一種新型疫苗佐劑及應用的製作方法
2023-09-19 10:02:05
專利名稱：一種新型疫苗佐劑及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗佐劑及其製備方法，特別涉及一種新型的水包油疫苗佐劑及其製備方法，又稱一種SPOl佐劑，用於不同類型抗原的疫苗製備，用於不同年齡人群、動物免疫接種所需疫苗佐劑。
背景技術：
隨著現代生物技術的迅速發展，裂解疫苗、重組亞單位疫苗、抗獨特型抗體疫苗、 核酸疫苗及合成肽疫苗等得到開發。這些疫苗抗原純度高，相對分子量小，疫苗的不良反應低，然而這些抗原的免疫原性和免疫保護性普遍較弱，為了提高抗原的有效性，必須在抗原中添加佐劑以增強它們誘導免疫反應的能力。佐劑與抗原同時或預先應用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫反應類型。其功能主要有使用部位招攬免疫細胞和免疫分子，增強免疫應答；增強疫苗抗原傳遞；增進免疫接觸；增強弱抗原的免疫原性和免疫記憶，如高度純化的抗原或重組抗原；減少抗原接種劑量和接種次數；促進疫苗在免疫應答能力弱的群體中的免疫效果；加快免疫應答的速度和延長持續時間；改變抗原的構型；改變體液抗體的種類、IgG亞類和抗體的親和性，以及細胞免疫和黏膜免疫效應。理想的佐劑不僅沒有免疫原性並能增強機體的免疫應答，更能使機體獲得最佳的保護性免疫和免疫記憶。鋁佐劑是目前普遍被批准用於人類疫苗的主要佐劑，自1擬6年Glermy首先應用鋁鹽吸附白喉類毒素至今已廣泛應用於疫苗，有磷酸鋁和氫氧化鋁兩種鋁鹽佐劑。但是鋁佐劑以體液免疫應答為主，不能誘導細胞免疫和黏膜免疫應答效應，特別是近幾年發現多次使用出現免疫抑制和累積中毒而使用受限，並且對一些疫苗抗原無效，有些出現注射部位偶有嚴重的局部反應出現紅斑皮下結節接觸性過敏和肉芽腫性炎症，因此尋找新的疫苗佐劑成為疫苗學的重大現實問題。此後，1997年歐洲國家批准水包油MF59、virosomes佐劑上市，其產生的抗體效價比鋁佐劑安全性高、效果好，而且兼顧產生一定細胞免疫效應， 是鋁鹽被批准使用70年後第一個被允許用於人體的疫苗佐劑。隨後2005年在Montanide W/0水包油佐劑中加入維生素E製備的AS03 ；2007年在MPL中加入鋁鹽製備的AS04佐齊IJ， 均在歐洲上市。這類佐劑通過注射接種增強疫苗抗原的免疫原性，誘導特異的抗體反應，激發Thl型細胞因子(IFN-y、IL-2等)產生較強的CTL反應。除此以外，許多其他新型佐劑也層出不窮，比如MPL、PolyI C、免疫刺激複合物、CPG-OPN疫苗佐劑等，均有各自的優勢和不足。因此發展尋求新的安全的佐劑已成為迫求需求。特別是既用於注射又能用於黏膜、 透皮免疫佐劑越來越為人們所重視，至今還沒有，並成為今後佐劑發展的重要領域。非注射免疫疫苗在抵禦氣溶膠感染多種重大傳染病病預防方面發揮了重要作用， 具有巨大的發展潛力和應用前景，這已是不爭的事實。然而，在發展黏膜、透皮非注射免疫疫苗過程中最大的障礙是尋找安全、高效的疫苗佐劑系統。佐劑是疫苗產品的主要成分，在新型疫苗設計中具有重要作用，它通過與抗原同時或預先應用，能夠增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫反應類型。佐劑作用的確切機制未明，據報導與下列因素有關，延長抗原滯留時間；減少抗原接種劑量和接種次數；促進疫苗在免疫應答能力弱的群體中的免疫效果；加快免疫應答的速度和延長持續時間；增強免疫細胞激活所需要的協同刺激信號；誘生肉芽腫(富含巨噬細胞)的形成促進T細胞激活；刺激淋巴細胞非日特異性增殖等。因此，針對新發、突發重大傳染病黏膜疫苗及疫苗通用技術平臺急需開發新型的通用型黏膜免疫佐劑，以增強黏膜疫苗的免疫應答和免疫保護效果，同時減少疫苗的接種劑量和接種次數。