一種人血管瘤動物模型及其構建方法和應用的製作方法
2023-09-19 13:06:40 2
專利名稱：一種人血管瘤動物模型及其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種動物模型及其構建方法和應用，具體地說，是一種血管瘤幹細胞和臍靜脈血內皮細胞共同構建的人血管瘤動物模型及其構建方法和應用。
背景技術：
血管瘤是嬰幼兒期最常見的高發性良性腫瘤，發病率高達5_10%。，儘管能夠自發性不同程度地消退，但約60%的血管瘤發生在頭面部，會造成畸形，影響美觀；如果發生在重要器官也可能由於腫瘤血管的破裂造成死亡的危險。目前為止，血管瘤的形成機理不明。很大程度是由於沒有建立真正意義上人血管瘤動物模型造成缺乏對其基礎研究的深入及對治療該腫瘤的藥物的篩選模型。目前報導的建立動物模型的方法有多瘤病毒及基因轉錄、血管瘤組織移植法、血管生長因子轉基因技術的應用和血管瘤幹細胞移植技術；但是這些血管瘤動物模型都不能模擬血管瘤生長、消退的自然過程，而且不能表現出類似的組織病理特點。由於人類血管瘤並不發生在其他物種，進一步增加了建立動物模型的難度。中國專利申請號200610087309. 4公開了一種人血管瘤鼠動物模型及其構建方法，該發明應用人血管瘤內皮細胞和人骨肉癌細胞系H0S、人肝癌細胞系Bel-7402或人肝癌細胞系IfepG2共同移植法建立了人血管瘤鼠動物模型。但是該方法有發展成為惡性腫瘤潛在的危險，仍然不能模擬血管瘤生長、消退的自然過程，而且不能表現出類似的組織病理特點。因此需要建立一種血管瘤的實驗動物模型，克服上述已有的動物模型的缺點，建立完全類似人類的血管瘤的特性，用來研究人類的血管瘤的發生機制和篩選出特效藥物等。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種人血管瘤動物模型。本發明的再一的目的是，提供一種人血管瘤動物模型的構建方法。本發明的另一的目的是，提供一種人血管瘤動物模型的應用。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是一種人血管瘤動物模型，所述的動物模型由以下方法構建
a、取人血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞備用；
b、將8X105 IXlOici血管瘤幹細胞和7X104 1X IOltl個人臍靜脈內皮細胞用 100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於100 μ 1蛋白濃度18_2aiig/mL的Matrigel膠中；
C、用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞混合物接種到免疫缺陷的動物皮下。所述的人血管瘤幹細胞數量為8X IO5 IX IO8個，人臍靜脈內皮細胞數量為 7 X IO4 IXlO8 個。所述的人血管瘤幹細胞數量為IXio6 IXlO7個，人臍靜脈內皮細胞數量為 7 X IO5 IXlO6 個。
所述的人血管瘤幹細胞數量為IXio6個，人臍靜脈內皮細胞數量為7X105個。所述的免疫缺陷的動物是指T細胞免疫缺陷的裸鼠或T細胞和B細胞嚴重聯合免疫缺陷的SCID鼠。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是所述的動物模型的構建方法包括以下步驟
a、取人血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞備用；
b、將8X105 IXlOici血管瘤幹細胞和7X104 1X IOltl個人臍靜脈內皮細胞用 100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於100 μ 1蛋白濃度18_2aiig/mL的Matrigel膠中；
C、用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞混合物接種到免疫缺陷的動物皮下。所述的人血管瘤幹細胞數量為8X IO5 IX IO8個，人臍靜脈內皮細胞數量為 7 X IO4 IXlO8 個。所述的免疫缺陷的動物是指T細胞免疫缺陷的裸鼠或T細胞和B細胞嚴重聯合免疫缺陷的SCID鼠。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是所述的人血管瘤動物模型在人血管瘤形成機理的研究和製備治療人血管瘤的藥物中的應用。本發明優點在於
1、本發明形成的血管瘤完全具有人源化的特點，克服以往只有部分的人源特性，應用螢光蛋白示蹤技術證實，所形成的血管瘤由完全具有人源化的細胞組成；
2、形成的血管瘤模型完全具有人類血管瘤的病理特點，病理組織學基礎實驗也證實， 血管瘤組織中存在膨大的血竇樣結構和新生的毛細管等，這些病理特點與人類的血管瘤組織非常相似；
3、本發明的動物模型非常適合於人血管瘤的發病機理研究和開發治療人類血管瘤的藥物或方法，及評價各種治療血管瘤藥物的療效和篩選治療血管瘤的藥物。
