藍細菌血紅蛋白基因及其在促進微生物及植物生長中的應用的製作方法
2023-09-19 22:45:55 1
專利名稱：藍細菌血紅蛋白基因及其在促進微生物及植物生長中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。更具體的說，本發明涉及一種促進微生物和植物生長的基因以及含有該基因具有加速生長的轉化體及其進一步涉及培育生長周期短的轉基因油菜。
背景技術：
傳統的抗生素工業以及近年來發展的基因工程菌高密度培養，都遇到發酵設備的供氧能力與生產菌株對氧的需求量之間的矛盾。氧是好氣性微生物進行能量代謝的重要物質，在正常狀態下,空氣中的氧在培養基中的溶解度大約只有
0.25mol/m3左右，而培養液中的氧還須經過氣膜、液膜、細胞團塊、細胞膜等一系列傳遞過程最後進入細胞內到達呼吸鏈，此過程需要克服相當大的阻力，供氧己成為微生物工業中提高產品產量的主要限制因素之一。目前，提高供氧水平通常從設備和操作角度考慮，例如，改進發酵罐設計、通氣攪拌優化配置、輸入富氧或純氧或加入化學物質增加液相中氧氣的溶解度等。這些方法都著眼於提高溶氧(DO)水平或氣液傳質係數，雖然有一定效果,但都不同程度地受到設備、能源或操作條件的制約，同時也使發酵工業成為一個高能耗的工業。隨著現代分子生物學技術的快速發展，在以溶氧為限制條件的生物反應器中，尤其是在
大規模、高密度微生物發酵和動植物細胞培養解決供氧問題領域，運用基因工程改造微生物，獲得利用氧能力增加的基因工程菌株是解決上述問題的有效策略和手段。
在農業方面，尤其在我國耕地面積有限的條件下，如何利用冬置閒田，對於提高農業產量具有重要意義。油菜是我國最重要的油料作物之一，"雙低"菜籽油中Q8不飽和脂肪酸含量高(60%以上)，是一種健康的食用油；低芥酸菜籽油的脂肪酸碳鏈長度和結構接近化石柴油，是一種適宜於生產生物柴油的植物油，已被歐美各國作為解決全球能源短缺的重要原料作物。雖與大豆、向日葵等夏季油料作物相比，油菜是越冬作物，但因油菜生長周期較長，在一定程度上與其他主要糧食作物如水稻生產周期相衝突，如果能夠培育出生長周期較短的油菜品種，則能夠充分地利用南方大量的冬置閒田，就會解決上述矛盾，從而會大大地提高油菜產量。
研究表明，血紅蛋白都能夠與氧可逆性地結合併運輸，從而能夠促進生物的生長與發育。透明顫菌血紅蛋白(VHb)能在限氧條件下，顯著促進大腸桿菌和釀酒酵母細胞生長，提高蛋白質合成能力，增加目的產物的產量；1997年，Holmberg等將透明顫菌(Vitreoscilla)的血紅蛋白基因轉化菸草後，能促進菸草的生長、提高菸草葉中葉綠素與尼古丁的含量等，並且花期明顯提前。血紅蛋白存在於動物、植物、細菌、真菌和藻類等生物體內，分析多種生物的血紅蛋白胺基酸序列顯示，它們擁有一個由"three-on-three"三明治式的a-螺旋組成的保守結構。這一結果說明幾乎所有的血紅蛋白均來自一個共同的血紅蛋白袓先。
為了解決上述在工業和農業中的問題，我們克隆出藍細菌SynechocystisspJPCC6803的血紅蛋白基因，並應用分子生物學技術證明了這個血紅蛋白基因具有促進微生物和植物生長的功能。
發明內容
本發明的目的在於提供了一種促進微生物和植物生長的基因SLR2097，該基因具有如SEQ.ID.No.l所示的核苷酸序列。本專利採用分子生物學方法從藍細菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因組DNA中克隆出了血紅蛋白基因SLR2097,速度快、效率高。該基因能夠促進微生物和植物生長，對培育高密度發酵菌株和生長周期短的作物有重要意義。
