含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因bki1的植物表達載體的構建的製作方法
2023-09-19 22:36:05
含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因bki1的植物表達載體的構建的製作方法
【專利摘要】本發明涉及含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKI1的植物表達載體的構建。所構建的植物表達載體pOX-BKI1是由蘋果BKI1基因插入植物表達載體pRI101AN質粒進行重組反應得到。將該植物表達載體用於植物遺傳轉化，BKI1基因在CaMV35S啟動子的啟動下過量表達，阻斷了油菜素甾醇的信號轉導途徑，對植物生長發育產生負調控作用，抑制了植物莖及主幹的伸長，起矮化植株的作用。
【專利說明】含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKM的植
物表達載體的構建
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學和生物【技術領域】，涉及蘋果油菜素留醇信號轉導途徑負調控基因BKIl及其植物表達載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]油菜素甾醇(Brassinosteroids, BRs)是一種廣泛存在於植物中的類固醇激素,在植物的生長發育過程中起重要作用。調控了植物生長發育的各個過程，包括細胞的伸長、細胞的分裂、衰老、維管束的分化、雄性育性和光形態建成，以及對生物和非生物脅迫的抗性
坐寸o
[0003]油菜素甾醇信號轉導途徑由多基因參與，其中，細胞膜上的BKIl蛋白是該信號途徑的一個負調控因子，BKIl作為BRIl的底物，當細胞中甾類分子濃度低時，BKIl於質膜上和BRIl的同源二聚體相互作用，抑制BRII與BAKl的相互作用，對BR信號轉導途徑起到抑制作用。當甾類分子與BRIl 的胞外域結合時，誘導BRIl的磷酸化，BKIl與BRIl分離，從而激活BR信號傳遞途徑，這與BR生物合成的反饋抑制相一致。過量表達BKII基因的轉基因擬南芥植株表現為株型矮化(Wang et al.，2006)。
[0004]蘋果是世界性果樹，其產量名列果品的前三名。我國是蘋果生產大國，栽培面積約2000萬畝，產量超過2985萬噸，面積和產量均居世界第一位。隨著蘋果產業的逐年擴大和集約化生產的需要，培養矮化新品種是目前蘋果產業的育種目標之一。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種新的蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl(BRII kinase inhibitorl)。
[0006]本發明的另一目的是提供含有該蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體及其構建方法。
[0007]本發明的技術問題可通過如下技術方案解決:
[0008]蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKI1，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的克隆方法如下:以蘋果幼嫩葉片為材料，利用CTAB法提取總RNA，反轉錄合成cDNA，設計特定引物擴增蘋果油菜素留醇信號轉導途徑負調控基因BKIl:
[0010]上遊引物:5』 -ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3 』
[0011]下遊引物:5』 -TCAAATCTCATGACTGACCA-3 』
[0012]以反轉錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式PCR反應，產物連接到pGM_T載體，轉化T0P10感受態細胞，進行 序列測定，得到序列如SEQ ID N0.1所示的蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKII。
[0013]上述的蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKI1，所述的蘋果為「寒富」蘋果。
[0014]含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體的構建，方法如下:
[0015]I)提取蘋果葉片中的總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA ；
[0016]2)以cDNA為模板，通過設計的特定引物，PCR擴增得到上遊和下遊分別引入Nde I和EcoR I酶切位點的BKIl基因；
