卵巢癌抗獨特型微抗體的生產方法
2023-09-19 09:52:25
專利名稱：卵巢癌抗獨特型微抗體的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種高效生產卵巢癌抗獨特型微抗體的方法，以及有關的工程細胞的構建、卵巢癌抗獨特型微抗體表達和純化工藝。
背景技術：
1974年Jerne根據現代免疫學對抗體分子獨特型的認識，在Burnet「克隆選擇學說」的基礎上提出了著名的免疫網絡學說。該學說認為，任何抗體分子或淋巴細胞的抗原受體上都存在著獨特型，它們可被機體內另一些淋巴細胞識別而刺激誘發產生抗獨特型。以獨特型同抗獨特型的相互識別為基礎，免疫系統內構成「網絡」聯繫，在免疫調節中起重要作用。根據免疫網絡學說，抗獨特型抗體(anti-Id或Ab2β)(抗原刺激機體後產生抗體，這種抗體Ab1再次刺激機體產生抗抗體Ab2，抗抗體分為三種，其中一種為抗獨特型抗體，抗獨特型抗體中的Ab2β具有模擬抗原的作用)。具有模擬原始抗原誘導機體產生針對始動抗原的特異性抗體或細胞免疫應答，因而可抑制Ab1與相應抗原的結合反應。Ab2β具有與外來抗原相似的胺基酸排列順序或空間構型，它能夠在體內模擬始動抗原的作用，應用Ab2β的這一特性，可有目的地製備Ab2β，將其作為抗原的替代物用於基礎和臨床醫學研究。同時，Ab2β不僅可激發針對外來抗原或自身抗原Ab1產生前體細胞，使機體對入侵到體內的抗原迅速發生免疫應答，而且與記憶細胞的存在有關。當抗原被其誘發的免疫應答清除後，由於記憶細胞識別抗原受體具有更高的親和力，因而Ab2β替代原始抗原可能足夠刺激記憶細胞的增殖和存活。對Ab2β自模擬抗原的機制研究表明，Ab2β不僅具有模擬抗原的作用，同時又是重要的免疫調節因子，參與免疫反應的調節
(1)Ab2β可以通過模擬抗原的序列或結構，激活特異的細胞克隆，從而擴大對特定抗原的體液免疫反應。
(2)機體還可將Ab2β以抗獨特型肽的形式提呈給T細胞，使CD4+T細胞大量增殖，參與細胞免疫，有實驗表明此種反應有可能不受MHC限制。
由於鼠源化抗體蛋白在人體內誘發免疫反應而限制了其在人體內的應用。因此，從80年代中期人們就開始研究用基因工程的方法對鼠單抗進行改造或人源化。其中小分子抗體是重要的方法之一。1993年，義大利學者Pessi首先在其文章中使用了微抗體(minibody)一詞，來命名一種人工合成的僅有61個殘基，但又具有結合金屬活性的抗體。有研究者在荷瘤小鼠進行了完整的IgG，F(ab』)2，scFv，和微抗體的免疫顯像效果和治療效果的比較研究，結果發現微抗體的顯像效果最好，而在治療效果中以完整IgG和微抗體為佳。
卵巢腫瘤是婦科常見腫瘤，佔女性生殖器官腫瘤的32％。它可發生於任何年齡，從嬰幼兒到老年均可見到，但生育年齡的發病率最高。由於卵巢位於盆腔內，發病初期很少有症狀，其惡性腫瘤極易擴散並出現腹水。目前國內外尚缺乏實用的早期診斷方法，而一旦發現，往往已屬晚期。儘管對於卵巢癌的治療近年來已有了長足的進展，但卵巢癌5年生存率仍徘徊在30％左右，病死率超過宮頸癌和宮體癌之和，嚴重危害廣大婦女的健康。美國National CancerInstitute 1999年的統計數據表明，卵巢癌的發病率是女性癌症發病率的第五位。其中白種女性、日本、西班牙和菲律賓中發病最高的年齡段為30-54歲。
由於目前已發現的腫瘤抗原極少，且難以大量製備。因而利用Ab2β的特性製備腫瘤疫苗倍受重視，稱為″抗獨特型疫苗″。Wagner等用抗獨特型抗體ACA125作為疫苗治療了16例晚期或復發的上皮性卵巢癌。這些患者接受了3至9次的ACA125免疫治療，其中9例患者誘導產生了Ab3(Ab2β注入荷腫瘤的動物或病人可誘導出稱之為抗-抗-獨特型抗體的Ab3)和特異性的細胞免疫反應，3例患者IFN-y升高。這些患者的平均無進展生存期為11個月，而Ab3陰性組為8個月。Remartz等用ACA125對45例晚期或復發的卵巢癌患者進行主動免疫治療，患者外周血T淋巴細胞內IFN-r，，IL-2，IL-4增加。
