檢測載脂蛋白e基因型的方法和試劑盒的製作方法

2023-09-19 22:47:45

專利名稱：檢測載脂蛋白e基因型的方法和試劑盒的製作方法
所屬領域本發明涉及檢測臨床血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因分型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點雜交技術快速檢測ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
背景技術：
人ApoE基因有三個等位基因，即ε2，ε3和ε4，共構成6種不同的基因型3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。其等位基因頻率因不同的種族和地區存在差異，在一般人群中，ε2，ε3和ε4等位基因的頻率分別為8％，78％和4％。
目前已知，ApoEε4是早發性冠狀動脈心臟病(coronary heart disease，CHD)發病的獨立危險因素，Meta分析表明，ApoEε4攜帶者比其他等位基因攜帶者患冠心病的危險性顯著增加(Song Y，Stampfer MJ，Liu S，et al.Meta-analysisapolipoprotein E genotypes and risk for coronary heart disease.Ann Intern Med.2004，141(2)137-147.)。近年來大量的研究發現，ApoEε4與晚發性家族性Alzheimer病(LOAD)和散發性Alzheimer病(SAD)有關，而ApoEε2則有延遲痴呆發生的作用。目前科學家已公認ApoEε4等位基因是Alzheimer病(AD)的易感因子，並且與散發性AD的發生密切相關(Yamagata K，et al.Highexpression of apolipoprotein E mRNA in the brains with sporadic Alzheimerpsdisease.Dement Geriatr Cogn Disord，2001，1257-62.)。因此，ApoE基因分型檢測對早期輔助診斷Alzheimer病具有重要的意義。結合臨床診斷，ApoEε4的檢測將使對Alzheimer病的預測準確性高達94-98％(The Ronald and Nancy ReagenResearch Institute of the Alzheimer’s Association and the National Institute onAging Working Group.Neurobiol Aging.1998；19109-116)。此外，ApoE基因分型檢測還有助於臨床治療方案的選擇。臨床研究表明，攜帶或不攜帶ε4等位基因的AD患者使用乙醯膽鹼酯酶抑制劑藥物的治療效果有很大不同(Lendon C L，etal.Exploring the etiology of Alzheimer′s disease using molecular biology，JAMA，1997，27825-831；Farlow M，et al.Differential qualitative responses torivastigmine in APOE epsilon4 carriers and noncarriers.Pharmacogenomics J.2004；4(5)332-5.)。可見，ApoE等位基因多態性的檢測對深入研究高脂血症、動脈粥樣硬化和AD的發病機理及治療策略，以及從人群中篩選這些疾病的易感個體均具有積極意義。
目前常用的基因分型方法包括限制性片段長度多態性(RFLP)、序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSOP)、序列特異性引物(PCR-SSP)、單鏈構象多態性(PCR-SSCP)以及DNA序列測定等技術。這些方法都存在技術複雜、成本昂貴，效率低和解析度不足等缺點。因此，本發明人試圖結合已知的點印跡雜交技術和過濾雜交方法，建立一種能夠在較短的時間內檢測和分析ApoE基因型的方法。
發明目的本發明涉及檢測個體血液樣品中載脂蛋白E(ApoE)基因型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點雜交技術快速檢測ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
本發明的一個目的是提供一種使用反向斑點雜交技術檢測血液樣品中個體載脂蛋白E基因型的方法，該方法包括(1)提供待檢靶核酸樣品；(2)利用聚合酶鏈反應擴增體系擴增靶DNA片斷；(3)使被標記的靶核酸與特異性寡核甘酸探針雜交；(4)檢測雜交結合物並藉以判斷靶DNA的載脂蛋白E基因型，特徵在於聚合酶鏈反應擴增體系中使用的正向和反向引物分別是5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，並且雜交反應中使用的寡核甘酸探針分別是
(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5』-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3』-NH2(SEQ ID NO7)。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的靶核酸樣品是得自被檢者血液白細胞的人基因組DNA樣品。
根據本發明的一個優選實施方案，所說的檢測是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點印跡雜交裝置完成的。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的標記分子是生物素。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的靶DNA的基因型包括3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
