含有單克隆抗獨特型抗ca-125抗體和鋁的藥物組合物的製作方法

2023-09-19 09:53:55

專利名稱：：含有單克隆抗獨特型抗ca-125抗體和鋁的藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及腸胃外給藥的用作疫苗的藥物組合物。
背景技術：
：己知，為了增強預防或治療疫苗的免疫原性，佐劑(例如鋁化合物)被廣泛使用在腸胃外給藥的溶液或懸浮劑型藥物製劑的製備中(Fiejka等，RoczPanstwZaklHig1993，73-80)。這些配方的目標是引起最大化以及長效免疫效果。然而，根據歐洲藥典，現在已註冊和市售的疫苗中鋁佐劑的上限為1.25mg/劑。同樣，美國食品藥品管理局(FDA)的法典21CFR610.15中聲明生物產品每個製劑中鋁的推薦量不超過(1)通過化驗測定則為0.85毫克；或者(2)通過添加到鋁化合物的量計算確定則為1.14毫克；(3)通過假設數據顯示所用鋁量安全且對於產生預期效果為必須的化驗測定則為1.25毫克。吸附在鋁佐劑上的抗體的免疫原性顯示出依賴於其吸附度(Capelle等,Vaccine2005,1686-1694)，但是還不清楚可以達到最大免疫原性響應並保持藥物安全性的最佳比例。例如，世界衛生組織(WHO)推薦用於破傷風類毒素和白喉類毒素的鋁佐劑的類毒素吸附水平超過80%(Gupta等，Vaccine1995，1263-1276;WHOTechnicalReportSeriesNo.595,1996,p.6)。與之相對照，數據顯示氫氧化鋁吸附破傷風組合物超過80%沒有增加健康成人的免疫響應(Paoletti等，InfectImmun2001，6696-6701)。使得含有單克隆抗體的疫苗達到最大免疫原性(沒有不可接受的毒副作用的風險)的鋁化合物最適宜含量仍然是一個開放的技術問題。另一個被廣泛關注的技術問題是疫苗穩定性。通過在升高的溫度下的耐貯性分級，白喉和破傷風類毒素以及B肝疫苗顯示出最高熱穩定性，凍幹麻疹、黃熱病和卡介菌(BCG)疫苗處於中間水平，口服急性脊髓灰質炎疫苗處於最月危弱的4立置(Galazka等,Thermostabilityofvaccines,WorldHealthOrganisation,1998)。用於麻疹、黃熱病和肺結核(BCG)的重組疫苗是不穩定的疫苗；在免疫季節它們應該在重組後儘快使用並保存在冰浴中。儘管破傷風和白喉(例如吸附在鋁鹽上)作為單價疫苗或聯合疫苗的組成部分，在35-37'C可以數星期保持穩定，但每次暴露於室溫下都會導致疫苗的一些降解(Galazka等，videsupra,pag48)。因此為保持穩定這些疫苗被規定在低溫下貯存(RoteListe，EditionCantorVerlag,2005)。這類含有單克隆抗體的疫苗的未解技術問題是其室溫下低穩定性。由於複合蛋白有效成分的特性，這些藥品必須在低溫下貯存(2-8。C)而這需要恆定的冷卻鏈。這導致高銷售成本，危及藥物安全性，可能更重要的是限制非常重要的藥物(例如抗癌疫苗)的全球性使用。因此發展疫苗製劑使其可以在室溫或更高溫度下(25'C-37'C)保持品質恆定會提高這些藥物的整體安全性和有效性。這不僅對患者十分有益而且會導致處理這些疫苗的整體便捷性。另一方面，在人類腫瘤治療的免疫治療的重要性，特別是使用單克隆抗獨特型抗體疫苗治療腫瘤，是周知的。這些疫苗應激活宿主免疫系統刺激體液和細胞活動以對抗腫瘤。