一種測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法

2023-09-19 09:43:25 2

專利名稱：一種測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法
技術領域：
本發明涉及一種咪達唑侖及其代謝產物的檢測方法，尤其涉及測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，屬於醫學檢驗領域。
背景技術：
細胞色素P450 (CYP450)是藥物在體內代謝重要的酶系，在藥物代謝和生物轉化過程中起重要作用，主要存在於肝、腸等器官的細胞內質網內。CYP3A作為肝臟CYP家族中主要的亞型，許多外源性和內源性物質都要經過其代謝，臨床上使用的藥物，約有60%經過CYP3A的代謝，如紅黴素、酮康唑以及他汀類藥物。研究表明，一些藥物與天然產物存在著相互作用，如葡萄柚汁能抑制CYP3A的活性，使得經過CYP3A代謝的藥物的生物利用度提高。 因此，CYP3A酶的活性對了解藥物代謝及相互作用十分重要。咪達唑侖(MDZ)作為CYP3A的探針藥，廣泛地用於體內外的研究，I-羥基咪達唑侖(1-0HMDZ)是其主要的代謝產物，通過測定咪達唑侖及其代謝產物含量，計算代謝率可以推測評價CYP3A酶的活性。目前，由於高效液相色譜法具有高效、快速和靈敏的特點，因而廣泛用於測定咪達唑侖及其代謝產物的濃度。如趙娜萍等(HPLC法測定大鼠血漿中咪達唑侖的含量及其在藥物相互作用研究中的應用，藥物分析雜誌，2007年第27期)以ー定比例的磷酸鹽緩衝液和甲醇作為流動相，該含磷酸鹽緩衝液的流動相配製繁瑣，而且磷酸鹽緩衝液易析出，磷酸鹽對儀器和柱子有一定的損害，其採用外標檢測法，操作誤差會對檢測結果造成較大的影響。

發明內容
本發明的目的在於提供一種可同時測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物I-羥基咪達唑侖濃度的方法，從而應用於CYP3A酶活性的評價。為了實現上述目的，本發明的技術方案採用了一種測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，包括如下步驟I)樣品預處理取大鼠肝微粒體加入咪達唑侖進行體外孵育，加入含內標物卡馬西平的こ腈溶液進行蛋白質沉澱，離心後取上清液20 μ L進樣；2)色譜柱分離採用通用型C18色譜柱，填料為Agilent Zorbax SB-C18，流動相為水-こ腈-O. I %三氟こ酸的混合液，該混合液的體積比為44 54 26 36 15 25 ;3)紫外檢測採用ニ極管陣列檢測器，檢測波長為230nm,流速為I. OmL · mirT1,柱溫為40°C,測定峰面積，用標準曲線方程計算咪達唑侖及其代謝產物的濃度。所述的代謝產物為I-羥基咪達唑侖。在步驟(2)所述的色譜條件下，I-羥基咪達唑侖、咪達唑侖以及內標卡馬西平的保留時間分別為3 4min、4 5min、7 8min。
採用本發明的方法具有以下優點(I)樣本預處理採用こ腈沉澱法直接處理樣品，省略了提取的步驟，快速簡易，蛋白沉澱效果好，而且能很好地終止微粒體的反應，適合體外孵育實驗。(2)流動相選用水-こ臆-O. I %三氟こ酸的混合液作為流動相，離子對試劑三氟こ酸的使用可改善I-羥基咪達唑侖、咪達唑侖以及卡馬西平色譜峰峰形不對稱、峰展寬和拖尾現象，取得了良好的分離效果，理論塔板數達到10000以上，可同時檢測咪達唑侖及其代謝產物的濃度。(3)內標法使用卡馬西平為內標，減少了操作誤差對檢測結果帶來的影響，卡馬西平的保留時間在7 8min左右，每個樣本的分析時間在9分鐘以內。本發明的樣本處理簡便、檢測靈敏快速，對肝微粒體中咪達唑侖和I-羥基咪達唑侖的濃度可同時進行檢測，可以應用於CYP3A酶活性的評價研究。本發明中咪達唑侖的線 性範圍為O. 06 12μ g · mじ1，ト羥基咪達唑侖的線性範圍為O. 06 3μ g · mじ1，提取回收率在95%以上，日內日間精密度標準偏差均小於10%。