本發明的另一個目的是提供用於檢測人個體載脂蛋白E基因型的的試劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2)聚合酶鏈反應試劑；(3)雜交反應試劑，特徵在於聚合酶鏈反應擴增體系中的所使用的正向和反向引物分別是5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，並且雜交反應中使用的寡核甘酸探針分別是(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5』-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3』-NH2(SEQ ID NO7)。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸提取試劑包括由DNA提取液和滅菌生理鹽水組成的提取待檢樣品DNA的抽提液。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的聚合酶鏈反應試劑包括由含有脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐熱Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)等組成的PCR反應混合液。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的雜交反應試劑包括雜交液I和II、溶液I、II、III和IV、膜條以及標準對照品。

發明內容
本發明涉及檢測個體血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點雜交技術快速檢測ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
本發明的一個目的是提供一種使用反向斑點雜交技術檢測血液樣品中個體ApoE基因型的方法，該方法包括(1)提供待檢靶核酸樣品；(2)利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增體系擴增靶DNA片斷；(3)使被標記的靶核酸與特異性寡核甘酸探針雜交；(4)檢測雜交結合物並藉以判斷靶DNA的基因型，特徵在於所說的聚合酶鏈反應擴增體系中的所使用的正向和反向引物分別是5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，並且雜交反應中使用的寡核甘酸探針分別是(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5』-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3』-NH2(SEQ IDNO7)。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的DNA樣品是得自被檢者血液白細胞的人基因組DNA樣品。
根據本發明的一個優選實施方案，所說的檢測是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點印跡雜交裝置完成的。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的標記分子是生物素。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的靶DNA的基因型包括3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
眾所周知，通常使用的點印跡雜交方法是將靶DNA固定於硝酸纖維素膜或尼龍膜上，使標記的探針與待檢靶DNA接觸並雜交，顯色後判斷結果。這種方法每次雜交反應只能檢測待檢DNA是否含有某一種探針的同源序列，即用於判斷一種基因型。如果某些基因座位有多個等位基因(如HLA-DRB位點或地中海貧血突變基因等)，用這種點雜交方法檢測就很繁雜，甚至很難完成。而反向斑點雜交方法則是先將針對各等位基因特異性的探針點到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然後再將待測DNA樣品(一般是使用5』-端標記有生物素等分子的引物PCR擴增目的片斷後的產物)與之雜交，這樣待測樣本就會與具有同源序列的探針結合。經洗滌去除未結合的DNA後，即可直接或間接地顯示出並檢測到代表雜交信號的生物素等標記物。因此，使用該方法可一次同時檢測某一基因座位的大部分或全部等位基因。
簡單地說，為了完成本發明的方法，首先常規製備待檢者的白細胞基因組DNA。該DNA樣品經DNA提取液處理後離心收集上清液，並將該上清液用於PCR擴增反應。以如上得到的人基因組DNA為模板，並使用合成的正向和反向寡核苷酸引物進行PCR擴增。變性處理所得到的DNA擴增產物後，使之分別與足以揭示不同的載脂蛋白E等位基因的寡核苷酸探針雜交。最後，根據雜交產物染色後的顏色變化判斷載脂蛋白E的基因型。以下針對本發明方法的幾個主要步驟，分別詳細描述如下。
1、引物的設計和合成為了特異、高效地擴增待檢核酸樣品中的載脂蛋白E基因，我們從Gene Bank中調出ApoE基因DNA序列，針對包含編碼ApoE第112位和158位胺基酸的多態性位點序列，按照引物設計的一般性原則，採用美國Amplied Biosystem，Inc.的PrimerExpress2.0軟體分別設計併合成正向和反向引物5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和生物素5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)。通過美國NIH網站上Blast程序進行同源性比較(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)，保證引物設計的特異性。
2、探針的合成和標記針對編碼ApoE蛋白第112和158位胺基酸相對應的多態性位點，設計併合成分別命名為探針1，探針2，探針3和探針4的四條探針。此外，另設計一條用於控制顯色反應的顯色反應控制探針為探針5，藉以控制顯色反應作為對照。為了保證各探針均能在同一溫度下與特定的靶DNA成功地雜交，須將探針的Tm值和GC含量嚴格控制在特定範圍內。合成的探針經20％聚丙烯醯胺凝膠電泳分離並純化後，分別進行NH2基團標記以用於繼後的雜交反應(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5』-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3』-NH2(SEQ IDNO7)。