COC166-9鼠單克隆抗體對卵巢上皮癌具有較好的特異性，免疫組織化學染色證實80％卵巢上皮癌染色陽性，而與其他惡性組織交叉反應較少，在已檢測過的正常組織中尚未發現交叉反應。用COC166-9免疫同系小鼠，製備出來的抗獨特型抗體6B11具有模擬卵巢癌抗原OC166-9的功能，可在體內外誘導產生特異性抗卵巢癌體液免疫和細胞免疫反應。我們將6B11scFv(單鏈可變區)與帶有人IgG1鉸鏈區的重鏈CH3片段融合構建小分子抗體基因，即抗獨特型微抗體(anti-Idminibody)基因，並進行表達。由於該抗體，通過與CH3融合，增加了分子量和穩定性，實現了部分人源化。在體內應用時，具有scFv片段和其他融合蛋白無法比擬的優越性。
但由於6B11VLVHhC基因是真核生物基因，目前公開的6B11VLVHhC基因5′端起始序列的G和C含量較高，含有較多的大腸桿菌的稀有密碼子，在大腸桿菌中的表達量很低，不適宜大規模生產。
本發明系統提供了一種高效生產卵巢癌抗獨特型微抗體的方法。通過優化編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，優化表達載體/宿主菌組合，同時改進發酵工藝，提高卵巢癌抗獨特型微抗體的表達水平。同時簡便純化工藝，獲得高表達、高得率、極具產業化價值的一種卵巢癌抗獨特型微抗體生產方法。
發明內容
本發明的目的就是提供一種高效和/或簡便的生產卵巢癌抗獨特型微抗體的方法。
本發明的另一目的就是提供卵巢癌抗獨特型微抗體的編碼序列和用於該方法的表達載體及工程細胞。
在本發明的第一方面，就是提供了一種編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，就是提供了一種表達載體與宿主菌的優化組合，其特徵在於，所述的表達載體含有權利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優選例中，所述的表達載體是pTrcHisA/6B11VLVHhC。
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特徵在於，它整合有權利要求3所述的表達載體。
在本發明的第四方面，提供了一種生產卵巢癌抗獨特型微抗體的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達條件下，培養如權利要求4所述的宿主細胞，從而表達出卵巢癌抗獨特型微抗體；b)分離純化出表達的卵巢癌抗獨特型微抗體。
在本發明的另一優選例中，所述的步驟(a)的培養條件包括(i)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源如蛋白腖、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(ii)無機鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩衝體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(iii)在培養基中添加維生素B1作為補充維生素，濃度1～1000PPM。
(iv)根據M9培養基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是單一碳源，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
在本發明的另一優選例中，所述的步驟(b)的分離條件包括(vi)對發酵樣品通過離心和/或過濾方式取出發酵上清液，獲得菌體；(vii)破碎細胞，獲得破菌液；(viii)對破菌液進行離心以去除破菌上清液，獲得沉澱；(ix)將沉澱進行變復性；(x)通過鹽析和/超濾進行初步層化後，或直接通過層析純化方法，從而得到純度達到95％的純品。
圖1顯示了表達質粒pTrcHisA/6B11VLVHhC的構建過程。
附圖2是人卵巢癌抗獨特型微抗體基因6B11VLVHhC的PCR擴增與電泳鑑定，其中泳道1為1kb DNA Ladder，泳道2為6B11VLVHhC基因的PCR產物。
具體實施例方式
本發明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優化設計，將卵巢癌抗獨特型微抗體編碼序列轉入大腸桿菌，從而實現了高水平表達，在此基礎上完成了本發明。