這種製劑的發展和清晰化對於ACA125/MEN2234(描述在EP700305中)特別重要，其作為一種非常有前景的抗獨特型單克隆抗體，被用作卵巢癌疫苗。下列CA索引名被分配給MEN2234:免疫球蛋白Gl、抗-(鼠骨鈣素125(OC125))(鼠單克隆ACA-125克隆3D5g-鏈)、二硫化鼠單克隆ACA-125克隆3D5k-鏈、二聚物。相應的美國化學文摘(CAS)登記號為792921-10-9。被建議的國際非專利藥物名稱(INN)是阿巴伏單抗(Abagovomab)。MEN2234的胺基酸序列在下面示出。MEN2234是鼠科單克隆抗體用於鼠單克隆抗體OC125，其被認為是腫瘤相關抗原(TAA)CA125。MEN2234有效模擬CA125TAA三維結構從而誘導宿主產生抗-抗獨特型抗體(Ab3)，其標靶表達CA125抗原的腫瘤細胞。MEN2234也可以引起宿主細胞免疫響應特別是直接對抗CA125腫瘤細胞的響應。大約80%晚期卵巢癌患者有CA125表達升高。儘管在卵巢癌中CA125過表達，人體組織自身不能產生有效免疫響應以對抗這些癌細胞。使用含MEN2234的疫苗治療可以喚起宿主的免疫系統並破壞擴散的卵巢癌細胞。EP700305描述單克隆抗獨特型抗-CA125抗體，但沒有描述適於病理治療的特定藥物製劑。在文獻《雜交瘤》(Hybridoma1995，14(2),164-174)中抗體ACA-125被表徵，但沒有開發製劑。在文獻《臨床癌症研究》(ClinicalCancerResearch,2004,10,1580-1587)中，患者接種了ACA125疫苗；沒有指出配方中鋁含量，但是本領域技術人員基於現有技術可以很容易設想出鋁佐劑的相對低含量(低於1.25mg/劑)。在文獻《雜交瘤》(Hybridoma，2005，133-140)中描述一種輸送系統以便於連續內源性釋放ACA125hFc(—種ACA125嵌合形式)以改善其作為卵巢癌疫苗的免疫原性，但其是基於生物封裝技術製備於體外。其它文獻總結了包含MEN2234的卵巢癌臨床前期和臨床研究，但沒有具體的數據涉及配方或沒有提到佐劑濃度(例如沒有提到鋁化合物)ClinicalCancerResearch,2004,1580-1587;ClinicalCancerResearch,2003,3234-3240;ClinicalCancerResearch,2001,1154-1162;ClinicalCancerResearch,2001,1112-1115。具體實施方案本發明要求一種用於腸胃外給藥(優選為皮下或肌肉內)的含有吸附在鋁化合物上並懸浮在水性緩衝系統中的單克隆抗獨特型抗體MEN2234的藥物製劑，其中鋁化合物選自氫氧化鋁(alum)或磷酸鋁。使用高含量(其的含量高於通常認定的和被推薦的)鋁化合物作為佐劑使得疫苗具有意想不到的臨床和藥學優勢，例如L確保對於體液和細胞響應的極高特異性免疫原性II.確保長效誘導並維持免疫響應III.確保給藥安全；IV.簡化製備以及最終藥品釋放程序；V.增加製備過程中的一致性VI.改善藥品在相應溫度範圍內的穩定性。基於本發明的藥物組合物含有抗獨特型抗體MEN2234，其含量為0.1mg/ml-4mg/ml，優選為0.2mg/ml-2.5mg/ml，更優選大約為2mg/ml(1.9-2.1mg/ml)。抗體MEN2234是吸附在鋁化合物上(優選濃度為大約3.5mg/ml的鋁)並懸浮在緩衝的等滲壓生理鹽水中。本組合物除了吸附在鋁化合物上的抗體以及緩衝鹽以外沒有其它成分，使得溶液簡單且沒有其它使用例如穩定劑、抗氧化劑、其它佐劑等試劑所衍生的安全性問題。