油菜轉基因檢測試劑盒的製作方法

2023-09-19 22:36:00 3

油菜轉基因檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及檢測用品領域內的一種油菜轉基因檢測試劑盒，由引物組合和膜晶片組成，其特徵在於引物組合為11重雙啟動寡核苷酸引物組合，膜晶片為順序固定在支持膜表面的11組探針序列和一組陽性對照探針序列，各探針的5』端做氨基標誌；引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5』端帶生物素標誌的Tag引物。本發明克服了現有技術費時費力成本高的缺陷，提供的油菜轉基因檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉。
【專利說明】油菜轉基因檢測試劑盒
所屬【技術領域】
[0001]本發明涉及檢測用品領域，具體為一種油菜轉基因檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]油菜是十字花科蕓薹屬植物，是轉基因作物研究中研究最早、最多的一類農作物。1985年，Ooms等利用農桿菌介導法培育成功第一例轉基因甘藍型油菜。此後各大跨國公司育成了多種轉基因油菜品系，並於1995後陸續在北美、日本等地通過生物安全評估，批准商業化種植。截止2010年,全球轉基因油菜種植面積已超過700萬hm2,佔全球油菜總種植面積的23%，位列於轉基因大豆、玉米、棉花之後，是世界第四位的轉基因作物。油菜是重要的油料作物，我國目前食用油的一半以上來源於油菜。每年我國需要從北美地區進口300萬噸以上的油菜籽，其中70%以上是轉基因油菜籽。由於轉基因產品在全球市場中的大量湧現，其環境和食品安全問題也引起國際性的高度關注。各國相繼制定並出臺了相應的法律法規，對轉基因作物的環境釋放和產品銷售採取嚴格的管理措施。我國於2001年5月23日發布了國務院第304號令《農業轉基因生物安全管理條例》，實現了對轉基因生物的規範管理，並於2002年3月20日起施行《農業轉基因生物標識管理辦法》，要求對包括轉基因油菜在內的5類轉基因生物及其產品進行標識。因此，快速、準確、靈敏、廉價和相應通量的轉基因產品檢測技術是非常關鍵的。轉基因產品的檢測技術主要包括基於蛋白的檢測方法和基於核酸的檢測方法。酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫試紙條和Western雜交等方法是目前主要的基於蛋白的檢測方法，其共同特點是需要通過一定的處理步驟從樣品中釋放出目標蛋白(抗原)，然後利用抗體特異性的結合抗原蛋白，最後通過酶標或金屬標偶聯抗體與抗原抗體複合物結合，從而產生可檢測的信號，該類方法的缺點是檢測靈敏度相對較低，並且需要製備高特異性抗體，同時檢測容易受到多種因素的影響，出現假陽性。而基於核酸的檢測方法是目前最普遍、最`準確的轉基因檢測技術，檢測方法主要包括PCR (聚合酶鏈式反應)技術和基於分子雜交的基因晶片技術。目前仍以PCR技術應用最為廣泛，其常用的技術方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、螢光定量PCR等方法。普通定性PCR方法檢測效率低，尤其檢測多基因對象時更加費時費力；巢式PCR雖然提高了檢測的靈敏度，但同樣存在檢測效率的問題；多重PCR方法可以在一個反應中同時檢測多個基因，但常規的電泳檢測結果很難判斷，容易出現假陽性和假陰性結果；螢光定量PCR方法靈敏度高，但其成本高，並且需要特殊檢測儀器。基因晶片也是常用的轉基因產品檢測技術，目前一般採用玻璃片作為固相支持物，實驗過程需要相應的點樣儀和晶片識讀儀，同樣成本較高。因此研發一種快速、方便、靈敏、廉價、可視化和高通量的檢測方法將具有非常好的應用前景。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是為了克服現有技術費時費力成本高的缺陷，提供一種操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉的油菜轉基因檢測試劑盒。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:本發明的油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜晶片組成，其特徵在於引物組合為11重雙啟動寡核苷酸引物(DPO)組合，各對引物的鹼基序列5』 -3』如下，其中鹼基I為次黃嘌呤核苷酸:
EPSPS:正向引物:CTTTCTGGAACCGTCCGTATII 11 IGTGACAA 反向引物:CCAAGTATCACCTTCCTTACI 111ICTGGCAC ；
GOX:正向引物:CTGCTGCTCCTAACTGGAAGIIIIITCACGTT 反向引物:GGTCATTGGAGCACCAGTCAIIIIIAGGTGAC ；
PAT:正向引物:TGAGACGTCTACAGTGAACT IIIII ACAGAGC 反向引物:CTTCCAGGGCCCAGCGTAAGIIIIICCAGCCA ；
NPTI1:正向引物:CGAAGTGCCGGGGCAGGATCI11IITCATCTC 反向引物:CGCGAGCCCCTGATGCTCTTIIIIIAGATCAT ；
BAR:正向引物:GACGACCTCGTCCGTCTGCGI 111 IGCTATCC 反向引物:CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC ；
