在cho細胞內表達重組蛋白的方法

2023-09-19 23:18:00

專利名稱：在cho細胞內表達重組蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及在CHO細胞系內表達重組產物基因的方法，涉及重組CHO細胞系，還涉及新的表達載體構建物。
中國倉鼠卵巢細胞(CHO)哺乳動物表達系統被廣泛用於生產重組蛋白。除了諸如雜交瘤細胞系等淋巴細胞系之外，它是極少數能夠簡單而有效地進行高密度動物細胞懸浮培養的細胞系之一。而且，它們的產品得率非常高，抗代謝壓力能力較強，淋巴細胞則較難進行產業規模的培養。考慮到生產成本，這對於獲得生物反應器每輪運行的蛋白最大得率來說至關重要。培養基組成的選擇，生物反應器的設計和操作這些參數影響著得率，但其優化十分複雜。增強調控蛋白質表達的啟動子的強度和轉錄活性更有可能提高得率。在靜止期以106至107細胞/毫升的細胞密度進行基因表達的高密度或補料分批批培養中，單細胞表達水平的增長將轉化為相當可觀的得率增長。
US5,866,359描述了一種在CHO細胞和NSO細胞內通過弱啟動子與腺病毒E1A的共表達來增強本已很強的hCMV啟動子的表達。E1A是一種多功能轉錄因子，作用於細胞周期調節，同時具有獨立轉錄活化結構域和抑制功能結構域。將E1A表達水平精調到較低水平是實現基因的反式激活和避免對細胞周期進展造成不利影響之間理想平衡的關鍵。除了需要仔細選擇啟動子驅動的E1A表達之外，該系統的缺點還在於部分抑制E1A表達細胞的蛋白質合成能力而不是目標重組蛋白的表達。
WO95/17516在B細胞系的淋巴細胞例如廣泛使用的NSO骨髓瘤內用鼠免疫球蛋白γ2A基因座將表達載體構建物導向高活性基因座。NSO細胞是一種鼠漿細胞或B細胞腫瘤細胞系。唯有在B細胞內，還該免疫球蛋白基因座的染色質才處於完全活化且開放的狀態，才允許整合於這些基因座中的天然免疫球蛋白啟動子或重組表達構建物表現出高轉錄活性。
其缺點在於，由於同源重組原則，只有在含有該重組熱點的γ2A導向序列相匹配的鼠細胞系內，導向序列才能有效定向；要獲得高水平的表達，γ2A基因座區必需是一個基因轉錄活躍區，這限制了導向序列與B細胞類細胞同源重組的有效性。
本發明的目標在於提供一種適合CHO蛋白表達的表達系統，該系統能夠增強標準啟動子的表達。根據本發明，為CHO細胞的表達載體配備一段原用於在鼠B細胞內同源重組的基因導向序列出人意料地實現了這一目標。
附圖顯示了本發明幾種可能的實施方式。其中

圖1CHO-K1細胞瞬時轉染中，hCMV啟動子和hCMV啟動子在IgG 2A熱點序列存在下的綠螢光蛋白(GFP)相對表達水平。
圖2穩定轉染的CHO-K1細胞內，hCMV啟動子和hCMV啟動子在IgG 2A熱點序列存在下的GFP相對表達水平。
圖3帶有IgG 2A導向序列的hCMV-MIE表達載體的質粒圖譜。
根據本發明，一段用於在哺乳動物細胞內表達重組基因的DNA序列包含重組產物基因和調控該產物基因表達的啟動子，以CMV啟動子為佳，還包含能夠增強啟動子所調控表達的鼠免疫球蛋白γ2A基因座DNA序列或其片段或其序列變體。根據本發明，這樣的DNA序列可用於構建在CHO細胞內表達重組產物的表達載體。
根據本發明，重組蛋白質的表達包括以下步驟a.培養以表達載體轉染的CHO細胞，該表達載體含有能在CHO細胞內驅動重組蛋白表達的啟動子和能夠增強所述啟動子活性的鼠IgG 2A基因座DNA或其序列變體或其片段，和b.收穫產物蛋白。
本發明的重組產物指希望大量表達和收穫的產物蛋白。它可以是各種感興趣的蛋白質，例如白介素之類治療用蛋白質，酶，或抗體等多聚體蛋白的亞基，或它們的片段。重組產物基因可包含一段信號序列，其編碼的序列令表達的多肽向宿主生產細胞外分泌。本發明另一優選實施方式中，所述產物蛋白是分泌蛋白。更好的是，第一蛋白或產物蛋白是抗體或基因工程抗體或其片段，最好是免疫球蛋白G(IgG)抗體。
鼠免疫球蛋白γ2A基因座(IgG 2A)的DNA序列最早在WO95/17516中被設計用作基因組導向序列用於產生高表達重組產物的穩定重組B淋巴細胞系。B淋巴細胞或漿細胞一般以極高的水平表達Ig重鏈基因座的免疫球蛋白RNA，這可能是因為其細胞類型特異性啟動子/轉錄因子活性和開放式染色質結構。本發明優選的鼠免疫球蛋白γ2A基因序列與WO95/17516所用的導向序列相同。這是一段5.1kb的BamHI基因組片段，包括除CH1外顯子最5』部分之外全部的鼠Igγ 2A編碼區(Yamawaki-Kataoka，Y.等，美國科學院學報(1982)792623-2627；Hall，B等，分子免疫學(1989)26819-826；Yamawaki-Kataoka，Y.等，核酸研究(1981)91365-1381)。根據本發明，促進定點同源重組不是相關的免疫球蛋白γ2A(IgG 2A)基因特性。因此，所述IgG 2A基因序列的各種變體或其片段或變體的片段，如果在CHO細胞內瞬時表達或穩定表達條件下都能夠增強重組產物基因在啟動子例如優選的hCMV啟動子調控下的表達，則都在本發明範圍之內。
這樣，「功能性」變體包括例如鹼基的插入、缺失或點突變，並可用本領域熟知的方法來產生，例如引物引導的PCR，「易錯」PCR，「基因改組(gene-shuffling)」PCR即通過PCR將交疊的DNA片段進行重新組合，或者先對細菌克隆進行體內隨機誘變然後在CHO細胞內進行基因庫轉染和功能選擇。例如，隨機誘變可按照Miller，J.，的《分子遺傳學實驗》(冷泉港，1972)所述用烷基化劑或UV-輻照進行。或者，還可以採用宿主菌的天然突變株。