優選的緩衝液是通過磷酸鹽或檸檬酸鹽得到的。最終優選含有lml產品的組合物被腸胃外給藥，優選通過皮下或肌肉注射。本發明一個主要特徵是相對高濃度的鋁化合物(選自磷酸鋁和氫氧化鋁)被用來確保MEN2234被近乎完全吸附在吸附劑上，氫氧化鋁是最優選的(參見表1)。組合物中優選A1+++濃度為2.4-5.2mg/ml，更優選為大約3.5mg/ml(即3.1-3.8mg/ml)。相應的氫氧化鋁含量為0.7-1.5%W/W，優選大約為1%W/W(0.9-1.1%)表1:MEN2234吸附(未吸附蛋白)與鋁濃度依賴性(氫氧化鋁)tableseeoriginaldocumentpage71%氫氧化鋁對應著八1+++大約3.5mg/ml，因而高於目前已註冊使用和市售的疫苗以及有關當局推薦的含量。該製劑可以基於本領域己知標準程序製備。一個常用的程序可以如下。最終產品的製備可以通過在限定的條件下混合抗體溶液和佐劑(鋁化合物凝膠)而得。藥品滿足基於歐洲藥典專論"腸胃外藥物製備"的無菌要求。因而，基於常規要求，製造工藝嚴格在無菌條件下進行。在製造過程中所有成分均為無菌級或0.22微米過濾器過濾的溶液。基於本發明的製劑的優點/.殤疾^^沐i,潘應喊應遊欲/^錄弄絲免資嚴絲我們已經證明每月一次的(每四星期皮下給藥)本發明組合物治療可以誘導特異性體液響應(直接對抗MEN2234的特異性抗體)依賴於鋁化合物的濃度。事實上這顯示為由含1%氫氧化鋁(例l)的製劑引發的體液響應的量明顯高於含有0.36%氫氧化鋁(基於歐洲藥典和FDA指導方針的限制)的懸浮液所引發的響應或者緩衝生理鹽水中MEN2234溶液引發的響應表2:經過每四周皮下給藥的兔血漿中抗MEN2234抗體血漿滴度製劑抗體滴度(ng/ml)MEN2234溶液907±_259MEN2234懸浮液，Al(OH)30.36%3658±1473MEN2234懸浮液，Al(OH)31.0%15627±5007*與其它兩個條件相比*PO.O(邦費羅尼(Bonferroni)多元比較法)另外在注射位置進行組織學評估以測量建立特異性細胞免疫響應必須的炎性細胞和抗原提呈細胞的增補。對於這個參數，含1%氫氧化鋁(例1)的製劑的響應明顯高於低含量Al(OH)3(0.36%)的響應或無Al(OH)3的MEN2234溶液的響應表3:在每周用疫苗處理的兔的注射位置的炎性細胞的半定量測定tableseeoriginaldocumentpage9//.殤保/《欺誘導#/#/#免^^^應在兔中我們己經證實經過使用例1組合物的疫苗(每四星期注射)，免疫響應可維持很長一段時間，甚至幾星期後還能在血漿中檢測到特異性抗體。另一方面，只是在短段時間內可測得使用含低量A1(OH)3(0.36%)的MEN2234懸浮液或無佐劑MEN2234溶液疫苗後得到的抗體。///線疾繪秀安全本發明的MEN2234懸浮液在26星期內以2mg/ml給藥(皮下注射)於兔。給藥方式是第一個月每周給藥，剩餘期限內雙周給藥。局部耐受性和系統安全性被檢測。15個治療以後沒有發現毒性反應，依據是體重、臨床症狀、食物消耗、血液學、臨床化學、所有器官組織病理學。在注射位置只觀測到藥物作用導致的炎症反應和免疫反應。此外本發明可以減少游離鼠抗體的量，減少其中體循環中的吸附和峰值進而減少過敏反應的風險。/F微縱以J影多鄉微辦大約1%氫氧化鋁確保完全綁定MEN2234(<1%的未吸附抗體)。這是非常穩健的吸附和製造過程無需如同其它含鋁疫苗(例如破傷風，白喉)那樣進行體內釋放測試(實驗動物的免疫響應)。