附圖1是體外培養的人血管瘤幹細胞及其鑑定。A.用MTT分析檢測的生長曲線顯示分離培養出來的幹細胞具有旺盛的增殖能力，在10天內細胞數目擴增到了初始的16倍； B. RT-PCR結果顯示⑶133分選出來的陽性細胞表達幹細胞特異性基因0ct_4，而陰性細胞明顯表達明顯減弱，S9為內參；C.流式細胞分析顯示分離培養的幹細胞表達CD^KCD44等間充質幹細胞的標記。附圖2是對照組皮下注射HUVEC的Matrigel凝膠。附圖3是皮下注射HemSC+HUVEC的Matrigel凝膠。
附圖4是皮下注射HemSC+HUVEC成瘤組織的HE切片。附圖5是腫瘤動物模型。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1①血管瘤幹細胞(HemSC)的分離、培養
a、取新鮮離體的人血管瘤組織，用加雙抗的DMEM液反覆衝洗組織塊，去除血凝塊。b、將標本放入IOcm2細胞培養皿中，加入少許DMEM培養液浸潤，用眼科剪將組織塊剪成Imm長條狀，用DPBS再次反覆衝洗去除殘餘的血凝塊後放入15ml離心管中，加入濃度為2.如/ml的中性蛋白酶II (Dispase II)溶液10 ml，於4度冰箱過夜。c、取出15ml離心管，吸去中性蛋白酶II液，用PBS洗2遍，將組織塊放入IOcm2細胞培養皿中，用眼科剪將組織剪成Imm3大小的組織碎片後，置於15ml離心管中，加入IOml 的0. 2% I型膠原酶在37度水浴箱搖床內消化3h，在膠原酶消化2小時時加入濃度為25u/ ml的DNA酶Iml共消化1小時。d、以800g離心力離心5分鐘，棄上清，用DMEM液重懸，重複1次以去淨脂肪。e、先以150目金屬濾網過濾細胞懸液，再以一次性30 μ m無菌濾膜過濾，濾液以 600g離心5分鐘，棄上清，用5mlPBS/0. 1%BSA液重懸，血球計數板計數。②血管瘤幹細胞磁珠分選
a、以300g離心細胞懸液10分鐘，完全吸去上清；
b、加300 μ 1PBS/0. 1%BSA 液重懸；
C、加入100 μ 1 FcR封閉液(Miltenyi磁珠試劑盒)；
d、加入100μ 1的CD133磁珠；
e、混合好後在4度孵育30分鐘，每5分鐘搖勻一次；
f、加入2ml的PBS/0.5% BSA液洗並以300g離心10分鐘，棄上清；
g、加入500 μ 1 的 PBS/0. 5% BSA 液重懸；
h、將磁珠安放在磁鐵上；
i、用500μ 1的PBS/0. 5% BSA液洗柱預備；
j、把細胞加入柱中，收集流下的未標記的細胞；
k、用500 μ 1的PBS/0. 5% BSA液洗柱3次，收集流下的未標記細胞；
1、去除磁鐵並換收集管；
m、吸取lml500 μ 1的PBS/0. 5% BSA液加入磁柱，洗出磁珠標記的細胞，洗3次，最後1 次通過穩推最大限度地洗出磁珠標記的細胞。重複h-m步一次以提高純度；
η、細胞懸液以300g離心10分鐘，將分選出的⑶133陽性細胞加入EGM_2/20%FBS培養基在6孔板內培養。③血管瘤幹細胞(HemSC)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)構建血管瘤動物模型
a、將培養的血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞用0.25%胰酶/0. 02%EDTA消化；
b、計數後，各取含IXlO6和7XIO5個細胞的消化液混合於15ml離心管中，另取 1. 5 X IO6人臍靜脈內皮細胞作為對照，以600g離心5分鐘，棄上清；
C、加入100 μ 1的EGM-2/20%FBS預冷培養液重懸細胞，並加入100 μ 1的高濃度 Matrigel膠(BD公司，含蛋白18_22mg/mL)中混勻，對照組同法操作；
d、取Iml注射器，吸取總共200 μ 1的混合液，注射於6_8周大的免疫缺陷動物皮下。所述血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞的數量8X IO5 1 X 101°血管瘤幹細胞和7X104 IXlOici個人臍靜脈內皮細胞。優選的血管瘤幹細胞數量為IXlO5 1X108， 更優選為IXlO6 IXlO7個，最優選為IXlO6個；和優選的人臍靜脈內皮細胞數量為7 X IO4 IX IO8個，更優選為7 X IO5 IX IO6個，最優選為7 X IO5個。用無血清的DMEM 培養基洗滌，除去培養基中的血清，然後重新懸浮於0. 05 0. 2毫升的高濃度Matrigel膠 (含蛋白 18-22mg/mL)中。所述的免疫缺陷動物包括T細胞免疫缺陷的裸鼠，如裸大鼠或小鼠(BALB/c-nu裸鼠)、T細胞和B細胞嚴重聯合免疫缺陷的鼠如SCID鼠、免疫缺陷的兔子及猴子等。請參照附圖1，附圖1是體外培養的人血管瘤幹細胞及其鑑定。A.用MTT分析檢測的生長曲線顯示分離培養出來的幹細胞具有旺盛的增殖能力，在10天內細胞數目擴增到了初始的16倍；B. RT-PCR結果顯示⑶133分選出來的陽性細胞表達幹細胞特異性基因 Oct-4，而陰性細胞明顯表達明顯減弱，S9為內參；C.