在DNA序列中，這樣的變體序列或序列片段與天然免疫球蛋白γ2A基因座相應部分的序列同源性至少為65％，至少75％為佳，至少90％最好。例如，可以在位於膜外顯子2(M2)上遊39bp處的天然StuI位點插入一個SalI限制位點作為鼠免疫球蛋白γ2A序列內一個獨特的線性化位點；這樣的序列變體最初被設計用於定點重組導向，但也可用於本發明目的。
「啟動子」指引導RNA聚合酶與DNA結合併啟動RNA合成的一段DNA序列。本發明的啟動子是在CHO細胞內有活性的啟動子。這樣的啟動子最好是強啟動子。強啟動子指在CHO-KI細胞內引發mRNA合成的頻率等於或高於hCMV核心啟動子/增強子片段(US5168062)的啟動子。這樣的啟動子可以是例如US5589392所述的細胞類型依賴性啟動子，但更好的是通用強啟動子，尤其是組成型活性的病毒啟動子，例如SV40病毒的早期或晚期啟動子，人或鼠巨細胞病毒(mCMV或hCMV)的立即早期啟動子，單純性皰疹病毒的胸苷激酶(TK)啟動子，Rous肉瘤病毒長末端重複啟動子(RS-LTR)，尤其好的是US5,385,839和/或EP-323997-A1所述的呈2.1kb PstI片段的hCMV-MIE啟動子。EP-323 997-A1所述的帶有hCMV主要立即早期(MIE)基因的完整首個功能性內含子的hCMV啟動子尤為本發明實施方式所優選。
用於本發明的hCMV啟動子在其上遊/增強子部分最好沒有「調節子(modulator)」序列部分。已發現，「調節子」序列對hCMV啟動子在CHO細胞內的活性不利，該序列從MIE轉錄起始位點-750bp處延伸至-1150bp(Meier等，1996，Intervirology39331-342，「hCMV立即早期基因表達的調控」)，在瞬時轉染中尤其不利。沒有調節子序列的IgG 2A熱點序列(無調節子或縮寫為mod-)對hCMV啟動子的增強效應甚至更明顯。
瞬時轉染的特徵在於不對載體所帶的選擇標記施加任何選擇壓力。瞬時轉染所得的是一混合細胞群，其中既有攝取了外源DNA並能夠表達的細胞也有沒有攝取外源DNA的細胞。那些表達外源表達盒的細胞常常還沒有將轉染的DNA整合到基因組內，因而容易丟失外源DNA，而且其在瞬時轉染細胞群培養物中的生長優於轉染細胞。所以，剛轉染後的表達最強，而後逐漸減弱。較好的是，將本發明所述的瞬時轉染子理解為能夠在轉染後，在無選擇壓力的條件下，在細胞培養物中維持90小時的細胞。
較好的是，本發明的轉染CHO宿主細胞是穩定轉染的細胞，尤其是就前述hCMV啟動子而言。穩定轉染即新引入的外源DNA通過隨機非同源重組被整合到基因組DNA內；就載體序列而言，本發明所述的穩定轉染可能丟失與重組產物基因表達非直接相關的部分載體序列，例如在基因組整合後成為多餘的細菌拷貝數控制區。轉染細胞至少向基因組內整合了表達載體的一部分或多個不同部分。類似的，本發明所述的轉染宿主細胞還包括用兩個或數個DNA序列轉染CHO細胞從而至少在體內形成本發明表達載體必需元件的功能性對等物，即合適的啟動子和IgG 2A熱點序列調控下的產物基因。關於DNA片段轉染後功能性DNA序列的體內裝配可參見例如WO99/53046。如果進一步受到為基因擴增而施加的選擇壓力，這樣的穩定整合可能會在CHO細胞內形成雙微染色體。這也屬於本發明所述的「穩定」。本發明表達載體隨機整合到CHO細胞基因組內後，導向序列將增強啟動子促進重組產物蛋白表達的活性。這一效應是無法基於成熟鼠B細胞系例如漿細胞瘤(plasmacytoma)骨髓瘤細胞系內的同源基因定向所實現或預見的；在那樣的定向中，IgG 2A導向序列的作用僅限於提高高得率同源整合子(integrants)的頻率，因為IgG 2A基因座是一重組「熱點」。如上所述，在合適的目標B細胞內，免疫球蛋白基因組區的染色質處於開放的高活性狀態。
「表達載體」指轉染後mRNA在合適的哺乳動物宿主細胞內轉錄和翻譯所必需的DNA序列。正確構建的表達載體通常應包含至少一個可在動物細胞中表達的選擇標記，用於插入重組產物基因的表達盒使其處於上遊啟動子區調控之下的數量有限的有用的限制位點。如果僅用於瞬時/游離型表達，表達載體還可以包含一個複製起點，例如Eppstein Barr病毒(EBV)或SV40病毒的複製起點，用於在真核細胞宿主內自我複製/游離型維持，但可以沒有選擇性標記。表達載體例如但不限於線性DNA片段，包含細胞核定向序列或針對與轉染劑之間的相互作用而進行了優化的DNA片段，動物病毒或可以在細菌之間穿梭和複製的合適的質粒。可以採用各種常用選擇標記，例如胸苷激酶(tk)，二氫葉酸還原酶(DHFR)或穀氨醯胺合成酶(GS)。優選實施方式之一採用了可表達的GS選擇標記(Bebbington等，1992，「以穀氨醯胺合成酶基因作為可擴增選擇標記，重組抗體在骨髓瘤細胞中的高水平表達」，Bio/Technology10169-175；Cockett等，1990，「利用穀氨醯胺合成酶基因擴增，金屬蛋白酶組織抑制劑在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞內的高水平表達」，Bio/Technology8662-667)。GS系統是僅有的兩種對治療用蛋白質生產來說特別重要的系統之一。與二氫葉酸還原酶(DHFR)系統相比，GS系統在生長過程中具有很大的時間優勢，因為該系統一般可由最初的轉染子形成高產細胞系，這樣就不必通過不斷提高選擇試劑濃度的多輪選擇來實現基因擴增(Brown等，1992，「用穀氨醯胺合成酶(GS)系統生產重組抗體的方法的發展」，Cytotechnology9231-236)。不用說，與採用表達標記基因的第二轉錄單元等效的是利用例如常用的內部核糖體進入位點，一個表達單元可以用一個單順反子表達盒同時表達產物基因和標記基因。反之，本發明的熱點IgG 2A序列和包含啟動子和/或標記盒的表達盒不一定要在同一表達載體上順式運作；上述元件可以由共轉染的不同載體或DNA片段攜帶，然後在染色體上唯一的串聯整合位點進行整合。