完全吸附確保宿主免疫系統中最佳抗體(Ab2)表現。詳細調査MEN2234-氫氧化鋁吸附機理顯示出在磷酸鹽緩衝液中在所有基質上近乎理想的化學計量分布。如前述，由於其自行組裝特性，確保本發明的簡單和穩健的製備過程。15秒適度混合後抗體近乎完全吸附到氫氧化鋁(表4)。表4:MEN2234吸附與混合時間的依賴性(氫氧化鋁濃度1%)混合時間分:秒未吸附的蛋白％j01000:100.200:300.201:000.155:000.2015:000.03240:000.10參見表l，佐劑濃度小於0.75%不會實現完全吸附，濃度高於1%(例如2%)也沒有任何改善。以高於推薦的吸附劑濃度非常快速完全地將MEN2234吸附到鋁化合物上使得明顯簡化藥物組合物的製備。通過混合單克隆抗體和佐劑，只需幾秒鐘就可以得到最終製劑。混合步驟可依常規使用製藥廠無菌工藝所用標準設備進行。所述系統的自行組裝特性在製備和穩定本發明製劑以及通常的吸附的單克隆抗體或疫苗方面引出一個全新觀點。在幾秒鐘內MEN2234完全吸附到鋁佐劑上也使得可以在皮下或肌肉注射前在向患者使用的地方(例如醫院)只需混合所需劑量的藥物和鋁佐劑即可製備最終懸浮液。因此本發明的一個特別方面表現在其形式上，疫苗的活性物質(抗體MEN2234)和佐劑(鋁化合物，優選氫氧化鋁)是分開保存並且準備好臨注射給患者前混合。優選的進行混合的時間是在向患者給藥前10秒到10分鐘之間。對於這個特別形式，組合物應該是抗體和佐劑溶液彼此分隔但填注在藥學標準容器系統內，例如小瓶、安瓿、預填充注射器或適宜的兩艙系統以用於混合和/或重組。單克隆抗體不僅可以是已緩衝的溶液形式，也可以說粉末形式。使用固體藥物的可能性使得可將所有改善單克隆抗體或疫苗的技術都可以使用(凍幹、噴霧乾燥等)。這表現出對於所有吸附型疫苗(特別是那10些含有單克隆抗體(例如MEN2234))在操作上的明顯進步以及在穩定性上的改善。吸附型疫苗的主要缺點例如在出貨和貯存時的恆久冷鏈被避免了，並且藥物的貨架壽命延長了。如所述，含有藥學組合物的單克隆抗體的體內免疫原性活性依賴於抗體在所用吸附劑上的吸附度(Capelle等.,Vaccine2005，1686-1694)。因此現有技術要在藥品釋放前確定生物(吸附型)疫苗在動物體內免疫原性活性。MEN2234可再生吸附到鋁佐劑上明顯簡化了釋放程序。由於吸附的可靠性，釋放測試可以只依靠體外測試來確定組合物的效價。常規的動物體內生物活性確定程序對於本發明是多餘的。f:改夢翁蕃過澄^遊一發絲使用高於推薦濃度的例如氫氧化鋁吸附MEN2234的可再現性明顯改善藥物製備中的一致性。如表5所示，如果製劑中氫氧化鋁濃度為0.7-2%w/v，MEN2234的吸附對於所有製備批次都是完全的(<1%游離抗體)。表5:製備過程中MEN2234吸附(未吸附的抗體)在氫氧化鋁上的可變性氫氧化鋁濃度[%]未吸附的抗體[批次I%批次II0函1000.2578360.3659110.53060.75<1.0<1.01.0<0.1<0.12.0<0.1<0.1完全且可再生的吸附可避免加工過程中出現可怕的複雜情況，例如形成抗體團。溶液中抗體對於形成聚團是敏感的。溶液中抗體聚團可由液相中過多的剪切力引發，例如在攪拌過程中。這些聚集團不能再溶解並使得疫苗的11生物活性明顯降低。然而對於本發明的組合物，由於完全且快速吸附過程，這個現象可以完全避免。W.改夢秀^在裙應蘊度範房/^遊德定絲令人驚訝的，與緩衝的MEN2234溶液相比例1組合物更加穩定(甚至在25°C-37°C)。