3、雜交載體的製備用作雜交載體的膜可以是由硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素等材料製成的，大小約為3.2cm×2.5cm的多孔條。膜條使用前需用10％的EDC(N-乙基-N』-[二甲基氨丙基]-碳二亞胺，Sigama公司)溶液充分浸泡活化處理。新合成的探針(100pm/μl)經稀釋後，按用每孔0.7μl在膜條的適當位置上以固定格式點加。點樣後用NaOH溶液處理膜條並充分洗滌，然後保存於-20℃備用。
4、核酸的提取採用常規DNA提取液提取人個體血液樣品(白細胞)中的DNA。例如可以利用滲透作用裂解抗凝血液中的紅細胞，然後離心收集富含白細胞的沉澱。然後向其中加入常規DNA提取液，抽提血液白細胞的基因組DNA。所得到的DNA經離心後收集上清液，將其作為核酸擴增的模板。
5、核酸擴增體系的優化我們採取熱啟動結合逐漸降低退火溫度的PCR方法，摸索出最佳的退火溫度，藉以提高核酸擴增的特異性和高效性。同時，使用dUTP-UNG酶處理待檢核酸，以有效地消除PCR產物的汙染。特別是，我們對PCR擴增中使用的引物和其濃度、以及Mg2+、模板、PCR佐劑(二甲基亞碸)等其他反應物的濃度均作了適當的調整和最佳化。
6、反向斑點雜交體系的優化反向斑點雜交的操作過程包括首先將如前製備的ApoE基因分型膜條固定在雜交儀上，然後在膜條的適當加樣點加載經變性處理的擴增的樣品DNA。雜交反應完成後，經洗膜和顯色步驟以顯示雜交斑點的存在，並根據所使用的探針的不同來判斷各個體的ApoE基因型。
由圖3所示的檢測實例可以看出，如果探針2(SEQ ID NO4)、探針4(SEQ IDNO6)和顯色反應控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε2；如果探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ ID NO5)和顯色反應控制探針5(SEQ IDNO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε3/ε3；如果探針1(SEQ ID NO3)、探針3(SEQ ID NO5)和顯色反應控制探針5(SEQ ID NO7)顯色判定ApoE基因型為ε4/ε4；如果探針1(SEQ ID NO3)、探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ IDNO5)和顯色反應控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε3/ε4；如果探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ ID NO5)、探針4(SEQ ID NO6)和顯色反應控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε3；如果探針1(SEQ ID NO3)、探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ ID NO5)、探針4(SEQ ID NO6)和顯色反應控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε4；如果只有顯色反應控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，其它探針不顯色則說明PCR擴增失敗(參見圖3)。
另外，本發明通過摸索不同的雜交溫度和探針濃度(例如，將雜交溫度設定在59℃，探針1-4和顯色反應控制探針5的濃度分別定為12.5μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L和2.5μmol/L)，可使檢測的結果更為準確可靠，並具有更好的檢測穩定性(可重複性)。
本發明中，由於發明人對靶DNA片斷的擴增體系和雜交體系進行了優化，設計併合成了特異性強的探針和引物，同時檢測中使用了配備有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點印跡雜交裝置，所以保證了方法的快捷和檢測結果的可靠性。
如前所述，由於反向斑點雜交方法能夠同時檢測目的基因內多個鹼基的突變或多態性，所以在病原體及複雜遺傳性疾病的檢測中有著更為簡便的優越性。另一方面，由於ApoE在常見的心血管疾病(如CHD)以及神經系統疾病(如AD)中的重要作用，所以ApoE基因成為臨床檢驗研究的熱點。本發明的ApoE等位基因檢測方法顯然可以為CHD、AD等疾病的診斷提供一種快速、簡便、特異性和準確性均較高的實驗室檢驗手段。
本發明的另一個目的是提供用於檢測人個體載脂蛋白E基因型的的試劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2)聚合酶鏈反應試劑；和(3)雜交反應試劑，特徵在於所說的聚合酶鏈反應擴增體系中的所使用的正向和反向引物分別是5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)；並且雜交反應中使用的寡核甘酸探針分別是(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5』-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3』-NH2(SEQ IDNO7)。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸提取試劑包括由DNA提取液和滅菌生理鹽水組成的提取待檢樣品DNA的抽提液。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的聚合酶鏈反應試劑由dNTPs(含dUTP)、耐熱Taq酶、UDG酶等組成的PCR反應混合液。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的雜交反應試劑包括雜交液I(和II、溶液I、II、III和IV、膜條以及標準對照品。