BARNASE:正向引物:ATTATCGTGGATTTCCGTTTIIIIICTGGTGC 反向引物:GCTTATGATATGTCTGAAGAIIIIICGCAACC ；
BARSTAR:正向引物:CCTGGACGCTTTATGGGATTII 11 IACCGGAT 反向引物:TTCCGCTTTCGCTTCACGGAIIIIITGAAGCA ；
FMV35S:正向引物:GGAAGAATTCTCAGTCCAAAI 111 IAACAAGG 反向引物:CAAAGATGCCCACTAACTTTIIIIITTCGGTG ；
CaMV35S:正向引物:GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC 反向引物:TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA ；
NOS 3』:正向引物:TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT 反向引物:CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT ；
PEP:正向引物:ATACGCTACAACTACCAATAIIIIICGAGTGG 反向引物:GGAAAAAAGGTCGAGAAGTTIIIIICACGAGG ；
膜晶片為順序固定在支持膜表面的11組探針序列和一組陽性對照(Positive)探針序列，11組探針序列和陽性對照探針序列的鹼基序列5 』 -3』如下，各探針的5』端做氨基標誌(NH2):
EPSPS 探針:NH2-5』 -TATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACA CTGGTAAGGCTATGCAAGCTA-3』 ；
GOX 探針:NH2-5』 -cccttccagtgattggtcgtgctacccgtactccagacg
TTATCTACGCTTTCGGTCAC-3』 ；
PAT 探針:NH2-5』 -ggattgatgatctagagaggttgcaagatagataccctt
GGTTGGTTGCTGAGGTTGAG-3』 ；
NPTII 探針:NH2-5』 -caccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactc
GGATGGAAGCCGGTCTTGTCGA-3』 ；
BAR 探針:NH2-5』 -cgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgta
CGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3』 ；
BARNASE 探針:NH2-5』 -AACGGAAACATCTTCTCACAAGGCACACACAGAAGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3』 ；
BARSTAR 探針:NH2-5』 -CGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAG
CAGCTGACTGAAAATGGCGCCGAGA-3，；
FMV35S 探針:NH2-5』 -CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGT
CAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3，；
CaMV35S 探針:NH2_5』 -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACC
ACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3』 ；
NOS 3』 探針:NH2-5』 -atgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattata
CATTTAATACGCGATAGAAAA-3』 ；
PEP 探針:NH2-5』 -gagatttttccaaggcttcaaactctttcatcacatgtc
TCTTCTCTTTCCATTGTCTT-3』 ；
Positive 探針:NH2_5，-TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGT CAGGGAGAATCACTACGTACA AGC-3』 ；
上述方案中，所述引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5』端帶生物素標誌(biotin)的Tag引物，其鹼基順序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，-GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG-3，。
[0005]上述方案中，所述油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX_Taq聚合酶(Polymerase)和5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA的鹼基順序為biotin-5』 - GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTMCTGTTCGAATACTCATCCTTGCTA-3，。
