利用⁴⁵Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法

2023-09-19 22:49:20 2

專利名稱：利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法
技術領域：
本發明涉及轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣含量差異的鑑別，特別是涉及用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣含量差異的方法。
背景技術：
同位素示蹤技術是加入與目標元素性質幾乎完全相同的同位素，同位素與目標元素共同運行，通過同位素實現追蹤目標元素或被標記物質的運行或變化的一種方法。同位素可以是放射性同位素，也可以是穩定同位素。放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度高，測量方法簡便易行，而且具有能準確定量，準確定位及符合所研究對象的生理條件等特點。同位素示蹤技術在生命科學中應用極其廣泛，可用於考察某種元素在生命體中吸收代謝過程，可利用同位素示蹤技術研究光合作用，可利用同位素標記核酸研究生物基因的功能等。此外，放射自顯影可以在組織或細胞水平上捕獲物質轉移動態，而放射免疫測定法則是將同位素引入抗原抗體反應的一種方法，該法比螢光抗體法更靈敏，也更容易定量。同位素示蹤技術現已成為研究生物現象不可缺少的方法。鈣離子是細胞內的第二信使物質，Ca2+在植物耐熱信號轉導機制研究方面受到特別關注。研究表明，多種環境脅迫刺激都可能引起細胞內Ca2+的轉移運輸，說明鈣參與了植物的多種脅迫響應。張申宗、宰學明等採用Ca2+預處理顯著提高了其所研究的植物的耐熱性，因此細胞內自身鈣的含量是否與植物耐熱性存在某種關係，耐熱植物與普通植物自身所含鈣離子是否有差異，是非常值得研究的。通過轉基因的方法培育耐熱植物以及與此相關的耐熱機制的研究是前沿性的研究課題，國內外都鮮有報導。TRl (IhermoSesistancei)是四川大學生命科學院楊毅教授等採用基因工程技術發現的一個可提高植物及微生物耐熱性的基因，該基因經中科院、農科院等業內權威人士組成的 鑑定委員會專家組認為，這是一種定位於膜上的新型耐熱基因，在高溫脅迫下，與對照組相比，轉入該基因的水稻株系的花粉活力、結實率、單株產量等指標均有顯者提聞。溫度是影響植物生長成熟最為重要的環境因素之一。隨著全球溫室氣體排放增力口，溫室效應加劇，各種極端氣候頻繁發生，高溫已成為限制農作物生長的大問題。菜籽油是我國主要的食用油之一，研究培育對溫度有更好調控能力的高產油菜，對我國食用油安全至關重要。通過考察轉入耐熱基因後的油菜是否比普通油菜對鈣離子有更好的調控能力，研究耐熱基因在油菜中起到的抗逆性作用，對於培育對溫度有更好調控能力的高產油菜十分重要，但直到本發明完成之前，發明人未見有關這方面的研究報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，為研究培育對溫度有更好調控能力的高產油菜奠定基礎。
本發明提供的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，主要包括以下步驟:(I)油菜栽培:將普通油菜和轉基因TRl油菜種植在含有MS培養基的營養土中，於光照15-17小時/天，溫度23-25°C條件下培養45-55天，生長至真葉7_10片，分別取兩種油菜葉片提取原生質；(2)原生質體提取:將上述培養的兩種油菜葉片切成0.4-0.6mm絲狀分別置於酶解液中，在24-26°C酶解8-10h，酶解後的細胞懸浮液經100-120目尼龍網過濾，所得濾液經離心分離除去上清液，所得沉澱加入WI原生質體養護液，經離心洗滌得到原生質體；(3)原生質體活性鑑定:將步驟(2)提取到的兩種油菜的原生質體用螢光素酶FAD(Fluorescein Diacetate)染色觀察，選取鏡檢細胞存活率> 90%的原生質體進行吸收鈣離子實驗；(4)原生質體培養:將步驟(3)鏡檢符合要求的兩種油菜的原生質體分別置於含45Ca示蹤劑的WI原生質體養護液中培養If 13h ；(5)原生質體鈣離子吸收量測定:將經步驟(4)培養得到的原生質體用濃度90^110mmol/L的EDTA (乙二胺四乙酸)洗滌液洗滌除去原生質體表面的鈣，取0.1mL原生質體懸液經消解測量45Ca的計數，取0.1mL原生質體懸液用於原生質體數目計數，將剩下的原生質體懸液離心分離，取0.1mL上清液用於上清液計數，通過下式分別計算兩種油菜的原生質體吸收鈣離子量q以鑑別兩種油菜原生質體吸收鈣的差異:
權利要求