本發明還在於構建了原核表達載體pET-30a-SLR2097和酵母表達載體pYES2-SLR2097，分別轉化大腸桿菌和酵母，獲得了表達菌株，在以溶氧為限制條件和高密度微生物發酵領域有重要意義。
本發明還在於構建了植物雙元表達載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097並轉化農桿菌，將其轉化擬南芥和油菜，作物生長明顯加快。油菜轉化株種子萌發明顯加快，開花也明顯提前。
實現本發明的技術如下
根據NCBI資料庫中的藍細菌血紅蛋白基因的序列(8八000022.2)設計引物，用藍細菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因組DNA作為模板，從藍細菌中克隆了血紅蛋白基因SLR2097。
為了檢測該基因對細菌生長的影響，PCR和酶切鑑定正確的SLR2097陽性重組克隆質粒用KpnI和BamHI雙酶切後，回收目的片段SLR2097，並與同樣雙酶切回收的大腸桿菌原核表達載體pET-30a在16t:連接過夜，獲得陽性重組表達質粒pET-30a-SLR2097。用熱激法將構建好的pET-30a-SLR2097轉化大腸桿菌E coli DH5a感受態，然後測驗表達藍細菌血紅蛋白基因的大腸桿菌的生長曲線，發現該基因對大腸桿菌的生長有顯著促進功能。
為了檢測該基因對酵母生長的影響，用上述同樣的方法構建了酵母表達載體pYES2-SLR2097。將酵母表達載體pYES2-SLR2097轉化酵母PEP4感受態。然後測驗表達藍細菌血紅蛋白基因的酵母的生長曲線，發現該基因對酵母的生長有顯著促進功能。
為了進一步檢測該基因對植物生長的影響，我們構建了植物雙元表達載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097，並將其轉化農桿菌，用floral-dip法
轉化擬南芥和油菜，並調査轉基因植物生長情況，結果發現，該基因對擬南芥和油菜生長有明顯的促進作用，另外，轉基因油菜種子表現出萌發提前，花期也有所提前。
本發明的優點
1、 從藍細菌的基因組DNA中克隆血紅蛋白基因速度快、效率高。
2、 本發明克隆的血紅蛋白基因SLR2097在低氧條件下對大腸桿菌、酵母的生長有明顯的促進功能，在以溶氧為限制條件的生物反應器中，尤其是在大規模、高密度微生物發酵和動植物細胞培養解決供氧問題領域有重要意義。
3、 本發明將植物雙元表達載體轉化模式植物擬南芥，轉基因擬南芥表現出明顯的生長加快，對研究該基因在植物中的生物學功能有重要意義。
4、 本發明還將植物雙元表達載體轉化了油菜，轉基因植株種子萌發有所提前，花期也明顯提前，為解決油菜生長周期與其他主要糧食作物生產周期相衝突而導致全國大量農田冬季閒置問題提供了新方法。
圖l從藍細菌Synechocystissp.PCC6803中擴增SLR2097基因。M: marker; 1-2:血紅蛋白DNA片段的擴增。
圖2氧氣含量極度缺乏情況下，SLR2097轉基因菌株與非轉基因對照菌株的生長曲線。
圖3氧氣充足的情況下，SLR2097轉基因菌株與非轉基因對照菌株的生長曲線。圖4 SLR2097轉基因酵母和非轉基因對照菌株的生長曲線。圖5雙元表達載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097轉化農桿菌GV3101的鑑
定。M: marker; 1-2:血紅蛋白DNA片段的擴增;+:陽性對照；-:陰性對照。
圖6抗生素篩選擬南芥轉基因植株。
圖7轉基因擬南芥與非轉基因對照植株的生長比較。
圖8轉基因油菜與非轉基因對照植株的生長比較。
圖9在24h時，轉基因油菜種子與非轉基因對照種子的萌發率。
圖IO在48h時，轉基因油菜種子與非轉基因對照種子的胚根生長比較。
圖ll在72h時，轉基因油菜種子與非轉基因對照種子的胚根長度比較。