本發明的另一目的是提供用本發明DNA序列轉染的CHO宿主細胞。其它目的還包括轉染此類宿主細胞的方法和在此類宿主細胞內表達重組產物基因的方法。本發明說明書中對優選實施方式的解說和引用同樣適用於以上所述本發明的其它目的。需要指出的是，用本發明DNA序列或載體轉染的宿主細胞應理解為瞬時轉染或穩定轉染的細胞系。本發明可根據宿主細胞類型選用各種轉染技術，例如本領域熟知的電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染、脂質轉染等。
合適的宿主細胞系可以是各種中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(Puck等，1958，試驗醫學雜質108945-955)。「宿主細胞」指能在培養物中生產並表達所需的重組蛋白質產物的細胞。合適的細胞系可以是例如CHO KI(ATCC CCL-61)，CHOpro-3，CHO DG44，CHO P12或dhfr-CHO細胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS77，1980，4216-4220)或DUXB 11(Simonsen等，PNAS80，1983，2495-2499)。在CHO細胞中，免疫球蛋白基因的基因座是不活躍的，因而染色質處於緊密包裝(packaged)或閉合狀態。這樣，由於染色質的這種特殊狀態，整合到免疫球蛋白基因座內的任何基因構建物都不能高水平地表達重組蛋白，除非該構建物自帶能夠開啟染色質中該表達盒兩側的旁側基因座調控區。而且，免疫球蛋白基因序列，尤其是其內含子部分，表現出相當的種間差異，例如在小鼠和倉鼠之間的差異。免疫球蛋白基因座的啟動子或增強子元件都是種特異性且組織特異性的，而且只在B細胞內具有活性。各種天然免疫球蛋白啟動子可產物編碼完整IgG重鏈的全長轉錄產物，本發明鼠IgG 2A序列即使沒有這樣的天然啟動子存在仍然能夠在CHO細胞內增強基因的表達。較好的是，本發明IgG 2A序列沒有這樣的啟動子。出人意料的是，用本發明表達載體瞬時轉染CHO細胞後，鼠IgG 2A導向序列甚至增強了CHO細胞內的基因表達(圖1)；這樣的瞬時表達是本發明方法的又一優選實施方式。一般發生在轉染後20-50小時的瞬時表達試驗中，轉染載體一直是染色體外元件，沒有整合到基因組內。
適合哺乳動物細胞系的培養基和培養方法是本領域眾所周知的，可參見例如US5633162。用於實驗室錐瓶培養或低密度細胞培養並根據不同細胞類型的需要而進行了改進的標準細胞培養基有例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養基(Morre，G.，美國醫學協會雜誌，199，p.519 f.1967)，L-15培養基(Leibovitz，A.等，美國衛生雜誌，78，1p.173 ff.1963)，Dulbecco’s改進的Eagle’s培養基(DMEM)，Eagle’s基本必需培養基(MEM)，Ham’s F12培養基(Ham，R.等，美國科學院學報53，p288 ff.1965)或Iscoves’s改進的無白蛋白、運鐵蛋白和卵磷脂的DMEM(Iscoves等，試驗醫學雜誌1，p.923 ff.，1978)。例如，Hams’s F10或F12培養基是專門為CHO細胞培養設計的。其它適合CHO細胞的培養基可參見EP-481 791。已知，可在這樣的培養基內補加胎牛血清(FBS，又稱FCS)，從而提供激素和生長因子的充沛的天然來源。動物細胞培養現在已經是一種常規操作，在科教課本和手冊中有詳盡的描述，例如，在R.Ian Fresney，《動物細胞培養手冊》第4版(Wiley-Liss/N.Y.，2000)有詳細的記載。
較好的是，本發明的細胞培養基不含胎牛血清(FBS或FCS)，可稱為「無血清」。在無血清培養基中，細胞一般需要胰島素和運鐵蛋白以達到最佳生長狀態。至少部分運鐵蛋白可以用非肽類螯合劑或WO94/02592所述的環庚三烯酚酮等鐵載體取代，或通過提高某種有機鐵的含量並最好配以抗氧化劑例如維生素C來取代。大多數細胞系需要一種或多種合成生長因子(包含重組多肽)，包括例如表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，胰島素樣生長因子I和II(IGFI，IGFII)等。可能需要的其它因子還包括前列腺素，轉運和結合蛋白(例如血漿銅藍蛋白，高密度和低密度載脂蛋白，牛血清白蛋白(BSA))，激素，包括甾體類激素，以及脂肪酸。多肽因子試驗最好按步驟進行，即在已知促生長多肽存在下測試新的多肽因子。那些生長因子是合成或重組的。在動物培養方面有多種方法，其中之一如下所述。首先需確定細胞從加血清培養基中轉移過來後能夠存活和/或緩慢生長3-6天的條件。對大多數細胞類型來說，這至少部分取決於接種密度。一旦找到了最適的激素/生長因子/多肽補劑就可降低存活所需的接種密度。在一更好的實施方式中，細胞培養基不含蛋白質，即沒有胎牛血清和各種蛋白質生長因子補劑或諸如重組運鐵蛋白之類其它蛋白質。