非注射免疫疫苗在抵禦氣溶膠感染多種重大傳染病病預防方面發揮了重要作用。 鼻免疫系統廣泛而複雜，它是呼吸道的開始，處於中耳、眼、口腔抵抗抗原物質的樞紐位置， 有保護下呼吸道的作用；它可對遠處黏膜如泌尿生殖道、胃腸道免疫反應也能起到免疫應答保護。黏膜免疫系統區別於全身系統免疫的特徵是天然防護的形成機制，一定數量獨特淋巴細胞集群的存在，起源於黏膜組織的細胞對黏膜和外分泌腺的聚集以及對非危險抗原反應抑制的優先誘導。同樣皮膚是疫苗免疫的一個理想部位，表皮中富含郎格罕斯細胞及皮下、肌肉中富含樹突狀抗原提呈細胞，形成獨特強有力的免疫識別、應答和效應網絡。 通過皮膚機體能有效接觸外來抗原產生系統免疫應答和黏膜免疫應答的雙重效應，從而達到全面免疫保護效果，並且抗原與提呈細胞直接接觸大大降低抗原用量，以及微針矩陣 (microneedle arrays)、透皮(pacth)貼劑非注射免疫使得抗原大面積散布在黏膜、皮膚免疫組織中有更多機會被抗原細胞利用，誘發產生系統免疫與黏膜免疫及細胞免疫應答，從而提高免疫保護效果的優勢，這是有針注射免疫不能並寐的。因此需要提高疫苗的安全性、耐受性、免疫原性和免疫保護性就要在靶向局部和系統同時提高全面免疫應答和效應反應。目前，越來越多的純化的具有良好特性的疫苗與佐劑結合，並試圖提高成人、兒童及老年人特殊人群，以及動物的免疫原性。所以，篩選製備具有體液免疫與細胞免疫、黏膜免疫與系統免疫以及天然免疫與獲得性免疫應答的疫苗佐劑是很有必要
發明內容
用。
本發明的目的在於提供一種新型疫苗佐劑，另一個目的在於提供其製備方法及應
本發明目的是通過如下技術方案實現 本發明疫苗佐劑的原料組成為 角鯊烯
聚氧乙烯蓖麻油聚醚緩衝液
本發明疫苗佐劑的原料組成優選為 角鯊烯2. 5%-10%
聚氧乙烯蓖麻油0.1^-5%
聚醚0.1%-5%
緩衝液加至100%
本發明疫苗佐劑的原料組成優選為
2. 0% -12. 5% 0. 05% -10% 0. 05% -10% 加至100%
角鯊烯聚氧乙烯蓖麻油
5. 0%
0. 25% -0. 5% 0. 25% -0. 5% 加至100%聚醚緩衝液其中所述的原料百分比是w/v的關係；其中所述的緩衝液是去離子水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鈉緩衝液中的一種。其中所述的角鯊烯(Squalene)屬開鏈三萜，又稱魚肝油萜，其中文的化學名稱是角鯊烯或(全E)-2，6，10，15，19，23-六甲基_2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯，其英文名稱是 Squalene 或 6,10,14,18, 22-Tetracosahexaene, 2,6,10,15,19, 23-hexamethyl-, (all-Ε)-2 或(e, e, e, e)-squalene 或 14, 18, 22-tetracosahexaene,2,6,10,15,19, 23-hexamethyl-(all-e)-10 或 spinacen。其 CAS :111-02-4,分子式=C30H50,分子質量 410. 72，沸點285°C，熔點-75_286°C，來源於動物、植物提取或化學合成。其中所述的聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylenated castor oil)是非離子型表面活性劑，主要起乳化作用。HLB值13，濁點85°C，商品名稱是乳化劑EL。其中所述的聚醚(poly ethylene glycol block-poly propylene glycol block-polyethylene glycol)又稱聚乙二醇醚，關於聚醚的配方是以環氧乙烷、環氧丙烷、環氧丁烷和四氫呋喃等為原料，在催化劑作用下開環均聚或共聚製得的線型聚合物。