[0017]其中，所述的特定引物是:
[0018]上遊引物P1: 5 』 -CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3 』 ；
[0019]下遊引物P2:5 』 -GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3 』 ； [0020]3)將帶有酶切位點的BKIl基因，連接到克隆載體pGM-T上，轉化T0P10感受態細胞，提取陽性質粒PGM-BKIl ；
[0021]4)限制性內切酶Nde I和EcoR I分別對提取的陽性質粒pGM_BKIl和表達載體pRI IOlAN進行雙酶切，將得到的BKII基因片段插入到表達載體pRI IOlAN中，構建含有蘋果油菜素留醇途徑號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體pOX-BKIl。
[0022]本發明的有益效果:
[0023]1.本發明構建的含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體，為首次報導，可直接用於農桿菌介導的遺傳轉化，獲得BKIl超表達新種質。
[0024]2.本發明提供的蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl是一個新的蘋果油菜素甾醇負調控因子BKIl編碼基因，該基因為油菜素甾醇信號轉導途徑的重要成員之一。通過實驗，將蘋果BKII基因轉入菸草中，使其在菸草中表達，至轉基因菸草植株開花後調查其株高，發現轉基因菸草植株主幹的伸長與對照相比，顯著受到了抑制；同樣，將蘋果BKIl基因轉入『寒富』蘋果，使其在蘋果中超量表達，在大田培養4個月的轉基因蘋果與對照相比，表現顯著的矮化趨勢。說明超量表達蘋果BKIl基因起到了矮化植株的功能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為植物表達載體pOX-BKIl構建方法示意圖。
[0026]圖2為實施例1製備的蘋果BKIl基因的PCR擴增電泳圖；
[0027]其中，M:1OObp Marker ；1, 2 =BKIl 基因；3:清水對照；。
[0028]圖3a為引入Nde I和EcoR I酶切位點的BKII基因的PCR擴增電泳圖；
[0029]M: IOObp Ladder DNA marker ；1:BKI1 基因。
[0030]圖3b為pGM-BKIl質粒經Nde I和EcoR I雙酶切後的電泳檢測圖；
[0031]M:1OObp Ladder DNA marker ；2:從 pGM-BKIl 質粒上酶切下來的 BKIl 基因。
[0032]圖3c為pOX-BKIl表達載體質粒經Nde I和EcoR I雙酶切後的電泳檢測圖；
[0033]M:IOObp Ladder DNA 11^^61';3:從口0)(-131(11表達載體質粒上酶切下來的131(11基因。
[0034]圖4為轉基因菸草植株BKIl基因表達檢測的RT-PCR擴增電泳圖；
[0035]M:IOObp Marker; 1:對照植株；2:轉基因植株。
【具體實施方式】[0036]實施例1:蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl編碼區序列的克隆
[0037]植物材料為「寒富」蘋果。
[0038]1.總RNA的提取及反轉錄成cDNA
[0039](I)取自然條件下正常生長的幼嫩葉片(0.05~0.lg)，在液氮中研碎，迅速移入
1.5ml離心管中；
[0040](2)加入600 u L預熱的2%CTAB提取緩衝液(預熱前加入0.4%P_巰基乙醇；40URNA酶抑制劑)，65°C保溫20~30min，期間顛倒幾次；
[0041](3)加入600 V- L氯仿/異戍醇(24:1),輕輕顛倒若干次，10000r/min離心IOmin ；
[0042](4)把上清液(約500ii L)移入新的1.5ml離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒若干次，10000r/min離心IOmin ；
[0043](5)取上清液(約400 iiL)移入新的1.5mL離心管，加入1/4體積的IOM LiCL，顛倒混勻，—20°C放置 lh, 10000r/min 離心 IOmin ；
[0044](6)棄上清，加入400 ii L DEPC水溶解沉澱，14000r/min離心lOmin。棄沉澱，用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；
[0045](7)加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)，混勻後再加入2.5倍體積的冰冷的無水乙醇(_20°C ),顛倒混勻，-20°C放置 30min, 10000r/min 離心 IOmin ；