本發明方法即重組蛋白表達和收穫的一種可能的實施方式是動物宿主細胞在例如工業分批生物反應器內的高密度生長。然後可進行傳統的下遊加工。為此，必需採用高密度生長培養基。此類高密度生長培養基通常可補充以全胺基酸等營養素，前述含量的葡萄糖之類能源，無機鹽，維生素，微量元素(即最終濃度以微摩爾計的無機化合物)，緩衝劑，四種核苷或相應的核苷酸，(還原態)穀胱苷肽、維生素C等抗氧化劑，以及其它重要成分，例如重要的膜脂類，例如膽固醇或磷酯醯膽鹼，或脂類前體，例如膽鹼或肌醇。高密度培養基中上述化合物中的大多數或全部被增濃(強化)，使得它們的含量高於前述標準培養基，將GB2251249與RPMI1640相比既可看出這一點，但是作為滲透壓調節基準的無機鹽沒有被增濃。較好的是，本發明的高密度培養基中完全胺基酸除色氨酸外都被均衡強化，含量超過每升培養基75mg。較好的是，在達到胺基酸總體要求之外，穀氨醯胺和/或天冬醯胺的含量超過1g/L，超過2g/L更好。本發明中，高密度細胞培養物指動物細胞群中活細胞的即時密度至少為105個/毫升，至少106個/毫升更好，該集群由單細胞或低活細胞密度的接種物在恆量或遞增量的培養基中連續配以而得。
更好的實施方式中，分批培養物是一個培養物系統，其中，如GB2251249所述，在通過分批補料來控制葡萄糖濃度之外，至少向細胞培養物中補加穀氨醯胺，或者還有一種或數種其它胺基酸(優選甘氨酸)以保持它們在培養基中的濃度。更好的是，將穀氨醯胺或許還有一種或數種其它胺基酸的補加與一種或多種能源例如葡萄糖的補加相結合，如EP-229809A所述。首次補料一般在培養開始後25-60小時；例如，可以在細胞密度達到106個/毫升左右時開始加料。眾所周知，在培養的動物細胞中，「穀氨醯胺分解」(McKeehan等，1984，「動物細胞中的穀氨醯胺分解」，培養細胞中的糖代謝，M.J.Morgan編輯，Plenum出版社，紐約，pp.11-150)可能成為生長期的重要能源。補加穀氨醯胺和/或天冬醯胺(關於用天冬醯胺替代穀氨醯胺可參見Kurano，N等，1990，生物技術雜誌15，113-128)的總量一般為0.5-10g/L培養物，以1-2g/L為佳；補料中可以包含的其它胺基酸的總補料量為10-300mg/L培養物，具體地說，甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的補料量可以相對較高，至少150-200mg。所述補料可以是間歇式添加(shot-addition)或連續泵送添加，優選幾乎連續地向生物反應器泵送補料。不用說，在分批培養過程中，通過加鹼或緩衝劑，生物反應器內的pH被精心調控為最適合給定細胞系的生理pH。用葡萄糖作為能源時，總葡萄糖補料量一般為1-10g/L培養物，以3-6g/L為佳。補料中除胺基酸外最好還含有少量例如5-20mg/L培養物的膽鹼。更好的是，膽鹼的補加與乙醇胺的補加相結合，就象US6048728所述，尤其是同時補加穀氨醯胺的時候。不用說，如果採用GS-標記系統，穀氨醯胺的需量低於非GS-標記系統，內源性產生的穀氨醯胺之外過量穀氨醯胺的累積會產生氨和中毒。對GS來說，培養基或補料中的穀氨醯胺一般可用它的對等物和/或前體代替，即用天冬醯胺和/或穀氨酸。
本發明的另一個目的在於設計一種表達載體，它包含至少一個(第一)產物基因轉錄單元，該單元在宿主細胞內表達後即產生蛋白質，而且該單元受小鼠巨細胞病毒啟動子(mCMV啟動子)調控，還包含一個第二轉錄單元，該單元包含穀氨醯胺合成酶(GS)標記基因。所述產物基因，或稱之為感興趣基因(GOI)，可以是例如免疫球蛋白編碼序列。穀氨醯胺合成酶標記基因是編碼具有酶活性的GS的序列，包括天然序列或其變體。前文關於「功能性變體」的定義，包括序列同源性優選範圍，同樣適用於此。較好的是，所述GS標記基因是一哺乳動物GS標記基因或其衍生物。出人意料的是，與第一轉錄單元中感興趣基因受hCMV啟動子調控的表達載體相比，這樣的載體進入CHO細胞的轉染率高得多。這並非因為mCMV啟動子在CHO細胞內的轉錄活性比mCMV啟動子高得多；通常認為，轉染後，較高的代謝負荷會降低克隆的存活率，導致轉染子較少。這樣，不能簡單地將這一效果與所表達蛋白質產物的量或意料之外的不利於轉染子生長的毒性相關聯。實際上，以上發現大大出乎本領域技術人員的預料。
本發明的其它目的包括以表達載體轉染的動物宿主細胞尤其是CHO細胞和相關轉染方法，所述載體可以保持處於染色體外，也可穩定地整合到基因組內。同樣，用兩個或更多個基因片段轉染動物細胞尤其是CHO細胞，這多個基因片段體內形成作為本發明目標的轉錄單元的功能對等物，這也包括在轉染的宿主細胞這一定義之中。較好的是，所述宿主細胞是穩定轉染的細胞，即第一和第二轉錄單元都整合到染色體內。