具體實施例方式
在本發明中所使用的術語，除非有另外說明， 一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體的實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。
本發明實施例中涉及的由發明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。
本發明中所使用到的微生物以及載體來源如下
1、 藍細菌Synechocystis sp.PCC 6803由江蘇大學環境學院寧德剛教授提供。
2、 pYES2由美國華盛頓州立大學的J. I. Gordon教授提供。
3、 大腸桿菌DH5a來源於江蘇大學生命科學研究院。
4、 PEP4細胞的尿嘧啶缺陷型來源於江蘇大學生命科學研究院。5、 載體pET-30a來源於江蘇大學生命科學研究院。
6、 載體pCAMBIA1300來源於江蘇大學生命科學研究院。
7、 農桿菌GV3101來源於江蘇大學生命科學研究院。
8、 農桿菌LBA4404來源於江蘇大學生命科學研究院。
9、 pMD18-T來源於TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。實施例一藍細菌血紅蛋白基因SLR2097的克隆
根據NCBI資料庫中血紅蛋白基因的序列(BA000022.2)設計了一對引物，正向引物HemoglobinF為[5'-ggtaccATGTCAACTTTGTATG-3']，反向引物HemoglobinR為[5'-ctgcag TCACTGATTAAGCACG-3']，由上海生物工程技術服務有限公司合成。用藍細菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因組DNA作為模板,PCR體系含l^iL的DNA模板，2pL的dNTP(終濃度為2mmol/L)， 2jiL的10xPCR緩衝液，HemoglobinF、 HemoglobinR各lML， 0.2nL的LA-Taq酶，用超純水補足總體積20 pL。反應程序為94。C預變性5 min;94。C變性40 sec， 57。C退火40 sec， 72。C延伸40sec;40個循環；最後72'C延伸10 min。
PCR產物進行1X瓊脂糖凝膠電泳(如圖l所示)，切膠回收目的片段，直接與pMD-18T Simple Vector 16。C連接過夜，轉化感受態細胞EcoliDH5a，經PCR和酶切鑑定確定陽性重組質粒，並由上海生物工程技術服務有限公司測序，核苷酸序列如SEQ.ID.No.l所示。
實施例二原核表達載體pET-30a-SLR2097和酵母表達載體pYES2-SLR2097的構建
以上PCR和酶切鑑定正確的陽性重組克隆質粒分別用Kpnl和BamHI雙酶切後，回收目的片段SLR2097，並與同樣雙酶切回收的表達載體pET-30a在16。C連接過夜，並將獲得的陽性重組表達質粒命名為pET-30a-SLR2097。將口￡1-3(^-SLR2097轉化感受態EcoliDH5a菌株，同時轉化pET-30a空載體作為對照，提取質粒，PCR和雙酶切鑑定。
用Kpnl和BamHI雙酶切後的表達載體pYES2與鑑定正確後回收的目的片段SLR2097在16t連接過夜，並將獲得的陽性重組表達質粒pYES2-SLR2097轉化酵母菌PEP4感受態細胞，PEP4是一個水解蛋白酶缺陷型菌株，含有少量相關的主要水解酶的細胞。因此，血紅蛋白能夠相對提高蛋白含量。同時轉化pYES2空載體作為對照。生長到對數期中後期的酵母細胞分別塗布到DOBA培養基上，30'C培養2 4 d。挑取單菌落到YPD液體培養基(2。/。 bacteriological peptone,1% yeast extract)中培養12h，收集菌體用含2。/。半乳糖不含葡萄糖的YPD液體培養基誘導表達12-16h。
