一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型及其構建方法
2023-09-19 13:19:35
一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種動物模型及其構建方法，骨巨細胞瘤（GCT）在我國的發病率較高，目前尚未成功構建人骨巨細胞瘤動物模型。本發明提供了一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型及其構建方法，是將從人骨巨細胞瘤組織分離培養的原代細胞注射到裸小鼠的脛骨內，得到的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型。本發明所建立的人骨巨細胞瘤骨損傷小鼠動物模型中的溶骨性損害特徵與臨床上骨巨細胞瘤的病理特徵相似，存活的細胞為來源於人的骨巨細胞瘤基質細胞。應用本發明的動物模型可以用於系統研究骨巨細胞瘤的發病機制和進一步篩選治療骨巨細胞瘤的藥物。
【專利說明】一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物模型及其構建方法，尤其是涉及一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型及其構建方法。
【背景技術】
[0002]骨巨細胞瘤(giant cell tumor of bone,GCT)在我國的發病率較高，佔全部骨腫瘤的20%左右，其中脊柱是GCT好發部位之一(參見文獻Sung H.W.，Kuo D.P.，Shu W.P.，etal.Giant-cell tumor of bone:analysis of two hundred and eight cases in Chinesepatients[J], J Bone Joint Surg Am, 1982，64(5):755-761.)。長徵醫院骨腫瘤科近 5 年平均每年收治脊柱GCT患者在60例以上。GCT具有較強的侵襲性和高復發性，術後局部復發率高達 30-50% (參見文獻 Hart R.A., Boriani S., Biagini R., et al.A system forsurgical staging and management of spine tumors.A clinical outcome study ofgiant cell tumors of the spine[J].Spine(Phila Pal976)，1997，22(15):1773-1782;discussionl783.)。對於脊柱GCT術後復發的患者，由於局部解剖結構的改變，腫瘤惡性程度的升級，使得再次手術切除的難度明顯加大，甚至無法進行手術。
[0003]因此，預防和治療脊柱GCT已成為脊柱腫瘤外科領域的一大難題，亟需探尋新的治療方法。
[0004]探 尋新的治療方法和靶向藥物，首先需要對GCT的生物學特徵進行深入的剖析並建立相應的動物模型。組織學研究表明，GCT包含三種特徵的細胞，即具有腫瘤特性的紡錘形基質細胞、破骨細胞特徵的多核巨細胞和圓形的單核細胞。多核巨細胞其具有CD14+和 CD68+ (參見文獻 Huang T.S., Green A.D., Beattie C.ff., et al.Monocytenacrophagelineage of giant cell tumor of bone.Establishment of a multinucleated cellline [J].Cancer, 1993，71 (5): 1751-1760.；Liao T.S.，Yurgelun M.B.，Chang S.S.，etal.Recruitment of osteoclast precursors by stromal cell derived factor-1 (SDF-1)in giant cell tumor of bone [J].J Orthop Res，2005，23 (I): 203-209.)，CD14 是外周血單核細胞的特異性標記物之一，而CD68是巨噬細胞的標記物。由此表明，GCT多核巨細胞來源於血液中的單核細胞融合而成。基質細胞由於表達成骨細胞的早期標記物(參見文獻 Salerno M., Avnet S., Alberghini M., et al.Histogenetic characterization ofgiant cell tumor of bone[J].Clin Orthop Relat Res，2008，466(9):2081-2091.)被認為來源於骨髓間充質幹細胞。通過氣標記和DNA陣列、端粒酶活性、染色體拷貝數等技術證明了 GCT基質細胞具有遺傳不穩定性的特徵(參見文獻Roessner A.，von BassewitzD.B.，Schlake W.