[0006]上述方案中，所述油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩衝液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB )顯色液。
[0007]上述方案中，所述預雜交液為5XSSC (0.75M氯化鈉，0.075M檸檬酸鈉)，0.1%重量百分比SDS (十二烷基磺酸鈉)和lOXDenhardt』 S液(1% Ficoll聚蔗糖，1%polyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯燒酮，1% BSA牛血清白蛋白)；雜交液為5XSSC,0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt』 S，50%重量百分比去離子甲醯胺和100ug/ml酵母tRNA ；洗液分別為洗液1:2XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2:0.5XSSC和0.1%重量百分比305，洗液3:100 mM (毫摩爾/升)Tris-HCl，ρΗ7.5，150 mM 似(:1，洗液4:100 mM Tris-HCl,pH9.5,100 mM NaCl和100 mM MgCl2 ;封閉液為3%重量百分比BSA (牛血清白蛋白)，100mM Tris-HCl, pH7.5,150 mM NaCl ;四甲基聯苯胺顯色液分別為四甲基聯苯胺顯色液A液:200mM檸檬酸鈉pH5.4,0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液:3%重量百分比的H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液，使用前A液B液等量混合配成四甲基聯苯胺顯色液。
[0008]上述方案中，所述支持膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
[0009]本發明的油菜轉基因檢測試劑盒採用多重PCR擴增的方法擴增目標序列。多重PCR擴增技術原理是將多對引物放到同一個反應管中進行PCR擴增，達到同時擴增2種或兩種以上目標DNA序列的目的。本發明採用了 11重PCR擴增體系擴增目標序列，包括七種常見轉基因序列 EPSPS、G0X、PAT、NPTI1、BAR、BARNASE、BARSTAR，兩個外源啟動子序列 FMV35S和CaMV35S，一個外源終止子序列NOS 3』和油菜內源基因序列PEP。[0010]本發明設計採用DPO引物(Dual Priming Oligonucleotide,雙啟動寡核苷酸引物)進行目標序列擴增。本發明的DPO引物的鹼基序列，是經過精心研究和大量實驗得到的，其特點是引物之間不易形成二級結構，多重擴增的特異性強，與模板的錯配概率小，只要有3個鹼基以上的錯配就不會成功擴增，既可以顯著提高多重PCR擴增的特異性，又可以提高目標序列的擴增效率。
[0011]本發明採用5』端帶氨基(NH2)修飾的探針進行目標序列雜交檢測。氨基修飾的探針與膜結合更牢固，並且探針與膜的結合具有方向性，更利於探針與目標區域的雜交，從而提高檢測的靈敏度。
[0012]本發明採用非對稱PCR擴增技術(asymmetric PCR)用以提高檢測靈敏度。非對稱PCR擴增技術原理是在PCR擴增過程中採用不等量的正向引物和反向引物(或是擴增延伸條件不同的正向引物和反向引物)，PCR擴增後產生大量的單鏈DNA，該單鏈DNA可以有效的和固定在支持膜上的探針雜交，從而提高檢測靈敏度。
[0013]本發明在多重PCR擴增同時進行非對稱PCR擴增，採用的技術方案是在多重PCR反向引物的5』端添加5』端帶生物素標誌的Tag序列，同時在PCR反應體系中添加過量的5』端帶生物素標誌的Tag引物，Tag引物的喊基順序與上述Tag序列的喊基順序相同，該Tag引物Tm值(解鏈溫度)比多重PCR正向引物Tm值高l(Tl5°C，用於非對稱PCR階段擴增單鏈DNA。在整個PCR擴增過程中，首先採用低退火溫度(55飛(TC )進行多重PCR反應，其擴增產物主要是雙鏈DNA，之後提高退火溫度(65飛8°C)，使正向引物不能結合到模板上，只有Tag引物和反向引物可以結合到模板上並延伸擴增，從而產生大量5』端帶生物素標誌的單鏈DNA，該單鏈DNA用於接下來的膜晶片雜交檢測。
[0014]本發明採用基於反向斑點雜交的可視化膜晶片技術進行轉基因的分子雜交檢測，其工作原理是首先將針對各個轉基因序列的單鏈探針按順序排列固定於支持膜表面的特定區域，再將待測的多重PCR產物與其雜交，這樣PCR產物中的轉基因序列單鏈DNA就會和支持膜上的探針雜交，經洗滌去除未結合的DNA樣品，由於待測PCR產物的DNA上帶有生物素標誌，結合了待測DNA的探針 點就偶聯上了生物素標誌物，再經過相應的顯色反應就能讀取對應的雜交信號，這樣一張膜晶片上就可以同時檢測多個轉基因目標序列。本發明的油菜轉基因檢測試劑盒的檢測探針為59鹼基的寡核苷酸探針，其順序排列於支持膜表面的特殊區域，形成低密度探針陣列。膜晶片同待測樣本雜交後經底物顯色可形成肉眼可視化的檢測結果。
[0015]本發明提供一種多指標檢測油菜轉基因的可視化膜晶片試劑盒，其中待檢測的目標序列包括常見的油菜轉基因序列EPSPS、GOX、PAT、NPTI1、BAR、BARNASE、BARSTAR，外源啟動子序列FMV35S、CaMV35S，外源終止子序列NOS 3』和油菜內源基因PEP。通過該試劑盒的檢測，可以快速準確的判斷待檢油菜產品中是否含有上述轉基因序列，適合於轉基因油菜產品的大規模篩查。
