脾靶向dna遞送系統的製作方法
2023-09-20 00:04:55 1
專利名稱：脾靶向dna遞送系統的製作方法
技術領域：
本發明屬藥物製劑領域，涉及納米藥物製劑領域，具體涉及一種含有DNA的脾靶向遞送系統，即一種可靜脈注射遞送質粒DNA，在脾臟富集的納米粒給藥系統。
背景技術：
脾臟是全身最大的外周淋巴器官，是清除血源性病原體並誘導細胞及體液免疫的主要場所，有豐富的B、T細胞及巨噬細胞、樹突狀細胞、漿細胞等，將疫苗定嚮導入脾臟和脾細胞，將誘導較強的免疫反應，並產生大量的效應細胞如K、NK、CTL細胞等以及各種細胞因子和抗體。脾臟有可能成為免疫接種的主要效應器官之一。在免疫學基礎研究中，有報導將裸核酸疫苗肌注、皮下注射和脾內直接注射等多種接種方式誘導特異性CTL應答，發現脾內直接注射可誘導出明顯高於肌注和皮下接種時的CTL應答水平(Vaccine，1998，16(2～3)∶208～215)。據此認為將核酸疫苗靶嚮導入富含APC3和細胞因子的脾臟，可能更加有利於CTL應答的誘導。研究發現，脾內直接注射核酸疫苗具有創傷性，且注入的核酸疫苗很快被酶所降解。目前尚沒有方便的將疫苗導入脾臟的方法，但脾靶向性藥物遞送系統可以將核酸疫苗定向輸送至脾進行免疫，有利於誘導免疫應答，還可防止核酸疫苗在體內的降解，減少在其他組織的分布及毒副作用。
一般普通高分子材料如聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酸、白蛋白、殼聚糖等製備的納米粒靜脈注射後，首先被肝臟的枯否氏(Kupffer)細胞所截留攝取，而難以被轉運至全身的其他部位。但具某種理化特徵的「隱形」(stealth)納米粒靜脈注射後可以規避肝臟的攝取，在脾臟的聚集增多，具有較明顯的脾靶向性，可以作為將生物活性分子輸送至脾的載體(Pharm Res，1999，16(1)37～41)。其機理是網狀內皮系統(reticulo-endothelial system，RES)如肝脾等的巨噬細胞吞噬納米粒的機致與調理作用(opsonization)有關，血漿或血清中的調理素(opsonin)如IgG、C3b等可以附著於疏水納米粒表面，巨噬細胞表面富有這些物質的受體，可以識別它們，進而將它們連同納米粒一併吞噬。但隱形納米粒表面吸附或共價結合一層或多層親水性衣膜，如poloxamer、poloxamine、PEG等後，使該調理作用弱化，可以大大降低巨噬細胞的吞噬。肝臟Kupffer細胞對隱形納米粒的攝取因此而大大降低，而脾臟的截留卻沒有降低，反而有大幅度的升高。這主要與脾臟獨特的清除顆粒狀異物機制有關。脾臟為解剖學上開放而生理學上閉合的微循環系統，隱形納米粒可以通過網狀內皮的篩網結構與細胞間隙機械地過濾至紅髓，並在那裡被去除親水性外殼，然後被調理與吞噬(Adv Drug DelRev，1995(16)183～193)。脾臟對隱形納米粒的攝取與納米粒的大小、表面特性有密切關係。大鼠靜注poloxamine-908包被的粒徑為220nm聚苯乙烯納米粒幾小時後，大部分「隱形」納米粒被脾臟載留(Biochem Biophys Res Comm，1991，177(2)861～866；Biochim Biophys Acta，1993，1157233～240)。Peracchia等(J ControlRel，1999，60(1)121～128)用PEG化的14C標記的聚氰基丙烯酸酯為材料製備了表面裸露PEG基團的「隱形」納米粒，小鼠尾靜脈注射6小時後脾組織的放射性濃度是肝臟的5倍多，具有明顯的脾靶向性。
疫苗的發展經歷了三個階段第一代減毒、滅活疫苗具有潛在的致病性；第二代亞單位疫苗存在免疫反應不完全性；而被稱為第三代疫苗的DNA疫苗兼具前兩代的優點摒棄了其缺點，雖然只有短短的十年歷史，卻已在感染性疾病和腫瘤的防治中顯示了巨大的應用潛力。但是裸DNA疫苗在體內降解速度極快，且不能定向轉染抗原呈遞細胞，極大地限制了其免疫效能的發揮，目前一般用基因槍介導的皮下和皮內導入以及肌肉注射DNA疫苗導入體細胞。一般認為靜脈注射不適於作DNA疫苗接種，主要是因為血容量相對較大，DNA接觸血液後將很快被稀釋，轉染率低；而且DNA將被血清中的DNA酶降解，生物利用度很低。然而結果表明靜脈注射獲得的免疫保護作用僅次於肌肉注射，原因是抗原提呈細胞對DNA的特異識別及高效提呈能夠彌補轉染效率低的不足，依然能夠提供特異和高效的免疫保護。這表示靜脈注射途徑仍有潛力可挖。脾臟可能在這個過程中發揮了重要作用。如果能克服被稀釋和降解兩方面的缺點，通過靜脈注射，將DNA疫苗靶向定位於脾臟，有可能誘導較強的免疫應答反應。目前尚沒有方便的直接接種脾臟的方法。
發明內容
本發明的目的是克服已有技術的缺陷，提供一種將DNA遞送至脾臟的給藥系統，本系統為含DNA疫苗的「隱形」納米粒，靜注後使之於脾臟聚集，通過內吞將DNA導入脾臟內抗原呈遞細胞。
本發明含有DNA的脾靶向遞送系統，由DNA與一種或多種高分子材料組成納米粒，表面附著親水性高分子材料。