，et al.Biologic characterization of human bone tumors.1I1.Giant cell tumor of bone.A combined electron microscopical，histochemical，andautoradiographical study [J].Pathol Res Practj 1984，178(5):431-440.；MoskovszkyL., Szuhai K., Krenacs T.,et al.Genomic instability in giant cell tumor ofbone.A study of 52cases using DNA ploidy,relocalization FISH, and array-CGHanalysis[J].Genes Chromosomes Cancer，2009，48(6):468-479.；Gorunova L，Vult vonSteyern F., Storlazzi C.T., et al.Cytogenetic analysis of IOlgiant cell tumorsof bone:nonrandom patterns of telomeric associations and other structuralaberrations[J].Genes Chromosomes Cancer, 2009，48(7):583-602.；Forsyth R.G.，DeBoeck G.,Bekaert S.,et al.Telomere biology in giant cell tumour of bone [J].J Pathol,2008，214(5):555-563.;Gebre-Medhin S.，Broberg K.,Jonson T.，etal.Telomeric associations correlate with telomere length reduction and clonalchromosome aberrations in giant cell tumor of bone[J].Cytogenet GenomeRes，2009，124 (2): 121-127.)。因此，基質細胞被認為是GCT中的腫瘤成分。
[0005]然而，採用分離後的基質細胞進行裸鼠體內荷瘤實驗並不能複製出臨床GCT的病理學特徵(參見文獻 Haque A.U., Moatasim A.Giant cell tumor of bone:a neoplasm ora reactive condition?[J].1nt J Clin Exp Pathol, 2008，I (6):489-501.)。另外，通過將組織塊直接接種在雞胚絨毛囊膜上可短期維持GCT組織的存活，但周期只有10天(參見文獻 Balke M., Neumann A., Szuhai K., et al.A short-term in vivo model for giantcell tumor of bone[J].BMC Cancer, 2011，11:241.)。所以，目前尚無文獻報導有關成功構建人骨巨細胞瘤動物模型。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型。
[0007]本發明所要解決的技術問題是提供一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建。
[0008]本發明的主要技術方案是，將從人骨巨細胞瘤組織分離培養的原代細胞注射到裸小鼠的脛骨內，得到的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型。
[0009]本發明的第一方面，是提供了一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法，該方法包括如下步驟:
[0010](A)從骨巨細胞瘤的臨床手術標本中分離出人的骨巨細胞瘤原代細胞；
[0011](B)將原代培養的骨巨細胞瘤細胞用PBS洗滌，經0.25%胰酶消化，血細胞計數器計數，採用PBS重懸，使細胞終濃度為5 XlO4AAil人骨巨細胞瘤原代細胞；
[0012](C)採用顯微注射器在X線觀察下，將10~30ul步驟(B)得到的人骨巨細胞瘤原代細胞注射到裸小鼠的脛骨內；
[0013](D)採用X線觀察裸小鼠脛骨的骨質變化情況。
[0014]所述的步驟(B)，具體為:將原代培養的骨巨細胞瘤細胞用PBS洗滌2遍，經0.25%胰酶37°C消化3分鐘，用等體積含有10%FBS的a -MEM中和，800rmp離心5min，血細胞計數器計數，去上清後採用PBS重懸,使細胞終濃度為5 X IO4個/ul人骨巨細胞瘤原代細胞。
[0015]所述的步驟(C)，具體為:採用顯微注射器在X線觀察下，將20ul步驟(B)得到的人骨巨細胞瘤原代細胞注射到裸小鼠的脛骨內。
[0016]所述的步驟(D)之後，還包括步驟(E)即:取出裸小鼠脛骨，經4%多聚甲醛固定後石蠟包埋，再經切片製成4uM組織切片，採用HE、TRAP和抗人線粒體染色，觀察骨組織大體形態、破骨細胞活性及細胞來源。