如前所說，為簡單快速地檢測個體血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因型，本發明提供了相應的載脂蛋白(ApoE)基因反向斑點雜交分型檢測試劑盒。具體地說，本發明的試劑盒提供(1)血液樣品ApoE核酸提取試劑，包括DNA提取液(500μl/管)、滅菌純水(20ml/管)、生理鹽水(10ml/管)；(2)聚合酶鏈反應試劑，包括PCR反應混合液10管(每管含PCR反應緩衝液，終濃度為2.5mmol/L的Mgcl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.2umol/L的正反向引物，二甲基亞碸5μl)、Taq酶(3u/μl，15μl)1管、UDG酶(1U/μl)1管；(3)雜交檢測試劑，主要為常規的20×SSC(主要含NaCL，檸檬酸鈉等)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、POD(鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶結合物)、TMB(四甲基聯苯胺)等。包括雜交液I(2×SSC-0.1％SDS，50ml/瓶)1瓶、雜交液II(0.5×SSC-0.1％SDS，35ml/瓶)1瓶、溶液I(250u/mlPOD，20μl/管)1管、溶液II(0.1mol/L檸檬酸鈉，30ml/瓶)1瓶、溶液III(2mg/mlTMB，1ml/管)1管、溶液IV(3％H2O2，10μl/管)1管，標準對照品，另外包括用作雜交反應載體的膜條10張。
本發明的試劑盒除提供了各位點所對應的特異性探針外，還配有顯色反應控制探針和標準對照品。由於本發明結合使用了配備有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點印跡雜交裝置，其導流雜交的特性大大提高了核酸分子的擴散率、局部反應的濃度和核酸雜交效率。一般說來，使用本發明的方法和試劑盒，從樣本的處理到判讀基因型檢測結果僅需要6小時左右的時間。因此，本發明的方法和試劑盒特別適用於臨床標本的快速檢測和大樣本的普查。


圖1顯示所使用的探針在膜條上的排列圖。 號探針具有SEQ ID NO3所示的序列， 號探針具有SEQ ID NO4所示的序列， 號探針具有SEQ ID NO5所示的序列， 號探針具有SEQ ID NO6所示的序列， 號顯色控制探針具有SEQID NO7所示的序列。
圖2顯示靶DNA擴增片斷經2％的瓊脂糖凝膠電泳圖，第1和2泳道為特異性靶DNA片斷(265bp)，M泳道為標準分子量標誌。
圖3顯示六種不同基因型樣品的反向斑點雜交檢測結果。 號探針、 號探針和 號探針顯色判定ApoE基因型為ε4/ε4； 號探針、 號探針和 號探針顯色判定ApoE基因型為ε3/ε3； 號探針、 號探針和 號探針顯色判定ApoE基因型為ε2/ε2； 號探針、 號探針、 號探針和 號探針顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε3； 號探針、 號探針、 號探針和 號探針顯色，可判定ApoE基因型為ε3/ε4； 號探針、 號探針、 號探針、 號探針和 號探針顯色判定ApoE基因型為ε2/ε4(參見下列表1和圖3)。
表1
發明的具體實施方式
實施例1樣品靶核酸的製備用無菌注射器抽取受檢者的靜脈血1ml，加入含EDTA抗凝管中，室溫或低溫保存。取抗凝全血300μl加到1.5ml離心管中，向離心管中加入1ml的滅菌純水，充分混勻，室溫靜置2-4分鐘。然後離心(5000rpm)6分鐘，收集沉澱物。重複上述步驟一次後向離心管內加入1ml生理鹽水並混勻，10000rpm離心10分鐘後，收集管底的白色沉澱。向沉澱中加入50μl的DNA提取液，充分混勻，沸水浴10分鐘並以12000rpm離心10分鐘。取2μl上清液作為PCR反應模板。
實施例2靶核酸的PCR擴增取單管單人份PCR反應液若干管，每管加入1μl UDG酶，再直接加入2μl模板(或陰陽性標準品)，充分混勻，瞬時(3秒)離心，將各反應管放入PCR儀，50℃預處理3分鐘後採用熱啟動結合「降落PCR」，按下列條件擴增94℃4分鐘，80℃3分鐘，在此過程中加入Taq酶1μl。94℃2分鐘變性，然後按94℃1分鐘，70℃1分鐘，72℃1分鐘，共5個循環，再按94℃1分鐘，64℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個循環，最後72℃延伸7分鐘。擴增產物經2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(見附圖2)。
實施例3六種已知基因型的樣品反向斑點雜交檢測雜交前，取雜交液I(2×SSC-0.1％SDS)與雜交液II混合併預熱至59℃備用。根據待檢樣品的數目取6個1.5ml離心管，各管分別加入0.5ml雜交液I並預加熱至59℃。將PCR擴增產物97℃變性處理5分鐘後，置於冰水混合物中放置2-5分鐘。然後取1000μl雜交液I+2μl溶液I(1000∶2)混合溶液作為結合液4℃保存備用，並取溶液II∶溶液III∶溶液IV(1900∶200∶1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液III+10μl溶液IV)作為顯色液避光備用。
雜交前用蒸餾水充滿反應室，放置好金屬多孔板，打開水泵以排出多孔板上的水份。設定雜交儀溫度為59℃，首先將塑料墊片置於金屬多孔板上並將ApoE基因分型膜條置於塑料墊片上，蓋好矽膠分隔室和壓扣蓋。再在變性後的PCR擴增產物內加入59℃預熱的0.5ml雜交液I，混勻後加入雜交槽中溫育5分鐘並打開泵進行雜交導流。然後加入預熱的雜交液II清洗膜條(每孔1ml，重複洗3次)。設定雜交儀溫度為25℃(或室溫)並加入結合液(每孔1ml)。靜置2分鐘後泵出結合液，再加入室溫雜交液I清洗膜條(每孔1ml，各重複洗3次)。隨後加入溶液II靜置2分鐘後泵幹，最後加入新鮮配製的顯色液(每孔1ml)，顯色6～8分鐘並開泵抽乾顯色液觀察結果(參見附圖3)。
由圖3所示的結果可以看出，各探針顯色清晰可見，無非特異性雜交；根據附圖一所示的排列格式可判讀出這六種不同的基因型。