本發明的脾靶向納米給藥系統，所含DNA為質粒DNA，尤其是DNA疫苗。
本發明的納米給藥系統所含DNA按質量比計算，佔納米粒總重的0.01％～10％，優選為0.1～1％。
本發明的納米粒，脾靶向富集作用與粒徑大小有關，該粒徑可用通用的納米粒徑測定儀如雷射粒度儀或掃描電鏡法測定。所說的脾靶向DNA遞送系統的粒徑範圍為50～500nm，優選為100～400nm。
本發明的納米粒表面附著特異性的親水性材料，可以規避肝脾等器官或組織中巨噬細胞的吞噬，通稱為「隱形」納米粒。納米粒表面附著親水性高分子材料可以選自聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧乙烯丙烯共聚物，親水性部分分子量視鏈長而定，一般分子量越大，鏈長越長，脾靶向效果越佳。分子量可以是400～30000，優選為2000～10000。
本發明的脾靶向給藥系統，表面附著親水性高分子材料可通過在製備納米粒時選用特定的起始材料製備。起始材料之一為聚乙二醇與脂溶性高分子的嵌段共聚物，尤其選自聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯。所述聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯採用文獻方法製成，該方法通過氰基乙酸與甲氧基聚乙二醇反應生成聚乙二醇氰基乙酸酯，氰基乙酸與碳鏈為4～37(優選為12～22)的醇反應生成氰基乙酸烷基酯，二種中間體通過碳二亞胺聚合生成聚乙二醇氰基丙烯酸酯。聚乙二醇的鏈長通過選擇不同分子量的甲氧基聚乙二醇起始原料進行調整，一般聚乙二醇的分子量為400～30000，優選為200～10000。聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚乙二醇與烷基的比例對維持「隱形」化與脂溶性十分重要，聚乙二醇比例太多時，高分子材料本身水溶性太強，難以製成納米粒；烷基比例太高時，雖然能提高脂溶性，降低製備時的難度，但同時降低製成的納米粒表面的聚乙二醇密度，使脾靶向性富集能力降低。聚乙二醇與烷基摩爾比常用為2∶1～1∶8，優選為1∶1～1∶5。
本發明的脾靶向給藥系統，表面附著親水性高分子材料的起始材料還可以是聚氧乙烯硬脂酸酯，通稱為賣澤，聚氧乙烯部分的分子量為400～10000，優選為2000～10000。通過納米粒製備時將該起始材料以一定比例混入其他高分子材料如聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯等中製備。
本發明的脾靶向給藥系統，表面附著親水性高分子材料的起始材料還可以是聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，通稱為泊洛沙姆，聚氧乙烯聚氧丙烯部分的分子量為1000～10000，優選為2000～10000。通過納米粒製備時將該起始材料以一定比例混入其他高分子材料如聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯等中製備。
本發明所說的質粒DNA，或DNA疫苗可按現有技術製備，如已知文獻報導和專利所公開的技術方案Norman JA、Montgomery DL及Hartikka J(Norman JA，et al.Vaccine.1997，158801-803；Montgomery DL，et al.DNA and CellBiology.1993，129777-783；Hartikka J，et al.Human Gene Therapy.1996，71205-1217)，專利號PCT WO97/28259，專利號PCT WO98/52581，專利號PCT WO98/06863，或《核酸疫苗》(孫樹漢著)等。
圖1是聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯脾靶向隱形納米粒體內組織分布圖。
圖2是靜脈注射質粒DNA共聚集顯微鏡照片，其中，左圖是2小時結果，右圖是4小時結果。
具體實施例方式
實施例1聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯脾靶向DNA納米粒精稱甲氧基聚乙二醇2000 11g(5.5mmol)與氰基乙酸0.935g(11mmol)，置於容積為250ml的三頸瓶中，加入30ml二氯甲烷，超聲使其溶解。然後在磁力攪拌的條件下，加入2.27g(11mmol)縮合劑碳二亞胺，通入氮氣少許，室溫下連續攪拌6小時。過濾，濾渣用15ml二氯甲烷洗三次，合併濾液，將濾液減壓濃縮至粘稠狀，室溫下固化，即得聚乙二醇氰基乙酸酯。得淺黃色蠟狀固體。
