轉基因油菜ms1品系pcr-dhplc檢測引物及檢測方法
2023-09-19 22:38:45 2
專利名稱：轉基因油菜ms1品系pcr-dhplc檢測引物及檢測方法
技術領域：
本申請涉及轉基因產品的檢測，特別是涉及一種轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測弓I物及檢測方法。
背景技術：
目前對轉基因油菜的檢測方法主要採用常規PCR，實時螢光PCR、PCR_基因晶片等檢測方法。傳統的常規PCR檢測方法在平臺擴展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優化，並且兼顧擴增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常採用的凝膠電泳分析擴增產物的方法，區分效率不高，檢測結果不理想。實時螢光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規PCR檢測方法有優勢，但是由於目前儀器自身及螢光染料研製的限制，僅能同時提供互不幹擾的4個螢光通道，也限制了該技術在檢測通量擴展 ，並且檢測成本高。常規的多套PCR-基因晶片檢測方法，需要多套引物進行擴增，操作步驟繁瑣，並不適合大規模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有解析度好、擴展性強、靈敏度高等優點。該方法在50°C條件分析樣品，樣品峰的洗脫只由鹼基對的數量決定，樣品的鹼基對數量不同洗脫順序也不同，從而產生不同的樣品峰。具體的，當過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會根據分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與DNA marker比較確定分子量大小，從而判定樣品中是否含有目標檢測基因。PCR-DHPLC，是將PCR與DHPLC相結合的技術，即先採用PCR擴增出靶標序列，然後再對擴增產物進行DHPLC分析，從而提高檢測的靈敏度和特異性。目前，尚沒有轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC的檢測方法。
發明內容
本申請的目的是提供一種新的用於轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測的引物，基於該引物的轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測方法。為實現上述目的，本申請採用了以下技術方案:本申請公開了一種用於轉基因油菜MSI品系的PCR-DHPLC檢測的引物，該引物的上遊引物含有Seq ID N0.1所示序列，下遊引物含有Seq ID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5，-GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3，Seq ID N0.2:5，-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3，。需要說明的是，本申請的引物是針對轉基因油菜MSl品系而設計的特異性引物，能夠對轉基因油菜MSl品系進行特異性擴增，因此，可以理解，該引物除了用於本申請的PCR-DHPLC檢測以外，同樣適用於常規的PCR檢測，以及其它的基於PCR擴增的檢測，如實時螢光PCR、基因晶片等等。本申請的另一面還公開了一種轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測方法，該檢測方法包括採用本申請設計的引物，以待檢測樣品的DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增的產物進行變性高效液相色譜分析。需要說明的是，本申請設計的引物是針對轉基因油菜MSl品系的特異性引物，因此，可以理解，如果待檢測樣品中含有足量的轉基因油菜MSl品系成分，即可擴增出相應的靶標片段，並在DHPLC分析時產生相應的洗脫峰。進一步的,本申請的檢測方法還包括以DNA marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與DNA marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對。優選的本申請的檢測方法包括如下步驟:(A)採用本申請的引物，以待檢測樣品的DNA為模板，進行PCR擴增；(B)以步驟(A)的PCR擴增產物為樣品進行DHPLC分析，同時以DNAmarker為參考標準進行DHPLC分析；(C)將步驟(B)中PCR擴增產物的DHPLC分析結果與DNA marker的DHPLC分析結果進行比較，確定PCR擴增產物的分子量大小，從而判斷是否含有檢測的靶標序列。需要說明的是，理論上，本申請的引物是根據轉基因油菜MSl品系設計的特異性引物，能夠對待檢測樣品中的轉基因油菜MSl品系成分擴增出約307bp的片段，因此，能夠通過DHPLC分析出307bp的洗脫峰；而對其它成分不會有擴增，即不會有其它洗脫峰出現。本申請中，判斷是否含有轉基因油菜MSl品系的靶標序列的依據即，是否有307bp的洗脫峰。由於採用以上技術方案，本申請的有益效果在於:本申請的轉基因油菜 MSl品系檢測引物具有較強的特異性，能夠用於後續的多重PCR擴增以及DHPLC分析。本申請針對傳統的電泳分析PCR擴增結果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結合，提供了一種操作簡便、擴展性能好、解析度高的轉基因油菜MSl品系檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，對不同大小的PCR產物片段區分率可達數個鹼基，甚至能夠區分出I個鹼基大小差異的片段。本申請的引物和檢測方法為轉基因油菜MSI品系的檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用於口岸檢驗檢疫等部門使用。