[0046](8)棄上清，加入IOOii L DEPC水，待沉澱溶解後，加入4 ii L RNase-free DNase I(5U.u L-1), BufferlOu L, IuL RNa`sin (40U ? y L—1)，輕輕混勻後在 37°C 水浴 4h ;
[0047](9)加入等體積的氯仿/異戍醇，輕輕顛倒若干次，10000r/min離心IOmin ；
[0048](10)取上清液(70 u L)加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2),2.5倍體積冰冷的無水乙醇，顛倒幾次，混勻後—70°C放置lh, 10000r/min離心IOmin ；
[0049](11)棄上清，用70%乙醇洗滌RNA沉澱2次，在超淨工作檯上風乾RNA，加入30 ii LDEPC水溶解沉澱；
[0050](12)利用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將 RNA 反轉錄為 cDNA。
[0051]2.利用Primer Primer5.0軟體分析設計引物擴增BKIl
[0052]上遊引物:5』 -ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3 』
[0053]下遊引物:5』 -TCAAATCTCATGACTGACCA-3 』
[0054]以提取的葉片cDNA為模板，進行PCR反應；
[0055]PCR 反應體系為:取 I ii L cDNA加入 Taq DNA聚合酶 0.2 U L, IOXPCR Buffer2 U L,dNTPs (2.5mmol ? L—1) 1.6uL,正反向引物各I U L，最後用水補足到20 y L ;
[0056]PCR 反應程序-MV 3min ；94°C 30s,60°C lmin，72°C lmin，35 個循環；72°C延伸IOmin ；
[0057]PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖如圖2所示，從圖2可見一條1206bp的目的條帶。
[0058]使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，回收後取I y L回收產物與PGM-T載體進行連接，操作步驟按天跟公司產品pGM-T試劑盒說明書進行。然後轉化大腸桿菌TOPlO感受態細胞，在表面塗有24 ii g -mr1異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和40 u g 溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-gal)的含 Amp(60ii gLB 培養基平板上，37°C培養12~16h。挑取單個白色克隆，分別塗布於新的含有Amp(60ii g -m^1)的LB培養基平板上(二轉)，37°C培養12~16h，將菌株穿刺培養後，送上海生工公司測序，得到如SEQ ID N0:1所示的「寒富」蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKI1。
[0059]實施例2:植物表達載體pOX-BKI I的構建
[0060]植物材料為「寒富」蘋果。
[0061]1.總RNA的提取及反轉錄成cDNA
[0062]方法同實施例1的步驟I。
[0063]2.PCR擴增引入Nde I和EcoR I酶切位點
[0064]上遊引物P1: 5 』 -CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3，
[0065]下遊引物P2:5 』 -GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3 』
[0066]以提取的葉片cDNA為模板，通過引物Pl和P2，進行PCR擴增反應，在目的基因BKIl的上遊和下遊分別引入Nde I和EcoR I酶切位點，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物。
[0067]回收後，取Iy L回收的PCR產物與pGM-T載體進行連接，操作步驟按天根公司產品pGM-T試劑盒說明書進行，然後轉化TOPlO感受態細胞，提取陽性質粒pGM-BKIl。
[0068]PCR 反應體系:取 I U L cDNA 加入 Taq DNA 聚合酶 0.2 ii L，10 X PCR Buffer2 U L,dNTPs (2.5mmol ? L—1) 1.6uL,正反向引物各I U L，最後用水補足到20 y L ;
[0069]PCR 反應程序:94°C 3min ；94°C 30s,60°C lmin，72°C lmin，35 個循環；72°C 延伸IOmin0