本發明的另一目的是提供mCMV啟動子用於提高在CHO細胞內轉染率的用途，優選用如下表達載體進行的轉染該表達載體包含至少一個第一產物基因轉錄單元，該單元在宿主細胞內表達後即產生蛋白質，而且該單元受小鼠巨細胞病毒啟動子(mCMV啟動子)調控，還包含一個第二轉錄單元，該單元包含穀氨醯胺合成酶(GS)標記基因。所述第一和第二表達序列由不同的載體攜帶，或者作為分處不同表達單元中的基因片段。而且，可以用帶有mCMV的第一轉錄單元轉染表達GS的已重組CHO細胞。根據本發明，「提高轉染率」通過在相同轉染條件和相同細胞培養條件下，對相同宿主細胞，將mCMV啟動子和本發明表達載體存在下的轉染率與相同表達載體中mCMV被換以US5658759所述和本發明SEQID NO3所示hCMV-第一內含子增強子/啟動子構建物的轉染率相比較來定義。對於給定的相同產物基因，該hCMV-內含子MIE-啟動子構建物是測定轉染率增強效果的參照標準。較好的是，mCMV可將轉染率提高至少10倍。
以上定義都同樣適用於本發明的各項目的。需要強調的是，鼠IgG 2A導向序列並不是實現本發明目標的前提。
鼠細胞巨噬病毒(mCMV)是高度多樣性的皰疹病毒科的一員。即使是不同宿主的巨噬細胞病毒之間也可能存在顯著差異。例如，mCMV與人巨噬細胞病毒(hCMV)在生物學特性、立即早期(IE)基因組織和總體核酸序列上都存在相當大的差異。而且，235kbp的mCMV沒有hCMV特徵性的內部重複序列和末端重複序列。所以，mCMV基因組沒有異構體(Ebeling，A等，1983，病毒學雜誌47，421-433；Mercer J.A.等，(1983)，病毒學129，94-126)。根據本發明，可以利用基本對應於US4968615所述約2.1kb PstI片段的啟動子區或其功能性片段。更好的實施方式中，所用的cMCV啟動子片段包含轉錄起始點(+0)至此前-500bp序列。出人意料的是，這一片段驅動的表達比自-500bp再向前多800bp的啟動子盒更強。在最好的實施方式中使用的是啟動子核心區，即自轉錄起始點至上遊-150bp左右處的Xho I限制位點，甚至從天然轉錄起始點至上遊-100bp的序列。不用說，為了包含合適的限制位點以便插入重組產物基因，可以人工改造轉錄起始點。
根據本發明，受mCMV啟動子調控的第一轉錄單元可以包含至少一段內含子序列。這一做法是本領域的常識，是為了穩定RNA轉錄產物以提高由相應的mRNA合成蛋白質的效率。但是，為了蛋白質合成的效率，不考慮對轉染率的影響，不建議在mCMV啟動子構建物內包含mCVM的天然內含子。與hCMV啟動子的情形(US5591639)相反，這樣的mCMV第一內含子會降低mCMV啟動子下重組基因的表達，所以不是優選實施方式。
序列表給出了GS標記基因盒的優選、可能實施方式。SEQ ID NO1(pEE15.1hCMV/GFP+熱點)和SEQ ID NO2(pEE14.4 hCMV/GFP)是適宜的SV40(早、晚)啟動子調控的GS基因盒範例，這是一個中等偏弱啟動子，序列中還包含一個hCMV啟動子調控下的GFP(綠螢光蛋白)表達盒。SEQ ID NO1是SV40早期啟動子調控下的GS cDNA序列，有關其細節詳見附圖3。SEQ ID NO2一人造GS小基因盒，其中包含一個SV40晚期啟動子調控下的內含子。CHO細胞不是天然穀氨醯胺營養缺陷型的，所以可以進行Cockett等所述的選擇方案(1990，「利用穀氨醯胺合成酶基因擴增在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞內高表達金屬蛋白酶的組織抑制劑」，Bio/Technology8662-667)。該文獻還例舉了適合CHO細胞的轉染方法例如，可以採用經典的磷酸鈣沉澱法或較新的脂質轉染技術。轉染率一般定義為受轉染細胞群中轉染陽性細胞(瞬時轉染)或克隆(選擇期後的穩定轉染)的數量。本發明的效果可以通過例如用脂質轉染法(任意市售試劑和生產商的說明書)以包含SEQ ID NO3(pEE12.4 hCMV-GFP+SV 40早期啟動子/GS cDNA)或SEQ IDNO4(pEE12.4 mCMV-GFP+SV 40早期啟動子/GS cDNA)的質粒轉染CHO-K1細胞來展現。可將轉染後細胞培養在各種常規培養基中。這些培養基可以是前述含血清培養基或無血清培養基。較好的是含血清培養基，尤其是補充了至少1％(v/v)胎血清，最好是至少5％(v/v)胎血清，例如胎牛血清。另一優選實施方式採用電穿孔轉染法。
實施例實驗1包含熱點序列的GFP載體在CHO-K1內的瞬時表達和穩定表達CHO-K1細胞(ATCC CCL-6)在含10％FCS的普通細胞培養基(GMEM-S)中適應和培養。為了進行GS選擇，培養基必須完全不含穀氨醯胺，如後文表1所示；因此必需使用經透析FCS。培養均為36.5℃、125rpm的搖瓶培養。採用脂質轉染(SuperfectinTM，Gibco，UK)，轉染子細胞群的綠螢光在FACS中用488nm激發波長測定。對每一種GS/GFP載體構建物，各進行5次轉染，所有數據都是分析5個獨立細胞群所得的平均值。從轉染後48小時的瞬時轉染子開始，挑選細胞數vs.螢光度圖中表達水平為最高值10％的活細胞來確定平均螢光度(圖1)。通過在正向vs.側向散射圖(Forward vs.Sideward scatter diagram)中通過門控(gating)挑選出活細胞群。
為了產生穩定轉染子，轉染後24小時，在無穀氨醯胺培養基中添加25μMMSX(甲硫氨酸sulphoximine，Crockett等，ibd.)，繼續培養且定期分割培養物，持續26天，如此選擇GS標記。觀察其它胺基酸水平的中值對於MSX選擇強度的影響，參見Bebbington等，US5827739。然後如上所述進行螢光度分析(圖2)。