圖1:是本申請實施例中PCR擴增產物的DHPLC分析的部分結果圖；圖2:是本申請實施例中PCR擴增產物的DHPLC分析的部分結果圖；圖3:是本申請實施例中PCR擴增產物的DHPLC分析的部分結果圖；圖4:是本申請實施例中PCR擴增產物的DHPLC分析的部分結果圖；圖1中自上而下的曲線分別代表al為轉基因油菜品系MS1、bl為DNAmarker、Cl水對照、dl為轉基因油菜品系RF1、el為轉基因油菜品系RF2、fl為轉基因油菜品系RF3、gl為轉基因油菜品系RT73、hl為轉基因油菜品系MS8，圖2中自上而下的曲線分別代表a2為轉基因油菜品系T45、b2為轉基因油菜品系Topasl9/2、C2為非轉基因油菜、d2為轉基因玉米品系3272、e2為轉基因玉米品系59122、f2為轉基因玉米品系Btll、g2為轉基因玉米品系Btl76、h2為轉基因玉米品系GA21、i2為轉基因玉米品系MIR604、J2為轉基因玉米品系M0N810、k2為轉基因玉米品系M0N863，圖3中自上而下的曲線分別代表a3為轉基因玉米品系M0N88017、b3為轉基因玉米品系M0N89034、c3為轉基因玉米品系NK603、d3為轉基因玉米品系TC1507、e3為轉基因玉米品系T25、f3為非轉基因玉米、g3為非轉基因玉米、h3為轉基因大豆品系A2704-12、 3為轉基因大豆品系A5547-127、J3為轉基因大豆品系GTS40-3-2、k3為轉基因大豆品系M0N89788，圖4中自上而下的曲線分別代表a4為非轉基因大豆、b4為大豆盲樣、c4為轉基因棉花品系GHB614、d4為轉基因棉花品系LLCotton25、e4為非轉基因棉花、f4為轉基因水稻品系LL Rice62、g4為非轉基因水稻、h4為轉基因馬鈴薯品系EH92-527-1、 4為木瓜。marker的各峰值從左至右依次為80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具體實施方式
本申請提供了用於轉基因油菜MS I品系的PCR-DHPLC檢測的引物，該引物針對轉基因油菜MSl品系的特異序列進行設計，能夠用於轉基因油菜MSl品系的特異性擴增檢測。在此基礎上本申請還提供了基於本申請的引物的轉基因油菜MSI品系的PCR-DHPLC檢測方法。
需要說明的是，本申請的引物是針對轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測而設計的，但是，可以理解，該引物本身也是作為PCR擴增使用的，因此，同樣可以用於常規的PCR擴增、實時螢光PCR擴增、與基因晶片結合的PCR擴增等。
下面通過具體實驗例並結合附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實驗例僅僅對本申請進行進一步的說明，不應理解為對本申請的限制。
實施例1DNA提取
(I)DNA提取:參照植物基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN, Cat.N0.69104)所提供的方法稍作改進提取DNA，具體操作步驟如下:
①65°C 預熱的 APl 溶液和 Buffer AE ；
②液氮研磨樣品至粉末狀後，取適量樣品入1.5mL的離心管中；
③向離心管中加入400 μ L預熱的APl溶液和4 μ L100mg/mL的RNA酶，充分混勻後，65°C水浴10min-15min，期間振蕩混勻2-3次；
④水浴完成後，直接加入130 μ L ΑΡ2溶液，充分振蕩混勻後冰浴5min冰浴時不可震蕩，然後14000r/min離心5min ；
⑤吸取上清加入到QIA shredder Mini spin column柱子中，即試劑盒中的紫色柱子，14000rpm/min離心2min,記錄吸取的上清液的體積數；
⑥棄上面的柱子，向過濾後的溶液中加入1.5倍體積的Buffer AP3/E溶液，用移液槍輕輕混勻；
⑦每次取650 μ L步驟⑥的混勻的溶液轉移到DNeasy Mini spin column柱子內，即試劑盒中白色的柱子，14000rpm/min離心Imin,棄濾液,直至步驟⑥的混勻的溶液完全過濾完；需要說明的是，進行過濾時DNeasy Mini spin column柱所能容納的體積約為650 μ L，而步驟⑥的溶液一般都是大於650 μ L的，因此，每次只能取650 μ L溶液，過濾、棄濾液後才能再加入剩餘的溶液；