本發明疫苗佐劑簡稱為SPOl佐劑。取上述原料，按照常規工藝製成疫苗佐劑。本發明疫苗佐劑的製備方法為取原料使用勻漿機製備初乳，勻漿條件為轉速5000rpm-15000rpm，時間 I-IOmin ；或者使用超聲波來製備初乳，超聲5-10次，45s/次，初乳的粒徑為x1(1 = 1612. 39 士 10nm，x5(l = 1969. 24 士 10nm，x9(l = 2401. 49 士 10nm，SMD = 1946. 88 士 10nm，VMD = 1992. 92士 IOnm(見圖1)；均質初乳均質條件為壓力5000-8000psi，5_8個循環，測量其粒徑為 Xltl = 197. 10 士 10nm，X50 = 240. 37 士 10nm，X90 = 292. 69 士 10nm，SMD = 237. 53 士 IOnm, VMD = 243. 16士 10nm，(見圖2)，再次均質，均質條件壓力8000_15000psi，5-8個循環， 測量其粒徑為 Xltl = 125. 12 士 10nm，X50 = 155. M±10nm，X90 = 193. 14 士 10nm，SMD = 153. 30士 lOnm，VMD = 157. 78士 IOnm(見圖3)，製備成乳白色的疫苗佐劑製劑後，緩衝液選擇去離子水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鈉緩衝液中的一種，採用0. 22μπι濾器過濾除菌，即得。佐劑電鏡圖片(見圖4、圖5)。其中所述的勻漿條件優選為轉速6000rpm，時間2-5min，或者用超聲波來製備初乳時優選超聲6-8次。其中製備初乳、均質初乳以及再次均質時粒徑的測量方法為常規測量方法。本發明疫苗佐劑可以是溶液所形成膠體或微球，顆粒大小均勻，粒徑在 90nm-200nm之間，平均粒徑150nm左右；本發明水包油疫苗佐劑，可與各種抗原如滅活全病原體、裂解病原提取組分、細菌囊泡、莢膜多糖或多糖結合蛋白、重組蛋白、重組VLP、DNA或 RNA核酸等混勻，製備不同類型的疫苗，其中所述疫苗按照常規工藝，加入常規輔料，製成藥學上可接受的注射劑、微針矩陣劑、噴鼻劑、透皮貼劑等各種劑型，其中所述疫苗適用於不同年齡人群、不同動物的免疫接種。本發明是一種安全有效且穩定的SPOl疫苗佐劑，能夠招攬抗原注射部位或黏膜部位免疫細胞和免疫分子聚集，增強特異性細胞免疫和體液免疫應答效應，可調節抗體對抗原的親和性與專一性；同時可以通過注射或黏膜等途徑免疫，且黏膜途徑免疫與注射疫苗免疫相比，黏膜接種疫苗具有成本低，給藥方便，避免交叉感染，安全性高的特點；本發明的SPOl疫苗佐劑可適用於兒童、老年人、孕婦等特殊群體，以及各種動物的免疫接種；並且沒有複雜結構，工藝簡單，適宜大批量生產產業化。
圖 1 製備初乳的粒徑:x10 = 1612. 39nm, X50 = 1969. 24nm, X90 = 2401. 49nm, SMD =1946. 88nm, VMD = 1992. 92nmm ；圖 2 均質初乳的粒徑:χ10 = 197. IOnm, X50 = 240. 37nm, X90 = 292. 69nm, SMD = 237. 53nm, VMD = 243. 16nm ；圖3 :再次均質初乳的粒徑:x10 = 125. 12nm,x50 = 155. 54nm，x90 = 193. 14nm, SMD =153. 30nm, VMD = 157. 78nm ；圖4、圖5:佐劑電鏡圖片下述實驗例和實施例用於進一步證明但不限於本發明。實驗例1 SPOl佐劑的安全性實驗1、無菌、支原體試驗將實施例1製備的SPOl佐劑接種硫乙醇酸鹽培養基、營養瓊脂斜面培養基和改良馬丁培養基培養14d，並以無菌生理鹽水做陰性對照，培養溫度為25°C、35°C。