[0016]本發明的有益效果是:1)操作簡單，經過一次樣本前處理，單管PCR擴增，單晶片雜交就可以同步檢測樣本中多種轉基因序列，具有平行分析和多重判斷的特點；2)檢驗對象完備，包含了當前常見的轉基因序列，並且可以很方便的加入新的檢測序列；3)系統在多重PCR擴增過程同時進行了非對稱PCR擴增，提高了系統的靈敏度和準確性；4)試劑盒採用了可視化膜晶片的檢測方式，提高了系統的檢測通量，並且檢測結果可以直接用肉眼判斷，方便，快捷；5)試劑盒操作簡單，經濟，無需特殊的昂貴儀器，適用於轉基因油菜的大規模檢測。
[0017]綜上所述，本發明克服了現有技術費時費力成本高的缺陷，提供的油菜轉基因檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發明用於檢測轉基因油菜品系GT73 / RT73的雜交結果圖，其中圖1A為晶片結果模式圖，圖1B為轉基因油菜GT73 / RT73的檢測結果圖。
[0019]圖2為本發明用於檢測轉基因油菜品系HCN92的雜交結果圖，其中圖2A為晶片結果模式圖，圖2B為轉基因油菜HCN92的檢測結果圖。
[0020]圖3為本發明用於檢測轉基因油菜品系MSI XRFl的雜交結果圖，其中圖3A為晶片結果模式圖，圖3B為轉基因油菜MSI XRFl的檢測結果圖。
[0021]圖4為本發明用於檢測非轉基因油菜野生品系3529的雜交結果圖，其中圖4A為晶片結果模式圖，圖4B為非轉基因油菜野生品系3529的檢測結果圖。
[0022]附圖中，EPSPS:(5_莽草酸-3-磷酸合成酶基因)，G0X:(草甘膦氧化還原酶基因)，PAT:(草丁膦乙醯CoA轉移酶基因)，NPTII:(新黴素-3』 -磷酸轉移酶基因)，BAR:(草丁膦乙酸轉移酶基因)，BARNASE:(來源於桿菌amylolique faciens 的 ribonuclease基因)，BARSTAR:(來源於桿菌amylolique faciens的barnase基因的特異抑制基因)，FMV35S:(玄參花葉病毒35S啟動子)，CaMV35S:(花椰菜花葉病毒35S啟動子)，NOS3』:(胭脂鹼合成酶基因終止子)，PEP:(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)，Positive:(陽性對照)，Barcode:(膜晶片條碼)。`
具體實施例
[0023]下面結合附圖及實施例進一步詳述本發明，但本發明不僅限於所述實施例。
[0024]實施例一
本例的油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜晶片組成，引物組合為11重DPO引物(Dual Priming Oligonucleotide,雙啟動寡核苷酸引物)組合,各對引物的鹼基序列5』 -3』如下，其中鹼基I為次黃嘌呤核苷酸:
EPSPS:正向引物:CTTTCTGGAACCGTCCGTATII 11 IGTGACAA 反向引物:CCAAGTATCACCTTCCTTACI 111 ICTGGCAC ；
GOX:正向引物:CTGCTGCTCCTAACTGGAAGIIIIITCACGTT 反向引物:GGTCATTGGAGCACCAGTCAIIIIIAGGTGAC ；
PAT:正向引物:TGAGACGTCTACAGTGAACT IIIII ACAGAGC 反向引物:CTTCCAGGGCCCAGCGTAAGIIIIICCAGCCA ；
NPTI1:正向引物:CGAAGTGCCGGGGCAGGATCIIIIITCATCTC 反向引物:CGCGAGCCCCTGATGCTCTTIIIIIAGATCAT ；
BAR:正向引物:GACGACCTCGTCCGTCTGCGI 111 IGCTATCC 反向引物:CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC ；
BARNASE:正向引物:ATTATCGTGGATTTCCGTTTIIIIICTGGTGC反向引物:GCTTATGATATGTCTGAAGAIIIIICGCAACC ；
BARSTAR:正向引物:CCTGGACGCTTTATGGGATTII 11 IACCGGAT 反向引物:TTCCGCTTTCGCTTCACGGAIIIIITGAAGCA ；
FMV35S:正向引物:GGAAGAATTCTCAGTCCAAAI 111 IAACAAGG 反向引物:CAAAGATGCCCACTAACTTTIIIIITTCGGTG ；
CaMV35S:正向引物:GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC 反向引物:TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA ；
NOS 3』:正向引物:TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT 反向引物:CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT ；
PEP:正向引物:ATACGCTACAACTACCAATAIIIIICGAGTGG 反向引物:GGAAAAAAGGTCGAGAAGTTII 11ICACGAGG。
[0025]本例的油菜轉基因檢測試劑盒的引物組合中同時包含非對稱PCR擴增引物，為5』端帶生物素標誌(biotin)的Tag引物，其鹼基順序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，- GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG -3，。