流式細胞分析顯示分離培養的幹細胞表達⑶四、⑶44等間充質幹細胞的標記。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。請參照附圖2、附圖3和附圖4，附圖2是對照組皮下注射HUVEC的Matrigel凝膠，附圖3是皮下注射HemSC+HUVEC的Matrigel凝膠，附圖4是皮下注射HemSC+HUVEC成瘤組織的HE切片。20-30天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。請參照附圖5，附圖5 是腫瘤動物模型。病理組織檢查發現，動物模型的組織中存在內含紅細胞和大量的新生血管等。我們從免疫組化實驗及組織切片等實驗同嬰兒血管瘤標本進行了對照，發現幾乎各項指標等同於嬰兒血管瘤的特徵。這種動物模型非常適合於人血管瘤的發病機理研究和開發治療人類血管瘤的藥物或方法，及評價各種治療血管瘤藥物的療效和篩選治療血管瘤的藥物。血管瘤的內皮細胞是從人的臍靜脈的內皮組織分離純化和培養來，血管瘤的瘤細胞也是從人的血管瘤的組織細胞中分離純化和培養來，因此整個血管瘤完全具有人源化的特點，克服以往只有部分的人源特性。應用螢光蛋白示蹤技術證實，在動物模型的血管和腫瘤細胞都存在大量的螢光，表明所形成的血管瘤完全具有人源化的細胞組成。由於接種的兩種細胞都是人源化的細胞，故形成的血管瘤模型完全具有人類血管瘤的病理特點，病理組織學基礎實驗也證實血管瘤組織中存在膨大的血竇樣結構和新生的毛細管等。這些病理特點與人類的血管瘤組織非常相似。實施例2
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將8X IO5的血管瘤幹細胞和7 X IO4的人臍靜脈內皮細胞用100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中；
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞(HemSC)和臍靜脈內皮細胞(HUVEC)共同接種到免疫缺陷的BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。
實施例3
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將1X IO6的血管瘤幹細胞和7 X IO5的人臍靜脈內皮細胞用100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中；
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞共同接種到BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。實施例4
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將IXlO7的血管瘤幹細胞和IXIOki的人臍靜脈內皮細胞用100μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞共同接種到BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。實施例5
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將1X IO8的血管瘤幹細胞和1 X IO6的人臍靜脈內皮細胞用100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞共同接種到BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。實施例6
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將1X IO9的血管瘤幹細胞和1 X IO8的人臍靜脈內皮細胞用100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞共同接種到BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。實施例7
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將IXIOki的血管瘤幹細胞和IXlO9的人臍靜脈內皮細胞用100μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞共同接種到BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。實施例8
①分別從人血管瘤的臨床手術標本中分離出人血管瘤幹細胞和人臍靜脈中分離出內皮細胞並進行培養擴增；