以非轉染細胞作為陰性對照。SEQ ID NO1展示了熱點載體(pEE15.1』hCMV+熱點)，它驅動GFP在hCMV啟動子調控下的表達，該啟動子含有完整的CMV第一內含子，該載體實際上就是圖3所示的pEE15.1載體內多接頭區的Eco RI限制位點插入了GFP序列。對應於SEQ ID NO3的pEE 12.4『hCMV與pEE 15.1』hCMV+熱點的區別僅在於不含內有IgG 2A序列的5.1kb的Bam H1片段。將pEE 12.4作為載體對照。另一個載體對照是pEE 12.4『hCMV(Kozak-)』，是通過引物引導的誘變(Sambrook等，《分子克隆》，冷泉港，1983)將與翻譯起始點重合的克隆位點的Kozak序列(GCCGCCACCATGG)移碼突變為功能性Kozak序列(ACCATGGTCCATGG)而形成的，由此消除了原先的Kozak翻譯起始點。SEQID NO1所示的載體被進一步刪除hCMV增強子部分400bp的調節子區，刪除轉錄起點上遊-750bp處的增強子元件，由此形成pEE 15.1『hCMV(mod-)/GS cDNA』。如圖2所示，將pEE 15.1(圖3)的GS cDNA盒換作SEQ ID NO2所示的pEE 14.4『hCMV(mod-)/GFP的GS(小基因)，形成pEE 15.1『hCMV(mod-)/GS小基因。這樣，所有被轉染細胞都含有包含GFP編碼序列的質粒載體。GS小基因含有單個GS基因的第一內含子和一段約1kb的3』側翼DNA，處於SV40晚期啟動子調控下；據信，基因組GS DNA的3』部分可提高載體DNA的拷貝數，因而可提高被轉染細胞內的GS含量(見US4770359，Bebbington等)。雖然本發明的所用的hCMV載體都表達GS cDNA序列中的GS標記基因，仍使用GS小基因作為又一對照來排除GS拷貝數和表達水平可能造成的影響。
為了分析穩定轉染的GHO細胞的產生和表達，用線性化的熱點載體pEE 15.1『hCMV+熱點』載體進行轉染。Sal I線性化質粒在含IgG 2A的序列部分被切斷，游離的DNA末端可能促進基因組區域的重組，所述基因組區域的兩側DNA需與所述末端具有一定程度同源性，由此可測試鼠IgG 2A在CHO細胞內可能具有的定向效果。Pvu I切斷在細菌內醯胺酶標記基因內，因而能夠促進異源隨機重組。實際上，Pvu I線性化轉染子內的螢光度較高，說明載體線性化有一定的影響，而且CHO細胞內向免疫球蛋白基因座的定向不能解釋本發明的效果。此外，在瞬時轉染細胞群中也一樣觀察到啟動子活性增強與各個載體構建物的相對強度密切相關。顯然，在轉染早期沒有發生基因組整合。
圖3顯示了約12830bp的載體pEE 15.1。有關GS標記和hCMV-p/內含子表達盒的詳細描述可參見US5827739和US5591639。pEE 15.1是本發明表達載體的一種可能實施方式，但其多接頭位點中沒有插入編碼重組產物蛋白的DNA序列。SEQ ID NO1展示了含有GFP的pEE 15.1構建物全部13535bp的序列其中，GFP編碼序列插在讀碼框內的Eco RI限制位點，該位點位於中部的12814鹼基處；該獨特限制位點含有ATG起始密碼並優化了起始密碼的Kozak序列環境，其詳述可參見US5591639。這樣，GFP蛋白表達就處於hCMV-重要立即早期基因啟動子(hCMF-MIE或簡寫為hCMV)調控下，其後則緊接hCMV-MIE基因的第一內含子，再後面是Nco I位點(見US5591639)。多接頭區下遊的SV40聚A位點確保了聚腺苷酸化的完成。pEE 15.1還含有一段編碼倉鼠穀氨醯胺合成酶(GS)的cDNA序列，該序列受SV40早期啟動子調控，其後是SV40內含子+聚A序列。IgG 2A基因座或「熱點」序列(陰影框CH1，Hi，CH2，CH3，M1和M2代表重鏈恆區，鉸鏈區，細胞膜錨定區)即WO9517516及其參考文獻中所述的鼠IgG 2A基因座的5.1kb BamH I片段。圖中顯示了獨特的Pvu I和Sal I限制位點。
實驗2用電穿孔法以mCMV p12.4-GFP構建物(SEQ ID NO4)轉染CHO細胞將附壁CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)培養在EP-48791所述含2mM穀氨醯胺並補加了10％FCS的Iscoves’s DMEM培養基中。可選的是，在如實驗1所述進行GS標記選擇之前，可用表1所示含2mM穀氨醯胺的G-MEM培養基。使細胞脫壁，沉澱，然後在無血清培養基中重懸兩次，最後配成每毫升5.3×106個細胞的密度。每批750μl，總共4×106個細胞接受電穿孔。如《分子生物學方法》，JA Nickoloff編，Humana出版社，1995，Vol.48/Chap.8「動物細胞電穿孔和電融合方法」所述進行電穿孔。將p12.4mCMV-GFP載體DNA(SEQ ID NO4)線性化。將50μl(20μg)DNA加入電穿孔小杯內的750μl細胞中，進行300V/750μFD，約12-14毫秒的電穿孔。然後，將800μl細胞轉移到T75錐形瓶中的25ml改進型Glasgow-MEM(GMEM，Gibco)培養基(含10％胎血清，但不含穀氨醯胺，詳見表1)中進行GS選擇。將12.9ml分入第二T75錐形瓶，37℃和10％CO2中培養過夜。
次日，加入補充了10％FBS+33.3μM MSX的GS選擇GMEM培養基。這樣，MSX的最終濃度約為25μM。繼續培養26天後，計點每瓶中的菌落數亦即轉染子數。用標準倒置顯微鏡對每一培養瓶進行顯微鏡檢，陽性克隆發出亮綠的光，因而很容易計點。