[0026]膜晶片為順序固定在支持膜表面的11組探針序列和一組陽性對照(Positive)探針序列，11組探針序列和陽 性對照探針序列的鹼基序列5』 -3』如下，各探針的5』端做氨基標誌(NH2):
EPSPS 探針:NH2-5』 -TATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACA CTGGTAAGGCTATGCAAGCTA-3』 ；
GOX 探針:NH2-5』 -cccttccagtgattggtcgtgctacccgtactccagacg
TTATCTACGCTTTCGGTCAC-3』 ；
PAT 探針:NH2-5』 -ggattgatgatctagagaggttgcaagatagataccctt
GGTTGGTTGCTGAGGTTGAG-3』 ；
NPTII 探針:NH2-5』 -caccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactc
GGATGGAAGCCGGTCTTGTCGA-3』 ；
BAR 探針:NH2-5』 -cgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgta
CGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3』 ；
BARNASE 探針:NH2-5』 -AACGGAAACATCTTCTCACAAGGCACACACAGAA GCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3』 ；
BARSTAR 探針:NH2-5』 -CGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAG CAGCTGACTGAAAATGGCGCCGAGA-3，；
FMV35S 探針:NH2-5』 -CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGT CAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3，；
CaMV35S 探針:NH2_5』 -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACC ACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3』 ；
NOS 3』 探針:NH2-5』 -atgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattata
CATTTAATACGCGATAGAAAA-3』 ；
PEP 探針:NH2-5』 -gagatttttccaaggcttcaaactctttcatcacatgtc
TCTTCTCTTTCCATTGTCTT-3』 ；Positive 探針:NH2_5，-TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGT CAGGGAGAATCACTACGTACAAGC-3』 ；
支持膜為硝酸纖維素膜。
[0027]通過相應的多重PCR引物設計，採用固相亞磷醯胺三酯法合成得到上述11重PCR組合引物和Tag引物。根據多重PCR擴增產物設計檢測探針，採用固相亞磷醯胺三酯法合成探針，探針合成時同時合成陽性探針(positive probe)和對應的5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸(positive oligo)單鏈DNA, 5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA的喊基順序為:
biotin-5』-GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATAC
TCATCCTTGCTA-3』。
[0028]將支持膜裁成1.2cmX 1.8cm的膜條，裁好的膜於雙蒸水中浸泡15min,再用15 X SSC浸泡15min，取出，置於濾紙上，60°C烘1.5小時，膜條降溫到室溫後，將探針(5uM)順序點在膜上，每個探針重複點樣兩次，以驗證檢測結果的可重複性，點樣樣式見圖1A，膜條晾乾後80°C烘2小時以固定探針，處理好的膜晶片室溫保存。
[0029]按照北京康為世紀生物科技有限公司新型植物基因組DNA提取試劑盒(NuCleanPlantGen DNA Kit, CW0531)的說明提取轉基因油菜品系GT73 / RT73的油菜基因組DNA，每30mg初始樣本經抽提後用50ul ddH20 (雙蒸水)溶解基因組DNA，並用紫外分光光度計將DNA溶液稀釋至同一質量濃度(50ng/ul)。
[0030]PCR擴增的反應體系如下所示: ddH20:加至總體積50ul 10XPCR Buffer: 5ul`
dNTP (2.5mM each): 5ul
PCR 引物(20 μ M): 0.5ul each
Tag primer (20 μ M): 3.5ul
EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul): 0.5ul
提取的油菜基因組DNA (約50ng/ul): 2ul
對上述反應體系進行PCR循環擴增，PCR循環條件如下所示，反應過程由預變性、多重PCR循環I和非對稱PCR循環2組成，條件分別為:
預變性:溫度95°C，時間10分鐘。
[0031]多重PCR循環1:30個循環組成:
變性:溫度95°C，時間45秒。
[0032]退火:溫度55 °C，時間30秒。
[0033]延伸:溫度72 °C，時間30秒。
[0034]非對稱PCR循環2:25個循環組成:
變性:溫度95°C，時間45秒。
[0035]退火:溫度65 °C，時間30秒。
[0036]延伸:溫度72 °C，時間30秒。
[0037]最後延伸:溫度72°C，時間10分鐘。
[0038]然後進行膜晶片斑點雜交檢測，膜條於42°C預雜交液(5XSSC，0.1% SDS』lOXDenhardt’s)中預雜交I小時，之後將膜條放於2ml雜交液(5XSSC，0.1% SDS,5 XDenhardt’s，50% 去離子甲醯胺，100ug/ml 酵母 tRNA)中 42°C，I 小時。取 40ul 多重 PCR產物加入Iul陽性寡核苷酸單鏈DNA(IOuM)，10(TC水浴變性5分鐘後置於冰上，之後加入2ml 雜交液中，42°C雜交 16 小時。洗液 1(2XSSC，0.1% SDS)、洗液 2(0.5XSSC,0.1% SDS)42°C各洗膜條兩次，每次10分鐘。將膜條置於封閉液(3%BSA，100 mMTris-HCl, pH7.5，150mMNaCl)中37°C封閉30分鐘，之後將膜條放到酶聯液(用封閉液1:5000稀釋鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶)中37°C，30分鐘。用洗液3 (100 mM Tris-HCl, pH7.5,150 mMNaCl)、洗液 4 (100 mM Tris-HCl,pH9.5,100 mMNaCl, 100 mMMgCl2)各漂洗膜條 3 次，每次 5 分鐘，之後將膜條放入TMB顯色液(IOOmM檸檬酸鈉ρΗ5.4，0.lmg/ml四甲基聯苯胺TMB，1:1600體積比的H202 (3%))中，避光顯色10-15分鐘，依照雜交點的顯色情況判定結果。
[0039]本例中所用輔料和配液為外購或自配，百分比為重量百分比。
[0040]本例中提取的油菜基因組DNA為轉基因油菜品系GT73 / RT73，檢測結果如圖1B所示。
[0041]實施例二
本例的油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA的鹼基順序為biotin-5』-GCTTGTACGTAGT
GATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATACTCATCCTTGCTA -3』。
[0042]提取的油菜基因組DNA為轉基因油菜品系HCN92，檢測結果如圖2B所示。
[0043]其餘同實施例一。
[0044]實施例三
本例的油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩衝液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB)顯色液，其中，預雜交液為5XSSC,0.1% SDS和lOXDenhardt』 s ;雜交液為5XSSC,0.1% SDS，5XDenhardt』 S，50%去離子甲醯胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液I:2 X SSC 和 0.1% 505，洗液2:0.5父55(:和0.1% 505，洗液3:100 mM Tris-HCl，ρΗ7.5，150mM NaCl，洗液 4:100 mM Tris-HCl，ρΗ9.5，100 mM NaCl 和 100 mM MgCl2 ;封閉液為 3% BSA,100 mM Tris-HCl, pH7.5,150 mM NaCl ;四甲基聯苯胺顯色液分別為四甲基聯苯胺顯色液A液:200mM檸檬酸鈉，pH5.4，0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液:3% H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液，使用前A液B液等量混合配成四甲基聯苯胺顯色液。
[0045]支持膜為硝酸纖維素膜。
[0046]提取的油菜基因組DNA為轉基因油菜品系MS1XRF1，檢測結果如圖3B所示。
[0047]其餘同實施例一。
[0048]實施例四
本例的油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片、輔料和配液組成，其中，多重PCR擴增試劑一管600ul，每48ul試劑可檢測一個DNA樣本，每48ul擴增體系構成如下:10XPCR Buffer(Takara) 5ul，dNTP (2.5mM each) 5ul，11 對多重PCR引物(20 μ Μ) 0.5uleach, Tag primer(20 μ M) 3.5ul, EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul) 0.5ul,ddH20加至48ul。每一樣本檢測需要吸取48ul擴增試劑，加入2ul待檢測基因組DNA (約50ng/ul) ο
[0049]陽性寡核苷酸單鏈DNA(IOuM) —管15ul。
[0050]預雜交液(5XSSC，0.1% SDS，lOXDenhardt’s)—瓶 30ml。雜交液(5XSSC,0.1%SDS, 5 XDenhardt』 s, 50% 去離子甲酸胺，100ug/ml 酵母 tRNA) 一瓶 30ml。