1.一種利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於主要包括以下步驟: (O油菜栽培:將普通油菜和轉基因TRl油菜種植在含有MS培養基的營養土中，於光照15-17小時/天，溫度23-25°C條件下培養45-55天，生長至真葉7_10片，分別取兩種油菜葉片提取原生質； (2)原生質體提取:將上述培養的兩種油菜葉片切成0.4-0.6mm絲狀分別置於酶解液中，在24-26°C酶解8-10h，酶解後的細胞懸浮液經100-120目尼龍網過濾，所得濾液經離心分離除去上清液，所得沉澱加入WI原生質體養護液，經離心洗滌得到原生質體； (3)原生質體活性鑑定:將步驟(2)提取到的兩種油菜的原生質體用螢光素酶FAD染色觀察，選取鏡檢細胞存活率> 90%的原生質體進行吸收鈣離子實驗； (4)原生質體培養:將步驟(3)鏡檢符合要求的兩種油菜的原生質體分別置於含45Ca示蹤劑的WI原生質體養護液中培養If 13h ； (5)原生質體鈣離子吸收量測定:將經步驟(4)培養得到的原生質體用濃度90^110mmol/L的EDTA洗滌液洗滌除去原生質體表面的鈣，取0.1mL原生質體懸液經消解測量45Ca的計數，取0.1mL原生質體懸液用於原生質體數目計數，將剩下的原生質體懸液離心分離，取0.1mL上清液用於上清液計數，通過下式分別計算兩種油菜的原生質體吸收鈣離子量q以鑑別兩種油菜原生質體吸收鈣的差異:
2.根據權利要求1所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，所述營養土中蛭石的重量含量為25 35%。
3.根據權利要求2所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，所述含有MS培養基的營養土為用MS培養基溶液拌溼的營養土。
4.根據權利要求1所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，0.1mL原生質體懸液消解測量45Ca的計數，是在樣品中加入0.1mL濃度14-15mol/L硝酸，在7(T80°C下消解l 3h，消解後將其全部轉移到IOmL液閃液中測量計數。
5.根據權利要求4所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，原生質體懸液消解測量45Ca的計數，原生質體懸液的原生質體數目的計數和上清液的計數均用液閃計數器測量計數。
6.根據權利要求1所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，切成0.4-0.6mm絲的油菜葉片置於酶解液中酶解於黑暗振蕩條件下進行。
7.根據權利要求1至6之一所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，所述原生質體用螢光素酶FAD染色觀察，是通過將原生質體懸液加入到FDA染色溶液，混勻染色1-2分鐘後，取混合液加載在玻片上加蓋片置於顯微鏡下，用藍色光照射觀察，若細胞出現綠色螢光則表示有活性，否則無活性。
8.根據權利要求7所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，FDA染色溶液的製取，是先將FDA溶於丙酮中，之後再將溶有FDA的丙酮混合液加入到甘露醇中製取。
9.根據權利要求1至6之一所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，鏡檢符合要求的兩種油菜的原生質體分別置於含45Ca示蹤劑隹丐離子濃度分別為 0.1mmol/L、0.3mmol/L、lmmol/L、3mmol/L、50mmol/L、100mmol/L 的培養液中培養11 13h。
10.根據權利要求1至6之一所述的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，其特徵在於，所述轉基因TRl油菜為分別轉入耐熱基因TRl的Z63-2、Z644-21和Z65 4-9的轉基因油菜。
全文摘要
本發明公開了一種利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，包括油菜栽培、原生質體提取、原生質體活性鑑定、原生質體培養和原生質體鈣離子吸收量測定。實驗結果證實，轉入耐熱基因TR1的原生質體，低Ca2+濃度時提高了油菜對Ca2+的吸收，而在高Ca2+濃度時，可以減少Ca2+進入細胞。本發明提供的利用45Ca鑑別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，為研究培育對溫度有更好調控能力的高產油菜奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/04GK103114126SQ201310031728
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者楊遠友, 劉寧, 廖家莉, 劉志斌, 楊毅, 楊吉軍, 唐軍 申請人:四川大學