[0070]PCR產物瓊脂糖凝膠電泳如圖3a所示，從圖3a可見一條1219bp的譜帶，回收，測序，測得序列比原BKIl基因1206bp (SEQ ID NO:1序列)，5』端增加CGCAT，3，端增加GGGAATTC，共增加13bp，說明在蘋果BKIl基因序列上遊和下遊分別引入Nde I和EcoR I酶切位點的。
[0071]3.植物表達載體pOX-BKIl的構建
[0072]取載體pRI101AN(TaKaRa，Japan)和帶有酶切位點的陽性質粒pGM-BKIl，用Nde I和 EcoR I 雙酶切，雙酶切體系(40ii L):10XT buffer4 u L, pGM-BKIl/pRI101AN34 u L,Nde I和EcoR I各I ii L ;37°C酶切過夜；取質粒pGM-BKIl雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析如圖3b所示，從圖3b可見兩條譜，其中一條較小片段大小為1208bp，比原BKIl基因1206bp (SEQ ID勵:1序列)5』端增加！'，3』端增加6，共增加26?，說明雙酶切反應成功，證明含有Nde I和EcoR I酶切位點質粒pGM-BKIl構建成功。
[0073]用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收pRIlOlAN較大片段和pGM_BKIl較小片段。用T4DNA連接酶(NEB)連接兩個回收產物，連接反應體系(10 y L): 10 X Ligase Bufferl u L,pRIlOlAN 大片段 liiL，pGM-BKIl 小片段 7.5 y L，T4DNA 連接酶 0.5 y L。16°C反應過夜，將BKIl基因片段插入pRIIOlAN中，得到重組質粒植物表達載體pOX-BKIl。
[0074]取IOii L重組質粒植物表達載體pOX-BKIl轉化T0P10感受態細胞。37°C培養12~16h，挑取陽性單克隆擴大培養，提取質粒進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳如圖3c所示，從圖3c可見，兩條譜帶，其中一條較小片段大小為1208bp，說明雙酶切反應成功，初步證明蘋果BKIl基因表達載體構建成功。
[0075]將1208bp的酶切片段回收，回收產物與pGM-T載體進行連接，挑取陽性克隆，提取質粒，送上海生工測序， 測得含有序列SEQ ID NO:1所示的蘋果油菜素留醇信號轉導途徑負調控BKII基因，所以近一步證明蘋果BKIl基因表達載體構建成功。
[0076]實施例3:植物表達載體pOX-BKIl遺傳轉化菸草及其基因功能初步鑑定
[0077]1.農桿菌菌株EHA105感受態製備及凍融法轉化[0078]將凍存的農桿菌EHA105菌液在含有50mg七1利福平(Rif)的YEP (pH=7.0)固體培養基上劃線培養，28°C倒置培養48h，出現菌斑一挑取農桿菌EHA105單菌落接種於含有50mg ?r'Rif的YEP (pH=7.0)液體培養基中，28°C，200rpm/min振蕩培養過夜(約16h)—取上述菌液按1:50比例接種於50mL含有50mg -L^1Rif的YEP (pH=7.0)液體培養基中，28°C，150rpm/min振蕩培養至OD6tltl為0.5左右一取1.5mL搖好的菌液，冰上冷卻IOmin — 4°C,5000rpm/min離心5min,棄上清液液,收集菌體一加入等體積冰預冷的25mM CaCl2溶液重懸沉澱，冰上放置20min — 4°C, 5000rpm/min離心5min,棄上清液一每管加入50 y L預冷的25mM CaCl2溶液重懸沉澱，冰上放置20min後使用。剩餘的感受態細胞在液氮中速凍後於_80°C超低溫冰箱中保存。
[0079]2.將pOX-BKIl質粒DNA迅速加入製備好的50iiL農桿菌感受態細胞中(約IOii L)，輕混，冰浴5min後於液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，然後加入800 u L YEP (pH=7.0)液體培養基，28°C，160rpm/min震蕩培養，4_6h後離心後剩約100 y L菌液塗布於含50mg.L-1Rif和50mg.L-1Kan的YEP (pH=7.0)固體培養基中，28°C倒置培養48h，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用於菸草葉片轉化。
[0080]3.挑取已活化的含pOX-BKIl質粒的EHA105農桿菌單菌落。在添加了 50mg.L4Kan和IOOmg ? L4Rif的YEP液體培養基中，28°C條件下200rpm/min振蕩培養，直至OD6tltl值達到0.8。然後將ImL的菌液移入到新的YEP液體培養基中，繼續28°C 200rpm/min振蕩培養，直至OD6tltl為0.5。然後在25°C條件下，5000rpm/min離心5min收集菌體後，用等量MS液體