在另一優選例中，通過表達質粒和宿主菌的優化組合，進一步提高了卵巢癌抗獨特型微抗體的表達水平。
在另一優選例中，還通過發酵工藝的優化，不僅提高了卵巢癌抗獨特型微抗體表達量，而且簡化了分離純化工藝。
外源基因的高水平表達，至少涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關係，也受其所處的環境條件的影響，本研究通過優化選擇多種表達載體，如pBADHisA、pBAD/gIIIA、pTrcHisA等，獲得表達載體/宿主菌的優化組合。將修飾後的6B11VLVHhC插入不同的表達載體，轉化大腸桿菌，通過表達實驗結果，優選載體pTrcHisA-宿主菌JF1125組合，實現了在大腸桿菌中的高效表達，表達量佔細胞總蛋白的50％左右。質粒pTrcHisA拷貝數高，帶有trc啟動子、rrnBanti-termination region及rrnB轉錄終止子，可使外源基因得到高效穩定表達；同時，宿主菌JF1125在發酵過程中不易受到微生物的侵染。
為大規模獲得卵巢癌抗獨特型微抗體，需要在發酵罐中進行表達培養。本發明研究了中試發酵工藝，優化後的表達水平達到1500mg/L。
經過本發明的反覆實驗，優化後的表達條件如下(1)培養基高密度改良M9培養基。
(2)發酵條件培養溫度28～40℃，更佳為30～37℃；pH6.0～8.0，更佳為6.5～7.5；誘導劑IPTG濃度為0.1～2mM，更佳為0.2～1mM。
在發酵表達後，對表達的卵巢癌抗獨特型微抗體包涵體蛋白進行分離。通常，發酵樣品先以離心、過濾等方式去除發酵液上清，獲得菌體。緩衝溶液懸浮菌體後，以超聲波破碎、高壓機械破碎等方式進行完全破菌，獲得破菌液。然後對破菌液進行離心以去除破菌上清液，獲得沉澱。沉澱含目的蛋白質卵巢癌抗獨特型微抗體。對破菌沉澱進行變復性，獲得的有活性的卵巢癌抗獨特型微抗體再進行下步純化。純化一般包括兩個步驟，第一步採用鹽析和/或超濾進行初步純化，第二步採用層析純化方法。適用於本發明的層析技術包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經不同變復性和層析過程比較，優化的純化方法包括1.採用高壓壓榨破碎菌體的方式，獲得粗包涵體。
2.採用含有一定變性劑條件下的洗滌液純化包涵體，獲得純度大於85％的包涵體。
3.採用含有高濃度的變性劑溶解包涵體。
4.採用稀釋復性的方式，復性微抗體蛋白，獲得有活性的微抗體目的蛋白。
5.採用超濾的方式替換緩衝體系，使樣品適合進行層析純化。
6.採用一步陰離子交換層析的方式，並且選擇一定的梯度洗脫的方式，獲得純度大於95％的微抗體純品，同時去除了核酸等其他雜質。
經過上步純化，可得到卵巢癌抗獨特型微抗體純品，純化得率40％以上，純度95％以上，純品得率約500mg/L發酵液。
純化後卵巢癌抗獨特型微抗體可用常規技術製成各種劑型。
在本發明的一個實例中，提供了卵巢癌抗獨特型微抗體基因的獲得及表達質粒的構建，優化後的基因使得表達卵巢癌抗獨特型微抗體的表達量提高。
在本發明的另一個實例中，經過表達載體和宿主菌的組合優化，進一步提高了卵巢癌抗獨特型微抗體的表達量。
在本發明的另一個實例中，經過發酵工藝的優化，進一步提高了卵巢癌抗獨特型微抗體的表達量。
在本發明的另一個實例中，經過純化，可得到純品500mg/L。
純化後原液加入適當輔料，製成卵巢癌抗獨特型微抗體的注射用粉針劑。初步穩定性試驗表明，該粉針劑穩定。
中試研究表明，產品製造工藝穩定，操作簡單，周期短，成本低，每升發酵液可獲得卵巢癌抗獨特型微抗體純品500mg。適合產業化生產。
本發明的優點在於(1)優化後的卵巢癌抗獨特型微抗體基因非常適合在大腸桿菌中表達，具有高表達、高穩定的特點。
(2)優化的表達載體和宿主菌的組合進一步提高了表達量，通過控制關鍵的發酵工藝條件，使表達水平達到1500mg/L。
(3)變復性工藝簡單，蛋白復性率高。
(4)純化工藝簡便，回收率高，使得大規模生產卵巢癌抗獨特型微抗體成為可能。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1目的基因的獲得及表達質粒的構建目的基因的獲得人卵巢癌抗獨特型微抗體基因來源於北京人民醫院婦科腫瘤研究中心，我們設計了引物對之進行優化，優化後的基因序列如SEQ ID NO1所示。設計一對引物，用PCR的方法對未優化的基因5′端序列進行定點修飾，同時引入NcoI、EcoRI酶切位點。