[0017]所述的步驟(E),具體為:胚骨內注射原代骨巨細胞瘤細胞2個月後,麻醉處死裸小鼠，取出脛骨經4%多聚甲醛固定24h後，經0.5M的EDTA脫鈣10天，再經梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡(即脫水至蠟處理)，石蠟包埋，切成4uM厚度切片。採用HE、TRAP及抗人線粒體免疫螢光染色，發現人骨巨細胞瘤骨損傷模型中的溶骨性損害特徵與臨床上骨巨細胞瘤的病理特徵相似，可激活大量的破骨細胞從而導致溶骨性破壞，存活在裸小鼠脛骨內的細胞經抗人線粒體免疫螢光染色顯示為陽性，表明其來源於人的骨巨細胞瘤基質細胞。
[0018]本發明的第二方面，是提供了一種根據上述構建方法得到的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型，該人骨巨細胞瘤小鼠動物模型具有以下特徵:
[0019]1、經注射人骨巨細胞瘤原代細胞後的裸小鼠脛骨的溶骨性損害特徵與骨巨細胞瘤的臨床X線表現一致，即為單純性的溶骨性破壞，無骨膜反應；
[0020]2、HE染色可觀察到與X線部位一致的溶骨性破壞；TRAP染色顯示原代骨巨細胞瘤細胞可引起裸小鼠脛骨近端破骨細胞活化，引起溶骨性破壞；抗人線粒體免疫螢光染色可觀察到骨破壞區域的細胞具有抗人線粒體免疫螢光陽性染色，表明其來源於人的骨巨細胞瘤細胞。
[0021 ] 本發明的第三方面，是提供了上述人骨巨細胞瘤小鼠動物模型在篩選治療人骨巨細胞瘤的藥物中的應用。
[0022]本發明的構建方法獨特，技術操作簡便，動物模型成功率高。實驗資料證明:所建立的人骨巨細胞瘤骨損傷小鼠動物模型中的溶骨性損害特徵與臨床上骨巨細胞瘤的病理特徵相似，存活的細胞為來源於人的骨巨細胞瘤基質細胞。應用此種骨巨細胞瘤骨損傷小鼠動物模型可以用於系統研究骨巨細胞瘤的發病機制和進一步篩選治療骨巨細胞瘤的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為體外培養的原代骨巨細胞瘤細胞相差圖；
[0024]其中A-C為3個骨巨細胞瘤患者腫瘤組織分離培養的原代細胞，圖中*所示為多核的巨細胞，>所示為單核細胞，一所示為梭形或紡錘形的基質細胞。由圖可見，分離培養的骨巨細胞瘤原代細胞包含骨巨細胞瘤各種細胞成分。
[0025]圖2為裸小鼠脛骨內注射方法示意圖；
[0026]基中A為脛骨注射的示意圖；B為乂線下觀察到的顯微注射針的進針位置。脛骨注射時，採用阿弗丁將裸小鼠麻醉後，暴露脛骨，採用纖維注射針緩慢左右旋轉進針，經X線確定顯微注射針已進入脛骨髓腔，緩慢將20ul的骨巨細胞瘤原代細胞注射到脛骨髓腔內，縫合切口。
[0027]圖3為骨巨細胞瘤原代細胞注射到裸小鼠脛骨前後的X線表現圖；
[0028]X線可觀察到，在裸小鼠脛骨近端(即幹骺端)部位出現了單純性溶骨性破壞。
[0029]圖4為脛骨切片的HE染色圖。
[0030]圖5為脛骨切片的TRAP染色圖；
[0031]其中A和D為4倍物鏡觀察到的裸小鼠注射原代骨巨細胞瘤細胞後的TRAP染色結果和E為局部放大TRAP染色結果；(:和F為B和E對應的HE染色結果。由圖可見，裸小鼠注射原代骨巨細胞瘤細胞後可引起TRAP染色增強，表明破骨細胞活性明顯升高。
[0032]圖6為抗人線粒體(ant1-human mitochondria)免疫突光染色圖；[0033]其中A為抗人線粒體免疫螢光染色(綠色)；B為DAPI染色(藍色)，即所有細胞核著色；C為々和B的疊加圖片山為C對應的HE染色。由圖可見，在骨損傷部位可觀察到抗人線粒體陽性染色的細胞，提示該細胞來源於人。
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細描述。但下列實施例不應看作對本發明範圍的限制。
[0035]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0036]實施例1:本發明的人骨巨細胞瘤骨損傷小鼠動物模型的構建
[0037]1、骨巨細胞瘤原代細胞的分離與培養
[0038]將臨床組織活檢診斷為骨巨細胞瘤的手術標本放置於生理鹽水中，在無菌條件下清除腫瘤組織表面血塊、壞死組織、脂肪和結締組織，用滅菌後的眼科剪將組織剪碎，經無菌PBS洗2-3次，加入少量PBS，用彎頭眼科剪，反覆剪切組織，直到組織成糊狀，約Imm3大小。加入II型膠原酶，370C消化30min，加入5ml含10%FBS的a -MEM培養基終止消化，經IOOum過濾網過濾,800rmp離心5min,去除上清,加入IOml含10%FBS的a -MEM培養基重懸細胞，將細胞懸液接種於IOcm的培養皿中，置於5%C02培養箱內，37°C靜置培養，兩天換液一次，待細胞生長至80%時，經0.25%胰酶37°C消化，按1:3傳代培養。待細胞貼壁後倒置相差顯微鏡可觀察到原代分離的骨巨細胞瘤細胞包含骨巨細胞瘤的三種細胞成分。(如圖1所示)
[0039]2、人骨巨細胞瘤裸小鼠動物模型的製備
[0040]將原代培養的骨巨細胞瘤細胞採用PBS洗滌2遍，經0.25%胰酶37°C消化3分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，發現細胞變圓、收縮突起時，以等體積含有10%FBS的a -MEM終止消化，收集細胞懸液，800rmp離心5min，經血細胞計數器計數後，去除上清後採用PBS重懸，使細胞終濃度為5 X IO4個/ul人骨巨細胞瘤原代細胞。