精稱十六醇1.33g(5.5mol)或二十二醇1.85g(5.5mol)與氰基乙酸0.935g(11mmol)，置於容積為250ml的三頸瓶中，加入30ml二氯甲烷，超聲使其溶解。然後在磁力攪拌的的條件下，加入2.27g(11mmol)縮合劑碳二亞胺，通入氮氣少許，室溫下連續攪拌6小時。加入25ml正己烷後，過濾，濾渣用15ml二氯甲烷洗三次，合併濾液，將濾液減壓濃縮至粘稠狀，室溫下固化，即得十六烷基或二十二烷基氰基乙酸酯。得乳白色固體。
精稱上述合成的聚乙二醇氰基乙酸酯及十六烷基氰基乙酸酯，分別以1∶1；1∶2；1∶3；1∶4；1∶5不同的投料比投料，置於容積為250ml的三頸瓶中，加入乙醇與二氯甲烷(1∶1)的混合溶液，超聲分散溶解。注入37％(w/v)甲醛溶液(7.5mmol)及33％(w/v)二甲胺溶液(7.5mmol)，在通氮氣的條件下，室溫下反應8小時。減壓濃縮，濃縮液傾入水中洗滌，再用二氯甲烷進行萃取，分離出有機相，加入無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至粘稠狀，室溫真空下放置固化，即得聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯。
取合成的聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯，溶於10ml四氫呋喃中，將綠色螢光蛋白質粒DNA濃溶液分散於上述四氫呋哺溶液中，在1000轉/分鐘機械攪拌的條件下，注入50ml超純水中，室溫下攪拌2h，即得納米粒懸液，按納米粒與凍幹保護劑甘露醇1∶5的比例以現有通用技術冷凍乾燥，得納米粒冷凍乾燥製劑。以市售PicoGreen試劑盒，測定所包載DNA的含量，載藥量介於0.1～1％。
實施例2聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯脾靶向DNA納米粒聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯的合成同實施例1中聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯。主要區別在於以二十二醇代替十六醇。
納米粒的製備同實施例1中方法，以聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯代替聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯。
實施例3隱形固體脂質納米粒脾靶向DNA遞送系統高溫蒸發-低溫固化法取0.1g硬酯酸，超聲微熱溶於5mL丙酮，將綠色螢光蛋白質粒DNA濃溶液分散於該丙酮溶液中，構成有機相；另取0.1g麥澤59溶於30mL水中構成水相；有機相以6#針頭注入1000r/min攪拌的(75±2)℃，攪拌3h，有機相完全蒸發，所得約20mL溶液迅速倒入另一1000rpm攪拌的30mL水相(冰水浴)中，攪拌1h，得硬脂酸納米粒膠體混懸液。經通用方法冷凍乾燥得隱形固體脂質納米粒。
實施例4B肝DNA疫苗脾靶向聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯納米粒遞送系統按實施例1的方法。以已知的B肝DNA疫苗替代綠色螢光蛋白質粒DNA，以相同方法製成脾靶向B肝DNA疫苗納米粒遞送系統。
實施例5B肝DNA疫苗脾靶向聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯納米粒遞送系統按實施例2的方法。以已知B肝DNA疫苗替代綠色螢光蛋白質粒DNA，以相同方法製成脾靶向B肝DNA疫苗納米粒遞送系統。
實施例6B肝DNA疫苗脾靶向固體脂質納米粒遞送系統按實施例3的方法。以已知B肝DNA疫苗替代綠色螢光蛋白質粒DNA，以相同方法製成脾靶向B肝DNA疫苗納米粒遞送系統。
實施例7脾靶向隱形納米粒脾臟富集測定為驗證脾靶向隱形納米粒在脾臟的富集作用，以3-14C標記的氰基乙酸為起始原料按實施例1中的操作步驟合成具有放射性的高分子材料，並製成放射標記的脾靶向納米粒，小鼠尾靜脈注射後，用液閃法測定心、肝、脾、肺、腎等組織中放射性，以判斷脾靶向納米粒的脾臟富集作用。結果表明，脾靶向納米粒在脾臟的攝取顯著高於在其它組織中。
實施例8脾靶向DNA隱形納米粒在體內的表達將脾靶向綠色螢光蛋白質粒DNA納米粒小鼠尾靜脈注射，處死小鼠後即取脾臟乙醇固定，病理切片，於共聚焦顯微鏡下觀察，結果表明，在注射2小時後，綠色螢光蛋白在脾臟中大量表達。
權利要求
1.一種脾靶向DNA遞送系統，含有DNA，其特徵在於所述的遞送系統由DNA與一種或多種高分子材料組成納米粒，其表面附著親水性高分子材料。
2.按權利要求1所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的遞送系統其中所含DNA為納米粒總重的0.01％～10％。
3.按權利要求1或2所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的遞送系統其中所含DNA為納米粒總重的0.1～1％。