SEQ ID NO4所示的mCMV構建物產生的菌落數比SEQ ID NO3所示hCMV構建物轉染的細胞多20倍。這兩種載體構建物的區別僅在於驅動GFP表達的CMV啟動子不同，載體的其餘部分是一樣的(包括GS標記；p12.4的cDNA GS-標記盒)。如果在轉染後立即將細胞稀釋並加入96格培養板，mCMV細胞形成的菌落(＞400個)仍比hCMV轉染的細胞(約45個)多。
表1GS選擇培養基A.儲備液
1.雙蒸水高壓滅菌，每份400ml2.10×Glasgow MEM(GMEM)培養基，不含穀氨醯胺(GIBCO042-2541，在UK)。4℃保存。
3.7.5％碳酸氫鈉(GIBCO043-05080，在UK；670-5080，在US)。4℃保存。
4.100×非必需胺基酸(NEAA)(GIBCO043-01140，在UK；320-1140，在US)。4℃保存。
5.100×穀氨酸+天冬醯胺(G+A)加600mg穀氨酸和600mg天冬醯胺(Sigma)。用蒸餾水配製成100ml，經2μm濾膜(Nalgene)過濾除菌。4℃保存。
6.100mM丙酮酸鈉(GIBCO043-01360，在UK；320-1360，在US)7.50×核苷35mg腺苷35mg鳥苷35mg胞苷35mg尿苷12mg胸苷都購自Sigma。用水配製成100ml溶液，過濾除菌，分成每份10ml於-20℃保存。
8.經透析FCS(GIBCO014-06300)。在56℃熱滅活30分鐘，-20℃保存。採用GS選擇時，必需使用經透析FCS。
9.每毫升5000單位的青黴素-鏈黴素(P/SGIBCO043-05070，在UK；600-5070，在US)。
10.100mM L.MSX(Sigma)配成18mg/ml的PBS溶液。過濾除菌，-20℃保存。
B.培養基的製備以無菌操作按以下順序依次加入以下物質，配製成GMEM-S培養基。
1.水400ml2.10×GMEM 50ml3.碳酸氫鈉 18.1ml4.NEAA 5ml5.G+A 5ml6.丙酮酸鈉 5ml7.核苷 10ml
8.經透析FCS 50ml9.青黴素-鏈黴素 5mlGMEM-S培養基含有非必需胺基酸，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，脯氨酸和絲氨酸(100μM)，穀氨酸和天冬醯胺(500μM)，腺苷，鳥苷，胞苷和尿苷(30μM)，以及胸苷(10μM)。
序列表110英國龍沙生物醫藥股份有限公司120在CHO細胞內表達重組蛋白的方法130049369150GB0216648.61512002-07-191604170PatentIn version 3.121012116679212DNA213倉鼠(Hamster sp.)220
221misc_feature223Seq.ID.No.4環形質粒GS載體p12.4短mCMV-GFP/克隆34001gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420
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21110369212DNA213倉鼠(Hamster sp.)220
221misc_feature223Seq.ID.No.2環形質粒GS-小基因載體p14.4 Delta調節子(mod-)hCMVp-GFP/克隆64003gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt540tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg720cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc780tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc840cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa900cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg960acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1020aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1080tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1140gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1200cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1260cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1320