培養基重懸備用。
[0081]4.將在三角瓶內繼代生長30天的組織培養苗的葉片剪成0.5cmX0.5cm的大小，置於步驟2中重懸好的菌液中，輕輕搖晃IOmin後取出，用無菌的幹濾紙吸乾葉塊上多餘的農桿菌菌液，然後置於再生培養基上。在黑暗條件下培養2-5d後，將菸草『NC89』葉塊轉移到加入250mg ^r1Cef和IOOmg ^r1Kan的再生培養基中進行抗性芽篩選。在抗性芽再生出後，將抗性芽轉移到新的附加250mg -T1CefUOOmg-T1Kan的增殖培養基中進行增殖培養，至得到純合轉化植株。
[0082]5.PCR鑑定及基因功能初步鑑定:
[0083]待抗性苗長至7~8片葉，提取菸草『NC89』轉基因植株幼嫩葉片RNA，進行RT-PCR檢測目的基因是否轉入
[0084]上遊引物:5』 -ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3，，
[0085]下遊引物:5』 -TCAAATCTCATGACTGACCA-3 』，
[0086]結果如圖4所示，從圖4可見，轉基因植株出現了 1206bp片段，而對照植株沒有，說明蘋果BKIl基因成功導入菸草中。
[0087]6.對轉基因菸草表型觀察
[0088]非轉基因的菸草『NC89』組織培養植株(4株)設為空白對照組，轉入含有蘋果BKIl的植物表達載體pOX-BKIl的菸草『NC89』組織培養植株(10株)設為試驗組，將兩組組織培養植株同時移栽致大田，在相同栽培條件下，培養3個月，待全部植株開花後,分別測量各組菸草的株高。空白對照組平均株高為71.5cm，試驗組平均株高為48.2cm。可見，轉入蘋果BKIl基因的菸草株高有所減少，表現為矮生的現象，說明BKIl基因的表達影響了菸草的發育，即表達蘋果BKII基因的菸草植株表現矮化，進一步說明蘋果BKIl基因負調控菸草株
高表型。
[0089]實施例4:植物表達載體pOX-BKI I遺傳轉化蘋果表型觀察
[0090]參照實施例3的方法，將植物表達載體pOX-BKIl轉入『寒富』蘋果，將非轉基因的『寒富』蘋果組織培養植株(5株)設為空白對照組，轉入含有蘋果BKIl的植物表達載體POX-BKIl的『寒富』蘋果組織培養植株(12株)設為試驗組，將兩組組織培養植株同時移栽致大田，在相同栽培條件下，培養4個月，分別測量各組蘋果的株高。空白對照組平均株高為36.7cm，試驗組平均株高為18.9cm。可見，轉入蘋果BKIl基因的蘋果株高有所減少，表現為矮生的現象，說明BKIl基因的超量表達影響了蘋果的發育，即超量表達蘋果BKIl基因的蘋果植株表現矮化，進一步說明蘋果`BKIl基因負調控蘋果株高表型。
【權利要求】
1.含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體的構建，其特徵在於方法如下: 1)提取蘋果葉片中的總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA； 2)以cDNA為模板，通過設計的特定引物，PCR擴增得到上遊和下遊分別引入NdeI和EcoR I酶切位點的BKIl基因； 其中，所述的特定引物是:
上遊引物 P1: 5 』 -CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3，；
下遊引物 P2:5』 -GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3?； 3)將帶有酶切位點的BKII基因，連接到克隆載體pGM-T上，轉化TOPlO感受態細胞，提取陽性質粒pGM-BKIl ； 4)限制性內切酶NdeI和EcoR I分別對陽性質粒pGM_BKIl和表達載體pRIlOlAN進行雙酶切，將得到的BKIl基因片段插入到表達載體pRIlOlAN中，構建含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體pOX-BKIl。
2.如權利要求1所述的含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體的構建，其特徵在於:所述的蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求1或2所述的含有蘋果油菜素甾醇信號轉導途徑負調控基因BKIl的植物表達載體的構建，其特徵在於:所述的蘋果為「寒富」蘋果。
【文檔編號】C12N15/66GK103642833SQ201310670789
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月7日 優先權日:2013年12月7日
【發明者】馬躍, 何平, 張志宏, 李林光, 王豐, 張蕾, 代紅豔, 李賀, 劉月學 申請人:瀋陽農業大學