表達質粒的構建選擇大腸桿菌JF1125作為宿主菌，並對該菌株進行了改造，將構建好的表達質粒pTrcHisA/6B11VLVHhC轉化大腸桿菌JF1125。從含100μg/ml氨苄青黴素和34μg/ml氯黴素的LB平板上分別挑取單克隆(JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC)，接種到3ml LB液體培養基中，37℃恆溫搖床上300rpm振蕩過夜，接種于于20mL LB(氨苄青黴素濃度為100μg/ml和34μg/ml氯黴素)培養液中，在37℃，250rpm條件下培養至OD600＝0.5-1.0，此時細胞處於對數生長期；無菌條件下加入IPTG至終濃度為1mM，繼續在37℃，250rpm條件下誘導表達，3小時後取樣，SDS-PAGE檢測表達情況。結果表明在41KD附近有一表達條帶，分子量與微抗體的理論分子量基本一致。
實施例2表達載體和宿主菌的優化組合選擇大腸桿菌JF1125作為宿主菌，並對該菌株進行了改造，將構建好的表達質粒pTrcHisA/6B11VLVHhC、pBADHisA/6B11VLVHhC，pBAD/gIIIA/6B11VLVHhC分別轉化大腸桿菌JF1125。從含100μg/ml氨苄青黴素和34μg/ml氯黴素的LB平板上分別挑取單克隆，接種到3ml LB液體培養基中，37℃恆溫搖床上300rpm振蕩過夜，接種于于20mL LB(氨苄青黴素濃度為100μg/ml和34μg/ml氯黴素)培養液中，在37℃，250rpm條件下培養至OD600＝0.5-1.0，此時細胞處於對數生長期；然後在無菌條件下向菌株JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC的培養液加入IPTG至終濃度為1mM、菌株JF1125/JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC和JF1125/JF1125/pBAD/gIIIA/6B11VLVHhC培養液中加入阿拉伯糖至終濃度0.002％，繼續在37℃，250rpm條件下誘導表達，3小時後取樣，SDS-PAGE檢測表達情況。
根據SDS-PAGE圖譜掃描結果如下
通過實驗比較，採用菌株JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC獲得的人卵巢癌抗獨特型微抗體表達量最高，效果明顯。
實施例3卵巢癌抗獨特型微抗體發酵配製LB發酵種子液300ml和M9發酵培養基2.7L，配製50％葡萄糖與5％CA補料100ml。放在250ml三角燒瓶中。消毒。種子液冷卻後接種。達到OD 0.6～1後，停止培養，接種上罐。控制溫度37℃，pH＝7.0，培養至OD到3.0，加入0.6g IPTG進行誘導，3小時後收罐，期間流加補料維持菌生長。離心收集菌體，SDS-PAGE電泳結果顯示目的蛋白表達水平達到50％。
實施例4卵巢癌抗獨特型微抗體純化
經過以上純化工藝，最後可得蛋白純品500mg/L。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海新生源醫藥研究有限公司120卵巢癌抗獨特型微抗體的生產方法160221012111143212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)…(1143)223優化的人卵巢癌抗獨特型微抗體基因4001ATGGGAGATA TCGAACTTAC TCAATCACCG CTGTCCCTGC CTGTCAGTCT50TGGAGATCAA GCCTCCATCT CTTGCAGATC TAGTCAGAAC CTTGTACACA100GTAATGGAAA CACCTATTTA CATTGGTACC TGCAGAAGCC AGGCCAGTCT150CCAAAGCTCC TGATCTACATA GTTTCCAACC