圖I為咪達唑侖肝微粒體孵育後樣本的色譜圖。其中，I為I-羥基咪達唑侖，2為咪達唑侖，3為卡馬西平(內標物)。
具體實施例方式色譜條件色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 (4. 6mm x 150mm 5 μ m);保護柱為SB-C18 (4.6X12. 5mm，5 μ m，Agilent, USA);流動相為水-こ腈-O. I %三氟こ酸的混合液，該混合液的體積比為49 : 31 : 20，流速為I. Oml · mirT1 ;進樣量為20 μ L ;檢測器為ニ極管陣列檢測器(DAD);柱溫為40°C ;檢測波長為230nm。肝微粒體製備採用差速離心法製備肝微粒體。將大鼠斷頭處死，迅速取出肝臟，用冰冷的生理鹽水清洗，濾紙吸乾後稱重，每IOg肝臟加入25mL蔗糖PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝液)，在冰浴中充分勻漿。取勻漿液10，OOOg離心15min，取上清液再次10，OOOg離心15min，取上清，100, OOOg離心90min ;棄上清液，沉澱用IOmL的PBS復溶，_80°C分裝保存，以上所有操作在低於4°C環境中進行。用BCA法(雙辛可寧酸法)測定微粒體蛋白含量為20mg · mL 1 ο肝微粒體體外孵育及樣品的處理吸取微粒體10 μ L於I. 5mL的EP管，加入MDZ標準液25 μ L和PBS緩衝液215 μ L，於37°C水浴預孵育5min後，加入20mMNADPH 10 μ L啟動反應，繼續孵育5min後,置於碎冰中，加入200 μ L的こ腈以終止反應。再加入5 μ g ·ηιじ1的卡馬西平內標工作液，潤旋混勻2min後13，OOOrpm離心IOmin,取上清液於自動進樣器的進樣瓶中，設定20yL進樣。標準曲線配製MDZ 濃度分另Ij 為 O. 06,0. 12,0. 3,0. 6、I. 2、3、6、12μ g · mじ1 和1-0HMDZ濃度為O. 06,0. 12,0. 2,0. 3,0. 6、I. 2、2、3 μ g · mじ1的微粒體孵育體系，按上述樣品的處理方法操作，測定對MDZ面積As1U-OHMDZ面積As2、內標峰面積Ai。以As1Ai為縱坐標(Y1)，以MDZ對應各點濃度為橫坐標(X1)繪製MDZ的標準曲線。以ksjki為縱坐標(y2)，以1-0HMDZ對應各點濃度為橫坐標(X2)繪製1-0HMDZ的標準曲線。MDZ的標準曲線回歸方程為W = O. 9157x「0. 1157 (r = O. 9996) ；I-OHMDZ的標準曲線回歸方程為y2 =I. 2251χ2-0· 0691 (r = O. 9996)。提取回收率配製低、中、高三種濃度(MDZ濃度為O. 12，O. 6,6. OOyg-mじ1和1-0HMDZ濃度為O. 12，O. 3，2. 00 μ g · mじ1)微粒體孵育體系，每種濃度6份，處理後檢測，記錄MDZ和1-0HMDZ的峰面積，為微粒體孵育體系的峰面積。另取I. 5mL EP管6支，兩個ー組；每組配製成終濃度與低、中、高三種濃度(MDZ濃度為O. 12，O. 6,6. OOyg-mじ1和1-0HMDZ濃度為O. 12,0. 3,2. 00 μ g · πιΓ1)相同的標準品溶液，20 μ L進樣檢測；記錄不同濃度MDZ和1-0HMDZ的峰面積，為純標的峰面積。計算微粒體孵育體系的峰面積與純標的峰面積的比值，即為提取回收率，見表I。表I肝微粒體孵育體系MDZ和1-0HMDZ的提取回收率結果(η = 6，mean土SD)
權利要求
1.一種測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，其特徵在於包括如下步驟 1)樣品預處理 取大鼠肝微粒體加入咪達唑侖進行體外孵育，加入含內標物卡馬西平的有機溶劑進行蛋白質沉澱，離心後取上清液20 y L進樣； 2)色譜柱分離 採用通用型C18色譜柱，填料為Agilent Zorbax SB-C18，流動相為水-乙腈-0. I %三氟乙酸的混合液,該混合液的體積比為44 54 : 26 36 : 15 25 ; 3)紫外檢測 採用二極體陣列檢測器，檢測波長為230nm，流速為I. OmL mirT1，柱溫為40°C，測定峰面積，用標準曲線方程計算咪達唑侖及其代謝產物的濃度。
2.根據權利要求I所述的測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，其特徵在於所述的代謝產物為I-羥基咪達唑侖。
3.根據權利要求I所述的測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，其特徵在於所述步驟(I)中的有機溶劑為乙腈。
4.根據權利要求I或2所述的測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，其特徵在於在步驟(2)所述的色譜條件下，代謝產物I-羥基咪達唑侖、咪達唑侖以及內標卡馬西平的保留時間分別為3 4min、4 5min、7 8min。
全文摘要
本發明涉及一種測定肝微粒體中咪達唑侖及其代謝產物濃度的方法，包括如下步驟1)樣品預處理；2)色譜柱分離採用通用型C18色譜柱，填料為Agilent Zorbax SB-C18，流動相為水-乙腈-0.1％三氟乙酸的混合液，該混合液的體積比為44～54∶26～36∶15～25；3)紫外檢測採用二極體陣列檢測器，檢測波長為230nm，流速為1.0mL·min-1，柱溫為40℃，測定峰面積，用標準曲線方程計算咪達唑侖及其代謝產物的濃度。本發明的樣本處理簡便、檢測靈敏快速，對肝微粒體中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖的濃度可同時進行檢測，可以應用於CYP3A酶活性的評價研究。本發明中咪達唑侖的線性範圍為0.06～12μg·mL-1，1-羥基咪達唑侖的線性範圍為0.06～3μg·mL-1，提取回收率在95％以上，日內日間精密度標準偏差均小於10％。
文檔編號G01N30/02GK102706972SQ20121001165
公開日2012年10月3日 申請日期2012年1月15日 優先權日2012年1月15日
發明者徐濤, 王勇, 王哲, 胡國新, 邱相君 申請人:河南科技大學