實施例三:藍細菌血紅蛋白基因顯著促進大腸桿菌和酵母的生長為了驗證該血紅蛋白基因在氧含量發生變化時對生物生長的影響，我們按Sambrook的方法，將含有藍細菌血紅蛋白基因的原核表達載體pET-30a轉入大腸桿菌菌株DH5a中。在密封搖動狀態(氧氣極度缺)和搖動狀態(氧氣充足)狀態下控制接種量使各組合一致；除了氧氣含量外，各生長條件一致，重複三次。分別繪製細菌的生長曲線。結果發現，在氧氣含量極度缺乏(氧脅迫)情況下(密封搖動狀態，37°C， 300r/min)， SLR2097的轉基因菌株長勢明顯好於非轉基因對照(含有無SLR2097的空載體DH5a菌株)菌株，在對數生長期，SLR2097的轉基因菌株比非轉基因對照菌株生長明顯加快(圖2所示)， 而在氧氣含量充足條件下(搖動狀態，37°C， 300 r/min), SLR2097的轉基因菌株比非轉基因對照菌株生長也稍微加快(圖3所示)。在上述兩種情況下，SLR2097的轉基因菌株及非轉基因對照菌株都以氧充足時的生長好，氧脅迫時生長弱。
我們同時將含有藍細菌血紅蛋白基因的酵母表達載體pYES2轉入酵母菌株PEP4中，在密封搖動狀態(氧氣極度缺乏)和搖動狀態(氧氣充足)狀態下控制接種量使各組合一致;除了氧氣含量外，各生長條件一致，重複三次。分別繪製細菌的生長曲線。結果發現在兩種狀態下，與非轉基因對照菌株相比SLR2097的轉基因菌株生長較快(如圖4所示)。
實施例四雙元表達載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的構建將質粒載體pCAMBIA1300與CaMV35S-sGFP(S65T)-nos3'用BamHI與Xbal進行雙酶切。用試劑盒回收大約8 950bp與400bp的DNA片段，然後用T4DNA連接酶將二者連接。用同樣的方法將SLR2097連接到載體pCAMBIA1300-CaMV35S上。
實施例五擬南芥轉化及篩選
1. 植物培養
擬南芥種子在4°C暗處理48h後，播種於1/3 B5培養液浸泡過的蛭石中，23。C連續光照，光照強度為80-120 Mmolm,sec'1。在培養基上種植時，將擬南芥種子用70%酒精表面殺菌3—5min後，用10% Bleach浸泡滅菌10-15min，無菌水洗3-4次。滅菌後的種子播於1/2 MS固體培養基(含2%蔗糖，0.3%phytagel)上，23。C連續光照。
2. 農桿菌轉化
取40nl轉化農桿菌GV3101感受態細胞，加入1^1 (約300ng)構建好的雙元表達載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097， 2.5KV電擊轉化，然後迅速加入l毫升SOC; 28°C, 200rpm搖lh後，取200^1菌液塗布於含卡那黴素和利福平的LB固體培養基平板上；於28°C倒置培養l-2d。挑選克隆鑑定陽性菌落。通過菌落PCR鑑定農桿菌，使用前面所用的引物，能擴增出SLR2097長度的片斷，表明構建的雙元表達載體已轉入到農桿菌GV3101。 GV3101的菌落都能擴增出與載體一致的375bp的條帶(如圖5所示)，說明所構建的載體已轉入到GV3101中。3.擬南芥真空滲透轉化法