結果顯示， SPOl疫苗佐劑未見細菌生長。將SPOl佐劑分別用半流體和肉湯培養基，37°C初代培養21 天，次代培養21天，無菌生理鹽水做陰性對照，結果顯示SPOl佐劑無支原體生長；用DNA染色法將毒種接種Vero細胞後培養3天，傳代一次，用二苯甲醯胺螢光染料染色，結果顯示疫苗佐劑無支原體生長。2、溶血性試驗選取體重為350g左右的豚鼠，採集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌3次，再將血細胞體積恢復並稀釋10倍。PBS稀釋SPOl佐劑(SP01佐劑由實施例1製備)，分別為2倍、4 倍、8倍，將豚鼠血細胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時後，評價血球溶解以目測或者上清濃度檢測為準，並在570nm處檢測吸光度。結果顯示，沒有發生血球破裂，無溶血現象。說明SPOl佐劑中的成分不能使紅細胞裂解。因此，SPOl疫苗佐劑無溶血反應。3、急性毒性試驗取實施例1製備的SPOl佐劑0. 5ml腹腔注射體重為12 18g Balb/C小鼠，每組 10隻，同時設PBS陰性對照組，連續2周觀察小鼠的活動狀態、體重變化和存活率。結果表明，實驗小鼠全部存活，沒有出現豎毛、精神萎靡、行動遲緩等不良症狀，而體重呈現增加， 由此證明新型佐劑在試驗的濃度下對動物是安全的，且14天後處死進行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。在體重為8 IOkg的Beagle狗體內的急性毒性結果取實施例1製備的SPOl佐劑肌肉或腹腔注射15ML，每組10隻，同時設PBS陰性對照組，連續2周觀察行為、體重和存活率變化。結果可見，Beagle狗未見毒性反應，行為正常，沒有死亡，與對照組狗比較無差異，各狗體重有所增加，並處死大體解剖未見臟器有明顯的病理改變。根據此結果換算成人用劑量，例一個50公斤的成年人，可使用SPOl的最大安全劑量是50ml-100ml。因此，SPOl疫苗佐劑在動物、人體體內無急性毒性反應，使用是安全的。4、最大致死量試驗分別取實施例1製備的SPOl佐劑200ul、500ul、1000ul、1500ul腹腔注射體重為12 18g Balb/C小鼠，每劑量組5隻，連續2周觀察小鼠的死亡情況。由試驗可得出 200ul、500ul組小鼠沒有出現任何異常狀態，飲食睡眠行動均很正常，體重增加；IOOOul組小鼠在注射後兩天內體重平均下降l_2g左右，5天後體重開始上升，沒有其它異常現象。 取小鼠肺、脾、腎、肝等內臟製備病理切片，發現IOOOuI組小鼠肺部和肝部有散在出血點。 1500ul組小鼠在腹腔注射M小時內陸續死亡。結果1500ul佐劑是小鼠的最大致死劑量。5、過敏試驗研究取實施例1製備的SPOl佐劑皮下接種體重為250 350g Hartley豚鼠，每個樣品接種豚鼠5隻，每隻接種0. 5ml，隔日一次，共3次。第3次注射後21天，耳靜脈給予相同 SPOl佐劑0. 5ml，並用人血白蛋白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3隻豚鼠作為陽性、陰性對照。注射後30分鐘及3天觀察動物，陽性、陰性對照均成立，SPOl佐劑組豚鼠無死亡， 且無鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏症狀。因此，SPOl疫苗佐劑在動物體內無過敏反應。6、兔熱源質試驗取預檢合格的體重為2 3kg家兔3隻固定，30分鐘後測量體溫，共測2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大於0. 