劑是選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、 紫杉烷和基於鉬的化療劑組成的組。
28.根據權利要求1所述的組合物，其中所述納米載體的磷脂雙分子層與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03 )、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子(02_)和過氧亞硝基組成的組。
29.根據權利要求1-28中任一項所述的化合物，其適合於腹膜內給藥。
30.根據權利要求1-28中任一項所述的化合物，其適合於直接注射到待治療對象的癌/腫瘤中。
31.一種治療患有癌症的對象的方法，所述方法包括給所述對象施用藥學上有效量的根據權利要求1-30中任一項所述的納米載體組合物。
32.根據權利要求31所述方法，其中: Ca)所述對象患有腹膜癌，並且包含納米載體的所述組合物經腹膜給藥到所述對象的子宮; (b)所述納米載體包含納米微粒,所述納米微粒包含一種或多種選自由二氧化娃納米顆粒、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、基於金屬的納米顆粒和基於氧化物的納米顆粒組成的組中的成分； (c)給藥後，所述納米載體的磷脂雙分子層與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子((V)和過氧亞硝基組成的組；以及 Cd)所述納米載體的一種或多種藥學活性試劑包括一抗癌劑，該抗癌劑選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、紫杉烷和基於鉬的化療劑組成的組。
33.根據權利要求31或32所述的方法，其中將一種或多種額外的抗癌劑或抗癌治療法與所述納米載體組合物共同給藥所述對象。
34.根據權利要求33所述的方法，其中將額外的抗癌劑或抗癌治療法與納米載體組合物同時給藥所述對象。
35.根據權利要求31、33或34中任一項所述的方法，其中所述組合物直接給藥到癌/腫瘤。
36.一種治療患有腹膜癌的對象的方法，所述方法包括經腹膜給所述對象施用藥學上有效量的納米載體組合物，所述納米載體組合物包含多個多孔二氧化矽微粒，其: (a)裝載有一種或多種藥學活性試劑，選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、紫杉烷或基於鉬的化療劑組成的組，以及 (b)由磷脂雙分子層封裝，並支撐磷脂雙分子層來形成一納米載體，所述磷脂雙分子層是由一種或多種組分組成的，所述組分選自由磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯二乙醇胺、磷脂醯肌醇、鞘脂和乙氧基化留醇，以及它們的混合物組成的組； 其中，給藥後，所述納米載體的磷脂雙分子層在體內與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子((V)和過氧亞硝基組成的組。
37.一種藥物組合物，其包含: (a)包含多個多孔納米微粒的腹膜內給藥的納米載體組合物，所述多孔納米微粒(I)負載有一種或多種藥學活性試劑，以及(2)由磷脂雙分子層封裝，並支撐磷脂雙分子層，所述磷脂雙分子層在體內與活性氧接觸而被破壞；以及 (b)至少一種藥學上可接受的稀釋液或藥學上可接受的賦形劑。
38.根據權利要求37所述藥物組合物，其中: ( b)所述納米載體組合物包含納米顆粒,納米微粒是由一種或多種選自由二氧化娃、可生物降解的聚合物、溶膠凝膠、金屬和金屬氧化物組成的組中的成分組成； (c)所述納米載體的磷脂雙分子層在體內與活性氧(ROS)接觸而被破壞，所述活性氧選自由臭氧(03)、過氧化氫、次氯酸離子、羥基自由基、超氧陰離子((V)和過氧亞硝基組成的組；以及 Cd)所述納米載體的一種或多種藥學活性試劑包括一抗癌劑，該抗癌劑選自由阿黴素、美法侖貝伐單抗、更生黴素、環磷醯胺、阿米福汀、依託泊苷、吉西他濱、六甲蜜胺、拓撲替康、環磷醯胺、紫杉烷和基於鉬的化療劑組成的組。
39.根據權利要求1_30、37或38中任一項所述化合物在藥劑製造中的用途，所述藥劑用於治療對象中的癌症。
40.根據權利要求39所述的用途，其中所述藥劑適合於腹膜內給藥。
41.根據權利要求39所述的用途，其中所述藥劑適合於直接給藥到對象的癌/腫瘤中。
【文檔編號】A61K47/30GK103917224SQ201280045672
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年7月18日 優先權日:2011年7月19日
【發明者】R·澤伊內爾頓 申請人:Stc·Unm公司