GATTTTCTGG GGTCCCAGAC200AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACACTCA AGATCAGCAG250AGTGGAGGCT GATGATCTGG GAGTTTATTT CTGCTCTCAG AGTACACATT300TTCCGTACAC GTTCGGAGGG GGGACAAAGT TGGAAATAAA ACGGGGTGGA350GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGTCAAACT400GCAGGAGTCT GGCCCTGGGA TATTGCAGCC CTCCCAGACC CTCAGTCTGA450CTTGTTCTTT CTCTGGGCTT TCACTGCACA CTTATGGTAT AGGAGTAGGC500TGGATTCGTC AGCCTTCAGG GAAGGGTCTG GAGTGGCTGG CACACATTTG550GTGGAATAAT AATAAGTACT ATAACACAGC CCTGAAGAGC CGGCTCACTG600TCTCCAAGGA CGCCTCCAAC AACCAGGTAT TCCTCAACAT CGCCAGTGTG650GACACTGCAG ATACTGCCAC ATACTACTGT GCTCGAATAG CCCTTATTAC700
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權利要求
1.一種編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如權利要求1所述的核苷酸序列，其特徵在於，含有SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
3.一種表達載體和宿主菌的優化組合，其特徵在於，所述的表達載體含有權利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種工程細胞，其特徵在於，它整合有權利要求3所述的表達載體。
5.如權利要求4所述的工程細胞，其特徵在於，它是大腸桿菌。
6.一種生產卵巢癌抗獨特型微抗體的方法，其特徵在於，該方法包括步驟(a)在適合的表達條件下，培養如權利要求4所述的工程細胞，從而表達出卵巢癌抗獨特型微抗體；(b)分離純化出表達的卵巢癌抗獨特型微抗體。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述步驟(a)的培養條件包括培養溫度28～40℃，更佳為30～37℃；pH6.0～8.0，更佳為6.5～7.5；誘導劑IPTG濃度為0.1～2mM，更佳為0.2～1mM。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述步驟(b)的分離條件包括(i)對發酵樣品通過離心和/或過濾方式取出發酵上清液，獲得菌體；(ii)破碎細胞，獲得破菌液；(iii)對破菌液進行離心以去除破菌上清液，獲得沉澱；(iv)將沉澱進行變復性；(v)通過鹽析和/或超濾進行初步純化，或直接通過層析純化方法，從而得到純度達到95％的純品。
全文摘要
本發明提供了一種編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，高效生產卵巢癌抗獨特型微抗體的生產方法，以及有關的工程細胞構建、表達和純化的工藝。優化後的卵巢癌抗獨特型微抗體基因，非常適合在大腸桿菌中表達，同時通過優化組合表達質粒和宿主菌以及發酵工藝優化，提高了表達量，具有高表達、高穩定的優點。本發明可高效、簡便、低成本的獲得卵巢癌抗獨特型微抗體純品。
文檔編號C07K1/00GK1854295SQ20051002536
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月25日 優先權日2005年4月25日
發明者任軍, 黃陽濱, 孫九如, 顧小偉, 賴偉萍, 沈麗麗 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司