2°C，各家兔2次平均溫度在38. 6-39. 5°C。將實施例1 製備的SPOl疫苗佐劑預熱至38°C，於第2次測溫後15分鐘內，自家兔耳邊靜脈緩緩注入 0.5ml/只。注射後每隔30分鐘測量體溫1次，連測6次。結果顯示SPOl佐劑給予家兔個體升溫未超過0. 2°C，3隻家兔升溫總和未超過0. 4°C，沒有引起家兔的發熱反應。因此，製備的SPOl佐劑無熱源質。7、血管刺激性研究取實施例1製備的SPOl佐劑通過肌肉注射或噴鼻給體重為18g Balb/C小鼠、2 3. 5kg恆河猴、50Kg人體，每次500ul，每日2次，連續5日，結果鼻腔或肌肉注射Balb/C小鼠、恆河猴、人體表現正常，沒有不適等反應，與給生理鹽水組無明顯變化；Balb/C小鼠、恆河猴鼻腔、氣管和肺臟，以及注射部位病理切片顯微鏡檢未見有炎性浸潤、血管周圍組織出血及壞死等刺激現象。因此，製備的SPOl佐劑無明顯血管刺激性、黏膜刺激性。8、長期毒性研究分別將低(0. 5ml)、中(Iml)、高(2ml)劑量的SPOl佐劑肌肉注射體重為250 300g的成年大鼠和8 IOkg的Beagle犬，每天注射一次，連續給藥1個月，觀察其體重和體表變化、精神狀態、食慾、睡眠情況及血液中細胞變化情況，連續觀察三個月。結果顯示是反覆給藥後高劑量組的大鼠體重在停藥給藥21天兩周內出現下降，精神不振，食慾不佳， 體重下降，並停止注射SPOl佐劑後很快恢復正常；其餘低中劑量兩組連續注射30天體重沒有出現明顯的波動，精神狀態良好，食慾和睡眠情況沒有明顯變化。由此，SPOl佐劑中、低
7劑量給與Beagle犬沒有長期毒性。9、代謝降解性研究採用放射性131I-標記結合分子排阻高效液相(SHPLC)和TCA酸沉澱放射性測定研究I-標記物在體重為3. 5 5kg獼猴血清中濃度、代謝降解變化及時間過程；及總放射性在尿、糞排洩物中的排洩量和時間過程，研究SPOl佐劑在體外與血漿蛋白結合的情況。其中SPOl佐劑由實施例1方法製備；(1)選取健康獼猴3隻，皮下注射125I-SPOl佐劑0. 2ml,收集給藥前以及給藥後 0. 5、l、2、4、8、12、M、48、72、96、120h靜脈血，血清加入等量20% TCA沉澱蛋白，測定總γ 放射性，結果見表1。(2)選取健康獼猴3隻，皮下注射125I-SPOl佐劑0. &ι1，餵其標準飼料，自由飲水， 注射後12、48、72、120、168和19 分別收集尿和糞，測定γ放射性，計算排出放射性佔注入放射性量的百分數，結果見表2。表1給藥後不同時間檢測靜脈血中總Y放射性
[006權利要求
1.一種新型疫苗佐劑，其特徵在於該疫苗佐劑的原料組成為角鯊烯 2%-12. 5% 聚氧乙烯蓖麻油0.05%-10%聚醚 0.05%-10% 緩衝液加至100%。
2.如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於該疫苗佐劑的原料組成為角鯊烯 2. 5%-10%聚氧乙烯蓖麻油0.1%-5%聚醚 0.1^-5% 緩衝液加至100%。
3.如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於該疫苗佐劑的原料組成為角鯊烯5%聚氧乙烯蓖麻油0. 25%-0. 5%聚醚 0.25%-0.5%緩衝液加至100%。
4.如權利要求1-3任一所述的疫苗佐劑，其特徵在於其中所述的緩衝液是去離子水、 生理鹽水、磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鈉緩衝液中的一種。