4.按權利要求1所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的納米粒粒徑為50～500nm。
5.按權利要求1或4所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的納米粒粒徑為100～400nm。
6.按權利要求1所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的納米粒表面附著親水性高分子材料選自聚乙二醇、聚氧乙烯或聚氧乙烯丙烯共聚物，分子量為400～30000。
7.按權利要求6所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的納米粒表面附著親水性高分子材料分子量為2000～10000。
8.按權利要求1所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的DNA為質粒DNA。
9.按權利要求1所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的脾靶向給藥系統其表面附著親水性高分子材料的起始材料為聚乙二醇與脂溶性高分子的嵌段共聚物。
10.按權利要求9所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的脾靶向給藥系統其表面附著親水性高分子材料的起始材料為聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯。
11.按權利要求10所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯其中聚乙二醇的分子量為400～30000。
12.按權利要求10所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯其中聚乙二醇的分子量為200～10000。
13.按權利要求10所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚氰基丙烯酸烷基酸中烷基碳鏈為4～37。
14.按權利要求10所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚氰基丙烯酸烷基酸中烷基碳鏈為12～22。
15.按權利要求10所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚乙二醇與烷基摩爾比為2∶1～1∶8。
16.按權利要求10所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚乙二醇與烷基摩爾比為1∶1～1∶5。
17.按權利要求9所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的表面附著親水性高分子材料的起始材料還可以是聚氧乙烯硬脂酸酯，其中聚氧乙烯部分的分子量為400～10000。
18.按權利要求9所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的表面附著親水性高分子材料的起始材料聚氧乙烯硬脂酸酯，其中聚氧乙烯部分的分子量為2000～10000。
19.按權利要求9所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的表面附著親水性高分子材料的起始材料還可以是聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，其中親水部分分子量為1000～10000。
20.按權利要求9所述的脾靶向DNA遞送系統，其特徵在於所述的表面附著親水性高分子材料的起始材料聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，其中親水部分分子量為2000～10000。
全文摘要
本發明涉及納米藥物製劑領域，具體提供一種脾靶向DNA遞送系統，為一種可靜脈注射遞送質粒DNA，在脾臟富集的納米粒給藥系統。本遞送系統由DNA與一種或多種高分子材料組成的納米粒，納米粒表面附著特異性的親水性材料，可以規避肝脾等器官或組織中巨噬細胞的吞噬，其中含DNA為納米粒總重的0.01％～10％，納米粒粒徑為50～500nm，可通過靜脈注射，將DNA疫苗靶向定位於脾臟，可誘導較強的免疫應答反應。動物實驗表明，脾靶向納米粒在脾臟的攝取顯著高於在其它組織中，脾靶向DNA隱形納米粒在脾臟中大量表達。
文檔編號A61K48/00GK1679965SQ20051002313
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月5日 優先權日2005年1月5日
發明者吳偉, 黃敏, 魏秀莉, 汪楊 申請人:復旦大學