②將1X 101°的血管瘤幹細胞和1 X 101°的人臍靜脈內皮細胞用100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於同樣體積的高濃度Matrigel膠(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞共同接種到BALB/c-nu裸鼠皮下。本發明建立的血管瘤的動物模型形態和組織結構都非常類似於人類的血管瘤，而且形成的時間快，幾乎一周後觀察凝膠內的血管形成情況，就能觀察HE切片均可見血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞共注射組凝膠內有多量血管形成，對照組則無血管形成。14天後在細胞接種的地方出現非常明顯的人類血管瘤腫塊。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。
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權利要求
1.一種人血管瘤動物模型，其特徵在於，所述的動物模型由以下方法構建a、取人血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞備用；b、將8X105 IXlOici血管瘤幹細胞和7X104 1X IOltl個人臍靜脈內皮細胞用 100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於100 μ 1蛋白濃度18_2aiig/mL的Matrigel膠中；C、用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞混合物接種到免疫缺陷的動物皮下。
2.根據權利要求1所述的人血管瘤動物模型，其特徵在於，所述的人血管瘤幹細胞數量為8X IO5 IX IO8個，人臍靜脈內皮細胞數量為7X IO4 IX IO8個。
3.根據權利要求1所述的人血管瘤動物模型，其特徵在於，所述的人血管瘤幹細胞數量為1 X IO6 1 X IO7個，人臍靜脈內皮細胞數量為7 X IO5 1 X IO6個。
4.根據權利要求1所述的人血管瘤動物模型，其特徵在於，所述的人血管瘤幹細胞數量為1 X IO6個，人臍靜脈內皮細胞數量為7 X IO5個。
5.根據權利要求1所述的人血管瘤動物模型，其特徵在於，所述的免疫缺陷的動物是指τ細胞免疫缺陷的裸鼠或T細胞和B細胞嚴重聯合免疫缺陷的SCID鼠。
6.根據權利要求1-5任一所述的人血管瘤動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的動物模型的構建方法包括以下步驟a、取人血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞備用；b、將8X105 IXlOici血管瘤幹細胞和7X104 1X IOltl個人臍靜脈內皮細胞用 100 μ 1的EGM-2培養液重懸，然後混勻於100 μ 1蛋白濃度18_2aiig/mL的Matrigel膠中；C、用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞混合物接種到免疫缺陷的動物皮下。
7.根據權利要求6所述的人血管瘤動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的人血管瘤幹細胞數量為8 X IO5 1 X IO8個，人臍靜脈內皮細胞數量為7 X IO4 1 X IO8個。
8.根據權利要求6所述的人血管瘤動物模型的構建方法，其特徵在於，所述的免疫缺陷的動物是指T細胞免疫缺陷的裸鼠或T細胞和B細胞嚴重聯合免疫缺陷的SCID鼠。
9.根據權利要求1-5任一所述的人血管瘤動物模型，其特徵在於，所述的人血管瘤動物模型在人血管瘤形成機理的研究和製備治療人血管瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種人血管瘤動物模型，所述的動物模型由以下方法構建a、取人血管瘤幹細胞和人臍靜脈內皮細胞備用；b、將8×105～1×1010血管瘤幹細胞和7×104～1×1010個人臍靜脈內皮細胞用100μl的EGM-2培養液重懸，然後混勻於100μl蛋白濃度18-22mg/mL的Matrigel膠中；c、用注射器將上述人血管瘤幹細胞和臍靜脈內皮細胞混合物接種到免疫缺陷的動物皮下。本發明還提供了這種人血管瘤動物模型的構建方法和用途。本發明優點在於所形成的血管瘤由完全具有人源化的細胞組成；血管瘤模型完全具有人類血管瘤的病理特點；非常適合於人血管瘤的發病機理研究和開發治療人類血管瘤的藥物或方法。
文檔編號A61K49/00GK102239821SQ20111011883
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月10日 優先權日2011年5月10日
發明者袁偉恩, 鄭家偉, 麥華明 申請人:袁偉恩, 鄭家偉, 麥華明