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221misc_feature223Seq.ID.No.1環形質粒GS+IgG 2A熱點導向載體pEE 15.1 hCMVp-GFP/克隆114004gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc 300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa 360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg 420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct 480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt 540tcaacaggtc tagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca 600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca 660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcga atatgccggc 720atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 780gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 840ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg 900tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag 960agcgtcgagt cctccgtgtt cgaagcgatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc1020tgtcctgcag tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg1080gcccagccag tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa1140gaaaattggt gaggaaaaca aggggagtag aggttcacaa gtgattagtc taaggcctta1200gcctagctag accagccagg atcagcagcc atcaccaaaa atgggaactt ggcccagaag1260agaaggagat actgactgtg actccctctt ggaaacttct aactatgacc acctaccttc1320aaggtcatga tcctctagga tagatgtcct tggtcatttc caggatcatc ctgacctaag1380gccataccca gggacaaagt ccctggtttg gtgccttttc tccttcaaac ttgagtaacc1440cccagccttc tctctgcaga gcccagaggg cccacaatca agccctgtcc tccatgcaaa1500tgcccaggta agtcactaga ccagagctcc acccgggaga atggtaagtg ctgtaaacat1560ccctgcacta gaggataagc catgtacaga tccatttcca tctctcctca tcagcaccta1620acctcttggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga1680tctccctgag ccccatagtc acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg1740
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1.一種以表達載體轉染的CHO細胞，所述表達載體包含在CHO細胞內具有活性並驅動重組產物蛋白表達的啟動子和鼠IgG 2A基因座DNA內增強所述啟動子活性部分。
2.如權利要求1所述的CHO細胞，所述載體還包含編碼選擇標記的轉錄單元，所述選擇標記以穀氨醯胺合成酶標記為佳。
3.如權利要求1或2所述的CHO細胞，所述CHO細胞被穩定轉染。
4.一種表達重組蛋白的方法，包括以下步驟c.培養以表達載體轉染的CHO細胞，所述表達載體包含在CHO細胞內具有活性並驅動重組產物蛋白表達的啟動子和鼠IgG 2A基因座DNA內增強所述啟動子的活性的部分；d.收穫產物蛋白。
5.如權利要求4所述的方法，所述啟動子是強病毒啟動子，以hCMV啟動子為佳。
6.如權利要求4或5所述的方法，所述IgG 2A基因座部分沒有天然免疫球蛋白啟動子。
7.一種哺乳動物表達載體，至少包括包含產物基因並受mCMV啟動子調控的第一轉錄單元，還包括包含穀氨醯胺合成酶標記基因的第二轉錄單元。
8.用權利要求7所述載體轉染的CHO細胞。
全文摘要
一種用包含鼠IgG 2A基因座的表達載體在CHO細胞內表達重組蛋白的方法。
文檔編號C12N15/87GK1668749SQ03816914
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月21日 優先權日2002年7月18日
發明者R·卡利邁耶, R·蓋伊 申請人:英國龍沙生物醫藥股份有限公司