這個簡單但非常有效的方法(氫氧化鋁濃度增加到推薦劑量的2-3倍)確保近乎完全的綁定同時也穩定。表6中穩定性數據是關於MEN2234溶液和基於例1的製劑。表6:MEN2234溶液以及吸附在氫氧化鋁上的穩定性tableseeoriginaldocumentpage12因此，本發明確保給藥到人體後在機體溫度(36-37。C)所需的抗體穩定性和活性。例子本發明非限制性實例如下例1:注射用懸浮液成分mg/mlMEN22342.00Al(OH)3*10.00KC10.20KH2P040.20NaCl8.00Na2HP04x7H202.16注射用水添加到1.00ml*常用於吸附的水合氫氧化鋁如前述，組合物的製備基於標準程序，簡單混合MEN2234和水合氫氧化鋁懸浮液，溶液由相應鹽緩衝。例2:注射用懸浮液mg/ml2.007.500.200.20謹2.16添加到1.00ml成分MEN2234Al(OH)3*KC1KH2P04NaClNa2HP04x7H20注射用水*常用於吸附的水合氫氧化鋁製備如例1例3:注射用懸浮液成分MEN2234A1P04KH2P04NaClNa2HP04x7H20注射用水製備如例1例4:測定MEN2234(阿巴伏單抗)胺基酸序列序列號1mg/ml2.0010.000.209.001.20添加到1.00ml歪鏈序列QVQXQQSGAETQKFKGKATXKTTPPSVYPXYTXSSSVTVPPKPKDVXTXTXARPGASVKXTADKSSSTAYAPGSAAQTNSSSTWPSETVTXTPKVTCVVVSCKASGYTFTMQXSSXASEDMVTXGCXVKGCNVMPASSTDXSKDDPEVGNYWMQWVKQRSAVYYCARGEYFPEPVTVTWKVDKKXVPRDFSWFVDDVEVPGQGXDWXGAGNYAWFAYWGNSGSXSSGVHCGCKPCXCTVHTAQTQPREEXYPGDGNTRY60QGTXVTVSAA120TFPAVXQSDX180PEVSSVFXFP240GFNSTFRSVS300EXPXMHQDWXNGKEFKCRVNSAAFPAPXEKTXSKTKGRPKAPQVYTXPPPKEQMAKDKVS360XTCMXTDFFPEDXTVEWQWNGQPAENYKNTQPXMDTDGSYFVYSKXNVQKS麗EAGNTFT400CSVXHEGX麗HHTEKSXSHSPGK序列號2輕鏈序列DIQMTQSPASLSASVGETVTXTCRASENXYSYXAWHQQKQGKSPQXXVYNAKTXAGGVSS60RFSGSGSGTHFSXKXKSXQPEDFGXYYCQHHYGXFPTFGGGTKXEXKRADAAPTVSXFPP120SSEQXTSGGASVVCFX麗FYPKDXNVKWKXDGSERQNGVXNSWTDQDSKDSTYSMSSTXT180XTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPXVKSFNRNEC阿巴伏單抗所測定的胺基酸序列第一部分是使用基於埃德瑪(Edman)降解法定自動測序技術，在蛋白質序列儀中阿巴伏單抗被共價連接到測序膜上(輕鏈頭15個胺基酸)。由於自動埃德瑪測序不能生成任何重鏈序列數據，建議將重鏈的N-末端基團改性為焦穀氨酸，得到延展的序列，已知液相色譜串聯質譜法(LC/MS/MS)測序技術被用於質譜分析(例如Proc.NatlAcadSciUSA,1986SepS印，83(17)，6233-6237)。