5.如權利要求1-3任一所述的疫苗佐劑的製備方法，其特徵在於該方法包括如下步驟取原料使用勻漿機製備初乳，勻漿條件為轉速5000rpm-15000rpm，時間I-IOmin ；或者使用超聲波來製備初乳，超聲5-10次，45s/次，初乳的粒徑為X10 = 1612. 39士 lOnm，X50 =1969. 24 士 10nm，X90 = 2401. 49 士 10nm，SMD = 1946. 88 士 10nm，VMD = 1992. 92 士 IOnm ； 均質初乳均質條件為壓力5000-8000psi，5-8個循環，測量其粒徑為x1(1 = 197. 10士 10nm， X50 = 240. 37 士 10nm，X90 = 292. 69 士 10nm，SMD = 237. 53 士 10nm，VMD = 243. 16 士 10nm，再次均質，均質條件壓力8000-15000psi，5-8個循環，測量其粒徑為x1(1 = 125. 12士 10nm，X50 =155. 54 士 10nm，x9。= 193. 14 士 10nm，SMD = 153. 30 士 10nm，VMD = 157. 78 士 10nm，製備成乳白色的疫苗佐劑製劑後，緩衝液選擇去離子水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鈉緩衝液中的一種，採用0. 22 μ m濾器過濾除菌，即得。
6.如權利要求5所述的疫苗佐劑的製備方法，其特徵在於其中所述的勻漿條件為轉速6000rpm，時間2-5min，或者用超聲波來製備初乳時超聲6_8次。
7.如權利要求1-3任一所述的疫苗佐劑在製備疫苗中的應用。
8.如權利要求4所述的疫苗佐劑在製備疫苗中的應用。
9.如權利要求1-3任一所述的疫苗佐劑在與各種抗原製備不同類型的疫苗中的應用。
10.如權利要求4所述的疫苗佐劑在與各種抗原製備不同類型疫苗中的應用。
11.如權利要求9所述的應用，其特徵在於所述各種抗原為滅活全病原體、裂解病原提取組分、細菌囊泡、莢膜多糖或多糖結合蛋白、重組蛋白、重組VLP、DNA或RNA核酸。
12.如權利要求10所述的應用，其特徵在於所述各種抗原為滅活全病原體、裂解病原提取組分、細菌囊泡、莢膜多糖或多糖結合蛋白、重組蛋白、重組VLP、DNA或RNA核酸。
13.如權利要求9所述的應用，其特徵在於其中所述的疫苗，按照常規工藝，加入常規輔料，製成藥學上可接受的注射劑、微針矩陣劑、噴鼻劑、透皮貼劑各種劑型。
14.如權利要求10所述的應用，其特徵在於其中所述的疫苗，按照常規工藝，加入常規輔料，製成藥學上可接受的注射劑、微針矩陣劑、噴鼻劑、透皮貼劑各種劑型。
15.如權利要求9所述的應用，其特徵在於其中所述的佐劑疫苗適用於不同年齡人群、 不同動物的免疫接種。
16.如權利要求10所述的應用，其特徵在於其中所述的佐劑疫苗適用於不同年齡人群、不同動物的免疫接種。
全文摘要
本發明公開了一種新型疫苗佐劑(又稱SPO1疫苗佐劑)及其製備方法，本發明疫苗佐劑主要由角鯊烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚組成，可以通過注射或噴鼻、透皮非注射等途徑免疫，且非注射接種疫苗具有成本低，給藥方便，避免交叉感染，安全性高的特點；本發明SPO1疫苗佐劑可與滅活全病原體、裂解病原提取組分、細菌囊泡、莢膜多糖或多糖結合蛋白、重組蛋白、重組VLP、DNA或RNA核酸等不同類型抗原製備疫苗，可適用於不同年齡段人群、不同動物疫苗製備及免疫接種；並且沒有複雜結構，工藝簡單，便於製備和除菌，成本低，適宜大批量生產產業化。
文檔編號A61K9/107GK102370977SQ20101024797
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者劉春環, 劉永祥, 唐衝, 楊鵬輝, 王希良, 王鋮, 羅德炎, 趙忠鵬, 邢麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 赤峰博恩藥業有限公司