擬南芥培養至莖高3-10cm時，去其頂生花序，刺激腋生花序的生長。繼續生長4-6天後，即可用於轉化。將陽性農桿菌按千分之一接種於5mlLB液體培養基中(含終濃度為5(Vg/ml的利福平和終濃度為50pg/ml的卡那黴素)；28°C，200rpm振蕩培養48hr;然後將菌液倒入1L LB中，繼續培養至006為1.2-1.8 (約需48hr) 4000rpm室溫離心15min，收集菌體後，重懸於lL轉化液(2.2g MS; 5%sucrose; lxB5 Vitamins; 10mg/L的6-BA; SilwetL-77;用0.4MNaOH調pH至5.8)中將剪枝後4-6天的植株倒置於含轉化緩衝液的玻璃瓶中，抽真空，維持0.05Mpa壓力5min。取出種植盆，側放24hr。然後將種植盆直立，按常規的方法培育植株至結實，收穫成熟種子(Tl代)。
4.抗性植株的篩選及純系的獲得收取轉化後擬南芥T1代種子，播在含有潮黴素(30pg/ml)的1/2MS平板上篩選抗性的幼苗(如圖6所示)，轉入蛭石中，收穫T2代種子。再按株系播種於含潮黴素的平板，篩選具有3:1抗性分離比的株系，移栽抗性植株，收穫T3代種子，把T3代種子播於含潮黴素的平板上，沒有抗性分離的株系就是純系。在相同生長條件下轉基因純系植株和對照植株生長過程中，轉基因植株生長明顯比對照植株生長速度快(如圖7所示)。
實施例六油菜的轉化及篩選
1.植物材料的準備自然條件下生長正常的甘藍型油菜品系寧油16號，待其生長至花期。當油菜植株開始開花後2-3天對擬浸染的油菜植株進行初步篩選。理想的擬浸染油菜植株應該具有大量正在發育中花序，其花序上含有大量未開放的花蕾，和少量已經開放的油菜花朵和授粉的角果。在進行農桿菌介導的浸花法轉化前需要人工去除已經授粉的角果和花序頂端已經開放的花朵，最終用於浸染的植株
應該只具有未開的花蕾。植物材料的準備必須在浸花前8-12小時內完成，在浸花過程中如遇開放的花朵，需剪去後再進行浸花實驗。
2. 攜帶重組質粒的農桿菌的準備
在進行浸花實驗前2-3天，在5mL含有相應抗生素的LB液體培養基中小量培養轉化雙元表達載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的農桿菌LBA4404, 28°C 220 rpm，然後將5ml菌液接種到500mlLB培養基中，28°C 220rpm培養兩天。浸花前在菌液中加入3%的蔗糖、0.1%的Silwet L-77、 2ng/1的6-BA和8mg/1的乙醯丁香酮。
3. 浸花步驟
(1) 浸花前，檢査油菜花絮是否有盛開花朵，確認符合浸花植物材料後，將油菜的整個花序部分浸泡在農桿菌混合溶液中150s左右，同時輕輕晃動花絮，使其充分蘸取菌液。浸泡過後，待花蕾上的農桿菌菌液不再滴落，菌液又未乾涸的時候，及時將完成浸花的花絮套入羊皮紙袋遮陰，袋口用回形針紮緊，持續套袋生長24h，以保持花蕾具有較高的溼度，不會因陽光暴曬而致使農桿菌失去活性。
(2) 間隔48h重複步驟(1)，浸好的花絮依然套袋生長24h。
(4) 三次浸花結束後，去掉套在花絮上的羊皮紙袋，剪去新生出的側枝花絮以及經過浸花的花絮其頂端新萌發的花蕾。
(5) 定期剪除新生的側枝花絮及新生花蕾，正常的澆灌培養植株，因為轉化緩衝液中的蔗糖會導致害蟲滋生，因此還需要定期噴灑農藥殺蟲，直到種子
成熟時收穫幹種子(Tl代)。
4.抗性植株的篩選及純系的獲得
收取轉化後油菜T1代種子,用含有100mg/l潮黴素的水溶液浸泡24-36h，播種到土壤中，收穫T2代種子。再按株系用潮黴素水溶液浸泡種子播種到土壤，篩選具有3:1抗性分離比的株系，收穫T3代種子，同樣用潮黴素水溶液浸泡T3代種子播種，沒有抗性分離的株系就是純系，在相同條件下生長的轉基因植株比對照植株生長速度快，並且花期也提前一周左右(如圖8所示)。實施例七油菜種子的萌發試驗
選取四株轉基因株系(H12、 H18、 H21、 H23) T3代種子和對照植株的進行了萌發實驗，具體實驗步驟如下