⑧棄下面的收集管，將spin column柱放入一個新的2mL收集管中，加入500 μ LBuffer Aff溶液，14000rpm/min 離心Imin洗脫雜質，重複洗脫雜質的操作一次，棄濾液，12000rpm/min 空管離心 lmin ；⑨棄下面的收集管，換一新的1.5mL離心管，加入100 μ L預熱後的Buffer AE溶解DNA，室溫靜置5min沉澱DNA，12000rpm/min離心lmin，收集的溶液即DNA溶液；需要說明的是100 μ L預熱後的Buffer AE可以分兩次或多次加入；⑩棄上面的柱子，_20°C保存DNA溶液。(2)DNA純化:當DNA中含蛋白質等雜質的量較高時，其純度不能滿足實驗要求，需要對其進行純化，具體純化步驟如下:①將提取的DNA溶液稀釋到500 μ L-700 μ L後，加入等體積的酚和氯仿，充分混勻；②14000rpm/min 離心 IOmin,取上清液；③在上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，-20°C靜置30min以上；④在4°C條件下14000rpm/min離心lOmin，棄上清；⑤向步驟④中棄上清液的沉澱中加入lmL4°C預冷的70%的乙醇，14000rpm/min離心lOmin，棄上清，重複操作一次；⑥將經過步驟⑤的乙醇洗滌的沉澱在無菌條件下風乾，加適量AE Buffer溶解DNA，即獲得純度較高的DNA溶液。需要說明的是，AE Buffer的加入量根據具體實驗要求而定，如果希望獲得DNA溶液的濃度較高，則可以加入較少量的AE Buffer,如10 μ L-50 μ L，也可以直接再加入IOOyL Buffer AE，則DNA濃度與純化前相當，或者加入更多量的BufferAE以獲得較低濃度的DNA溶液。實施例2DNA濃度測定對提取的樣品DNA進行濃度和純度測定；採用紫外分光光度計測定260nm和280nm處吸收值，分別計算核酸的純度和濃度，計算公式如下:DNA 純度=0D260/0D280DNA 濃度=5O X 0D260mg/mLDNA的純度比值在1.7 L 9之間，濃度大於IOng/μ L。實施例3PCR擴增根據轉基因油菜MSI品系的DNA序列設計引物(表I )，並提取以下樣品的DNA進行特異性檢測:轉基因油菜品系MS1、轉基因油菜品系RF1、轉基因油菜品系RF2、轉基因油菜品系RF3、轉基因油菜品系RT73、轉基因油菜品系MS8、轉基因油菜品系T45、轉基因油菜品系Topasl9/2、非轉基因油菜、轉基因玉米品系3272、轉基因玉米品系59122、轉基因玉米品系Btll、轉基因玉米品系Btl76、轉基因玉米品系GA21、轉基因玉米品系MIR604、轉基因玉米品系M0N810、轉基因玉米品系M0N863、轉基因玉米品系M0N88017、轉基因玉米品系M0N89034、轉基因玉米品系NK603、轉基因玉米品系TC1507、轉基因玉米品系T25、非轉基因玉米、非轉基因玉米、轉基因大豆品系A2704-12、轉基因大豆品系A5547-127、轉基因大豆品系GTS40-3-2、 轉基因大豆品系M0N89788、非轉基因大豆、大豆盲樣、轉基因棉花品系GHB614、轉基因棉花品系LLCotton25、非轉基因棉花、轉基因水稻品系LL Rice62、非轉基因水稻、轉基因馬鈴薯品系EH92-527-1、木瓜。表I轉基因油菜MSl品系的檢測引物
權利要求
1.一種用於轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測的引物，其特徵在於:所述引物包括上遊引物和下遊引物，所述上遊引物含有Seq ID N0.1所示序列，所述下遊引物含有SeqID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5』 -GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3』Seq ID N0.2:5，-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3，。
2.—種轉基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測方法，其特徵在於:所述檢測方法包括採用權利要求1中的引物，以待檢測樣品的DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增的產物進行變性高效液相色譜分析。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於:所述檢測方法還包括以DNAmarker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與DNA marker的變性高效液 相色譜分析結果進行比對。
全文摘要
本申請公開了一種轉基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法，該引物具有較強的特異性，能夠用於PCR，並特異性的擴增出轉基因油菜MS1品系的DNA片段，並且其擴增產物能夠適合於後續的DHPLC分析。該檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、特異性強的轉基因油菜MS1品系的檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個鹼基，解析度高。本申請的引物和檢測方法為轉基因油菜MS1品系的檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用於口岸檢驗檢疫等部門使用。
文檔編號G01N30/02GK103173551SQ20131007939
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月13日 優先權日2013年3月13日
發明者向才玉, 章桂明, 潘廣, 凌杏園 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心