[0041]如圖2所示的方法，採用眼科剪剪開裸小鼠膝關節處皮膚，暴露脛骨，在X線觀察下顯微注射器針頭插入裸小鼠脛骨內，將20ul上述人骨巨細胞瘤原代細胞注射到裸小鼠的脛骨髓腔內，每周經X線觀察一次裸小鼠脛骨的骨質變化情況。
[0042]實施例2:實施例1構建方法得到的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的特徵研究
[0043]實施例1胚骨內注射原代骨巨細胞瘤細胞2個月後,麻醉處死裸小鼠,取出胚骨經4%多聚甲醛固定24h後，0.5M的EDTA脫鈣處理10天，再經梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡(即脫水至蠟處理)，石蠟包埋，切成4uM厚度切片。採用HE、TRAP及抗人線粒體免疫螢光染色，觀察裸小鼠脛骨大體形態學變化、破骨細胞活性及細胞來源的情況。
[0044]1、經注射人骨巨細胞瘤原代細胞後的裸小鼠脛骨的溶骨性損害特徵與骨巨細胞瘤的臨床X線表現一致，即為單純性的溶骨性破壞，無骨膜反應(如圖3所示)；
[0045]2,HE染色可觀察到與X線部位一致的溶骨性破壞(如圖4所示);TRAP染色顯示原代骨巨細胞瘤細胞可引起裸小鼠脛骨近端破骨細胞活化，引起溶骨性破壞(如圖5所示);抗人線粒體免疫螢光染色可觀察到骨破壞區域的細胞具有抗人線粒體免疫螢光陽性染色，表明其來源於人的骨巨細胞瘤細胞(如圖6所示)。
[0046] 以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定 。
【權利要求】
1.一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟: (A)從骨巨細胞瘤的臨床手術標本中分離出人的骨巨細胞瘤原代細胞； (B)將原代培養的骨巨細胞瘤細胞用PBS洗滌，經0.25%胰酶消化，血細胞計數器計數，採用PBS重懸，使細胞終濃度為5 X 1O4個/ul人骨巨細胞瘤原代細胞； (C)採用顯微注射器在X線觀察下，將10~30ul步驟(B)得到的人骨巨細胞瘤原代細胞注射到裸小鼠的脛骨內； (D)採用X線觀察裸小鼠脛骨的骨質變化情況。
2.根據權利要求1所述的一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的步驟(B)，具體為:將原代培養的骨巨細胞瘤細胞用PBS洗滌2遍，經0.25%胰酶37°C消化3分鐘，用等體積含有10%FBS的a -MEM中和，800rmp離心5min，血細胞計數器計數，去上清後採用PBS重懸，使細胞終濃度為5 X 1O4個/ul人骨巨細胞瘤原代細胞。
3.根據權利要求1所述的一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的步驟(C)，具體為:採用顯微注射器在X線觀察下，將20ul步驟(B)得到的人骨巨細胞瘤原代細胞注射到裸小鼠的脛骨內。
4.根據權利要求1所述的一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的步驟(D)之後，還包括步驟(E)即:取出裸小鼠脛骨，經4%多聚甲醛固定後石蠟包埋，再經切片製成4uM組織切片，採用HE、TRAP和抗人線粒體染色，觀察骨組織大體形態、破骨細胞活性及細胞來源。
5.根據權利要求4所述的一種人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的步驟(E)，具體為:脛骨內注射原代骨巨細胞瘤細胞2個月後，麻醉處死裸小鼠，取出脛骨經4%多聚甲醛固定24h後，經0.5M的EDTA脫鈣10天，再經梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡，石蠟包埋，切成4uM厚度切片。
6.一種如權利要求1至5任一所述的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型的構建方法得到的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型。
7.根據權利要求6所述的人骨巨細胞瘤小鼠動物模型在篩選治療人骨巨細胞瘤的藥物中的應用。
【文檔編號】A01K67/02GK103911342SQ201310006583
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月8日 優先權日:2013年1月8日
【發明者】肖建如, 徐樂勤, 吳志鵬, 楊興海, 周振華, 黃權, 林在俊, 萬維, 矯健, 蔡小攀, 陳素, 許煒, 祝傾, 劉鐵龍, 嚴望軍, 楊誠, 錢明, 李珍惜, 周旺 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學