用雙層濾紙培養，先在潔淨的直徑為9cm的培養皿內底放濾紙一張，選取四株轉基因株系(H12、 H18、 H21、 H23) T3代種子和對照植株飽滿種子IOO粒擺放到濾紙上，再在種子上面蓋一張濾紙，然後每皿滴加2ml水使上層濾紙溼潤，傾斜時皿底無溶液。將培養皿室溫條件下暗培養，間隔24h統計發芽勢和發芽率，共計72h，重複三次。如果胚根出現就記作萌發，在萌發24h和48h時，轉基因株系的萌發率顯著高於對照植株。在24h、 48h和72h，所有轉基因株系比對照植株明顯提前。如圖9所示，為24h時每個培養皿中種子的萌發率。48h時，轉基因株系與對照植株都已經萌發，但轉基因株系的胚根明顯比對照植株長，如圖10所示。72h時轉基因植株與對照植株胚根長度有顯著差異，如圖11所示。SEQUENCE LISTING江蘇大學
藍細菌血紅蛋白基因及其在促進微生物及植物生長中的應用
1
Patentln version 3.3
1<211〉 375 DNA
Synechocystis PCC6803 1
atgtcaactt tgtatgaaaa attaggtgga accaccgctg tcgatctagc tgtggacaaa 60ttttacgagc gggtgttgca ggatgaccgc atcaaacatt ttttcgccga cgtggatatg 120gctaaacaac gggcccacca aaaagccttt ttaacctatg cctttggcgg tacggataaa 180tatgatggtc gctatatgcg ggaagcccac aaagagttgg tggaaaacca tggtttgaac 240ggtgaacact tcgacgcagt ggcggaggat ttgctggcaa ccttgaagga aatgggtgtt 300cccgaagatt taattgcaga agtggccgcc gtggccgggg ctccagccca taaacgggac 360gtgcttaatc agtga 375
1權利要求
1、一種表達載體，其含有SEQ.ID.No.1所示的藍細菌血紅蛋白基因SLR2097。
2、 根據權利要求1所述的表達載體，是pET-30a-SLR2097。
3、 根據權利要求1所述的表達載體，是酵母表達載體pYES2-SLR2097。
4、 根據權利要求1所述的表達載體，是植物雙元表達載體pCAMBIAl 300-CaMV35S-SLR2097 。
5、 SEQ. ID. No.l所示的藍細菌血紅蛋白基因SLR2097在促進微生物和植物生長中的應用。
6、 根據權利要求5所說的藍細菌血紅蛋白基因SLR2097在促進微生物生長中的應用，其特徵在於，是先構建含藍細菌血紅蛋白基因SLR2097的表達載體，然後將表達載體轉入微生物中培養表達。
7、 根據權利要求5所說的藍細菌血紅蛋白基因SLR2097在促進植物生長中的應用，其特徵在於，是先構建含藍細菌血紅蛋白基因SLR2097的表達載體，然後通過該表達載體將SLR2097導入目標植物中，獲得轉基因植物。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域。具體涉及一種促進微生物和植物生長的基因以及含有該基因具有加速生長的轉化體及其進一步涉及培育生長周期短的轉基因油菜。所說的促進微生物和植物生長的基因具有SEQ.ID.No.1所示核苷酸序列。通過構建該基因的表達載體，將其轉入微生物或植物中，能有效促進微生物和植物的生長。
文檔編號C12N15/63GK101671691SQ200910232918
公開日2010年3月17日 申請日期2009年10月9日 優先權日2009年10月9日
發明者孔凡明, 寧德剛, 張志燕, 朱福各, 娟 李, 政 王, 譚小力 申請人:江蘇大學