簡要的，在進行LC/MS/MS分析前不同抗體樣本由不同的水解蛋白酶切成片段，產生一系列重疊的序列片段。找到這些片段的重疊情況可以確定抗體的總輕鏈序列(重鏈和輕鏈的完整胺基酸序列顯示在SEQ.IDNO.1和SEQ.IDNO.2)。最後檢測試驗結果的可靠性，所報告的序列也由使用BLAST軟體包對蛋白質分析優化的非冗餘蛋白質數據進行序列相似性分析而證實(MSDB,2007年3月從歐洲生物信息研究所FTP網站下載)。由於質譜分析中不能區分異亮氨酸和亮氨，圖1中這點表現為"X"。1權利要求1.用於腸胃外給藥疫苗的藥物組合物包括一個單克隆和濃度為2.4-5.2mg/ml鋁離子的鋁衍生物佐劑，其中單克隆抗體是包括序列號1、2的單克隆抗獨特型抗CA-125MEN2234。2.如權利要求1所述的藥物組合物，其中鋁衍生物的濃度為3.1-3.8mg/ml鋁離子。3.如權利要求l-2所述的藥物組合物，其中鋁化合物選自氫氧化鋁和磷酸鋁。4.如權利要求3所述的藥物組合物，其中鋁化合物是氫氧化鋁。5.如權利要求l-4所述的藥物組合物，其中MEN2234的含量為0.1-4mg/ml。6.如權利要求5所述的藥物組合物，其中MEN2234的含量為0.2-2.5mg/ml。7.如權利要求6所述的藥物組合物，其中MEN2234的含量為1.9-2.1mg/ml。8.如權利要求1-7所述的藥物組合物，其中MEN2234是被吸附到鋁化合物上並懸浮在緩衝的等滲壓生理鹽水中。9.如權利要求1-8所述的藥物組合物，其為適於腸胃外給藥的懸浮液形式。10.如權利要求9所述的藥物組合物，其適於皮下或肌肉給藥。11.如權利要求1-10所述的藥物組合物，其中MEN2234和鋁化合物懸浮液是分開保存且準備好在臨向患者給藥前混合。12.製備如權利要求11所述組合物的方法，其中MEN2234和鋁化合物的混合是在向患者給藥前10秒-10分鐘前進行的。13.如權利要求12所述方法製得的藥物組合物。14.如權利要求l-10所述的藥物組合物，選自a)MEN22342.00mg/ml、Al(OH)310.00mg/ml、KC10.20mg/ml、KH2P040.20mg/ml、NaCl8.00mg/ml、NasHPO,7H202.16mg/ml、注射用水添加到1.00mlb)MEN22342.00mg/ml、Al(OH)37.50mg/ml、KC10.20mg/ml、KH2P040.20mg/ml、NaCl8.00mg/ml,Na2HP047H202.16mg/ml、注射用水添加到1.00mlc)MEN22342.00mg/ml、A1P0410.00mg/ml、KH2P040.20mg/ml、NaCl9.00mg/ml、Na2HP04x7H201.20mg/ml、注射用水添加到1.00ml。15.如權利要求1-14所述藥物組合物被用作抗癌疫苗以治療或預防腫瘤。16.如權利要求15所述藥物組合物作為抗癌疫苗用於治療卵巢癌。17.選自氫氧化鋁和磷酸鋁的鋁化合物在製備如權利要求1所述藥物組合物中的用途，其中鋁化合物的濃度為2.4-5.2mg/ml鋁離子。全文摘要本發明涉及腸胃外給藥的用作疫苗的藥物組合物，其包括單克隆抗體以及鋁衍生物佐劑。文檔編號A61K39/39GK101478987SQ200780024020公開日2009年7月8日申請日期2007年6月28日優先權日2006年6月29日發明者卡斯登·喬基,斯特法諾·馬茲尼,簡斯·弗萊明,萊茵哈特·史密茨申請人:馬納裡尼國際運轉盧森堡股份公司