[0051]洗液I (2X SSC, 0.1% SDS) 10 倍濃縮液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。洗液
2(0.5XSSC, 0.1% SDS) 10 倍濃縮液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。
[0052]封閉液/ 酶聯液(3%BSA，100 mM Tris-HCl, ρΗ7.5，150 mMNaCl) 一瓶 60ml。鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶(lmg/ml) —管5ul，使用前用封閉液1:5000稀釋成酶聯液。
[0053]洗液3 (100 mM Tris-HCl, ρΗ7.5，150 mMNaCl) 10 倍濃縮液一瓶 18ml，使用前加162ml ddH20。洗液 4 (100 mM Tris-HCl, pH9.5,100 mMNaCl, 100 mM MgCl2) 10 倍濃縮液一瓶 18ml，使用前加 162ml ddH20。
[0054]TMB顯色液A液(200mM檸檬酸鈉，ρΗ5.4，0.2mg/ml四甲基聯苯胺TMB)—瓶15ml。TMB顯色液B液(1:800體積比的H2O2 (3%)) 一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB顯色液。
[0055]提取的油菜基因組DNA為非轉基因油菜野生品系3529，檢測結果如圖4B所示。
[0056]其餘同實施例三。
【權利要求】
1.一種油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜晶片組成，其特徵在於引物組合為11重雙啟動寡核苷酸引物組合，各對引物的鹼基序列5』-3』如下，其中鹼基I為次黃嘌呤核苷酸: EPSPS:正向引物:CTTTCTGGAACCGTCCGTATII11IGTGACAA 反向引物:CCAAGTATCACCTTCCTTACIIIIICTGGCAC ； GOX:正向引物:CTGCTGCTCCTAACTGGAAGIIIIITCACGTT 反向引物:GGTCATTGGAGCACCAGTCAIIIIIAGGTGAC ； PAT:正向引物:TGAGACGTCTACAGTGAACTIIIIIACAGAGC 反向引物:CTTCCAGGGCCCAGCGTAAGIIIIICCAGCCA ； NPTI1:正向引物:CGAAGTGCCGGGGCAGGATCIIIIITCATCTC 反向引物:CGCGAGCCCCTGATGCTCTTIIIIIAGATCAT ； BAR:正向引物:GACGACCTCGTCCGTCTGCGI111IGCTATCC 反向引物:CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC ； BARNASE:正向引物:ATTATCGTGGATTTCCGTTTIIIIICTGGTGC 反向引物:GCTTATGATATGTCTGAAGAIIIIICGCAACC ； BARSTAR:正向引物:CCTGGACGCTTTATGGGATTII11IACCGGAT 反向引物:TTCCGCTTTCGCTTCACGGAIIIIITGAAGCA ； FMV35S:正向引物:GGAAGAATTCTCAGTCCAAAI111IAACAAGG 反向引物:CAAAGATGCCCACTAACTTTIIIIITTCGGTG ； CaMV35S:正向引物:GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC 反向引物:TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA ； NOS 3』:正向引物:TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT 反向引物:CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT ； PEP:正向引物:ATACGCTACAACTACCAATAIIIIICGAGTGG 反向引物:GGAAAAAAGGTCGAGAAGTTIIIIICACGAGG ； 膜晶片為順序固定在支持膜表面的11組探針序列和一組陽性對照(Positive)探針序列，11組探針序列和陽性對照探針序列的鹼基序列5』 -3』如下，各探針的5』端做氨基標誌: EPSPS 探針:NH2-5』 -TATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACA CTGGTAAGGCTATGCAAGCTA-3』 ； GOX 探針:NH2-5』 -CCCTTCCAGT GATTGGTCGTGCTACCCGTACTCCAGACG TTATCTACGCTTTCGGTCAC-3』 ； PAT 探針:NH2-5』 -GGATTGATGATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTT GGTTGGTTGCTGAGGTTGAG-3』 ； NPTII 探針:NH2-5』 -CACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTC GGATGGAAGCCGGTCTTGTCGA-3』 ； BAR 探針:NH2-5』 -cgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgta
CGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3』 ； BARNASE 探針:NH2-5』 -AACGGAAACATCTTCTCACAAGGCACACACAGAAGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3』 ；
BARSTAR 探針:NH2-5』 -CGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAG
CAGCTGACTGAAAATGGCGCCGAGA-3，；
FMV35S 探針:NH2-5』 -CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGT
CAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3，；
CaMV35S 探針:NH2_5』 -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACC
ACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3』 ；
NOS 3』 探針:NH2-5』 -atgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattata
CATTTAATACGCGATAGAAAA-3』 ；
PEP 探針:NH2-5』 -gagatttttccaaggcttcaaactctttcatcacatgtc
TCTTCTCTTTCCATTGTCTT-3』 ； Positive 探針:NH2_5，-TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGT
CAGGGAGAATCACTACGTA CAAGC-3』。
2.根據權利要求1所述的油菜轉基因檢測試劑盒，其特徵在於所述引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5』端帶生物素標誌的Tag引物，其鹼基順序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，-GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG-3，。
3.根據權利要求1所述的油菜轉基因檢測試劑盒，其特徵在於所述油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸、EX-Taq聚合酶和5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5』端帶生物素標誌的陽性寡核苷酸單鏈DNA的鹼基順序為 biotin-5』 - GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATACTCATCCTTGCTA-3，。
4.根據權利要求1所述的油菜轉基因檢測試劑盒，其特徵在於所述油菜轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜晶片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩衝液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺顯色液。
5.根據權利要求4所述的油菜轉基因檢測試劑盒，其特徵在於所述預雜交液為5X SSC, 0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉和lOXDenhardt’s液；雜交液為5X SSC，0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt』 S，50%重量百分比去離子甲醯胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液1:2XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2:0.5XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液 3:100 mM Tris-HCl，ρΗ7.5，150 mM NaCl，洗液 4:100 mM Tris-HCl，ρΗ9.5，100 mMNaCl和100 mM MgCl2 ;封閉液為3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl ;四甲基聯苯胺顯色液分別為四甲基聯苯胺顯色液A液:200mM檸檬酸鈉pH5.4，0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液:3%重量百分比的H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液，使用前A液B液等量混合配成四甲基聯苯胺顯色液。
6.根據權利要求1所述的油菜轉基因檢測試劑盒，其特徵在於所述支持膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757127SQ201410044476
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月5日 優先權日:2014年2月5日
【發明者】黃廣平, 秦子蘇, 王勇強 申請人:黃廣平