實施例4不同基因型樣品的反向斑點雜交基因分型檢測結果判定使用本發明的方法和試劑盒，對40份採自Alzheimer氏病患者的白細胞DNA樣品進行ApoE基因型檢測。結果檢出ε3/ε3(22例)、ε4/ε4(2例)、ε3/ε4(11例)、ε2/ε3(3例)、ε2/ε4(2例)，未檢出ε2/ε2純合型。
為了進一步證實本發明方法的準確性，對所有樣品的PCR產物進行序列測定。結果表明，使用本發明的試劑盒檢測的結果和測序結果完全吻合，特異性達100％。
序列表110中山大學安達基因股份有限公司120檢測載脂蛋白E基因型的方法和試劑盒140
141
1607210121120212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
4001GGCACGGCTG TCCAAGGAGC210221119212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
4002GCGCTCGCGG ATGGCGCTG210321120212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。
4003TGGAGGACGT GCGCGGCCGC210421119212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。
4004
GGAGGACGTG TGCGGCCGC210521121212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。
4005CTGCAGAAGC GCCTGGCAGTG210621120212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。
4006CTGCAGAAGT GCCTGGCAGT210721125212DNA213人工序列220
223根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。
4007TCTTCCAATA TCCGGTCCTG TTGAT
權利要求
1.一種檢測個體載脂蛋白E基因型的方法，該方法包括(1)提供待檢靶DNA樣品；(2)利用聚合酶鏈反應擴增體系擴增靶DNA片斷；(3)使被標記的靶DNA與特異性寡核甘酸探針雜交；(4)檢測雜交結合物並藉以判斷靶DNA的載脂蛋白E基因型，特徵在於聚合酶鏈反應擴增體系中使用的正向和反向引物分別是5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和5′-生物素-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ IDNO2)，並且雜交反應中使用的寡核甘酸探針分別是(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)。
2.根據權利要求1的方法，其中所說的DNA樣品是得自被檢者血液白細胞的人基因組DNA樣品。
3.根據權利要求1的方法所說的檢測是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點印跡雜交裝置完成的。
4.根據權利要求1的方法，其中所說的標記分子是生物素。
5.根據權利要求1的方法，其中所說的靶DNA的基因型包括3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
6.用於檢測人個體載脂蛋白E基因型的的試劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2)聚合酶鏈反應試劑；(3)雜交反應試劑，特徵在於聚合酶鏈反應擴增體系中所使用的正向和反向引物分別是5』-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3』(SEQ ID NO1)和5′-生物素-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，並且雜交反應中使用的寡核甘酸探針分別是(1)NH2-5』-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5』-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3』(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5』-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3』(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5』-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3』(SEQ ID NO6)。
7.根據權利要求6的試劑盒，其中所說的核酸提取試劑包括由DNA提取液和滅菌生理鹽水組成的提取待檢樣品DNA的抽提液。
8.根據權利要求6的試劑盒，其中所說的聚合酶鏈反應試劑包括由含有脫氧尿嘧啶核苷三磷酸的脫氧核糖核苷三磷酸、耐熱Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶組成的PCR反應混合液。
9.根據權利要求6的試劑盒，其中所說的雜交反應試劑包括雜交液I和II、溶液I、II、III和IV、膜條以及標準對照品。
全文摘要
本發明涉及檢測臨床血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因分型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點雜交技術快速檢測ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1786188SQ200410052530
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月7日 優先權日2004年12月7日
發明者王偉毅, 張太松, 何蘊韶, 程鋼, 汪華僑 申請人:中山大學達安基因股份有限公司