生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法

2023-09-19 18:31:45 1

專利名稱：生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，特別是涉及轉基因—克隆技術領域。
背景技術：
轉基因動物研究是人類按著自已的意願有目的、有計劃、有根據、有預見地改變動物的遺傳組成，而改變其遺傳組成的目的是多種多樣的。比如遺傳學家希望通過改變動物的遺傳組成來觀察其表型變化，生理學家希望通過特定基因的表達來研究該基因對機體生理狀況的影響。與動物生產有關的轉基因研究則希望通過轉基因技術來賦予動物新的表型性狀。該項研究在實驗技術上依賴分子生物學、動物胚胎和配子操作技術。
轉基因動物的製作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，逆轉錄病毒感染髮育早期的動物胚胎，精子載體法，ES細胞技術，PGCs技術，體細胞核移植技術，逆轉錄病毒載體感染MII期的卵母細胞，精子頭與DNA合併注射卵母細胞法。這些方法上的改進與提高大大地促進了轉基因動物研究由實驗室向生產實踐轉化的進程。
其中最傳統和最常用的方法是原核期胚胎的顯微注射，該方法由美國人Gordon發明，是目前應用比較廣泛、效果比較穩定的製作轉基因動物的方法之一。即在顯微操作儀下通過一毛細玻璃管將外源DNA注射進動物受精卵細胞的原核內，再將該受精卵細胞移植進受體細胞子宮內，在受精卵分裂時，外源DNA可能整合入宿主染色體組，待該受精卵發育成熟即可獲得轉基因動物。但是顯微注射法獲得的轉基因家畜的效率極低，特別是牛，羊和豬等，往往低於1％，這將大大增加製作轉基因家畜的成本。
隨著體細胞克隆技術的發展，基因操作技術與克隆技術相結合是將成為轉基因動物，特別是大家畜生產的主要方式。目前，取得的主要進展是轉基因技術和靶位操作技術在克隆動物上的應用。首先，利用克隆進行轉基因是指在核移植前，先把目的基因和標記基因的融合基因導入培養的體細胞，再通過標記基因的表現來篩選轉基因的陽性細胞及其克隆，然後再移植。1997年，英國PPL公司的科學家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯手通過體細胞核移植技術率先在世界上製作了轉基因綿羊。利用胎兒成纖維細胞系，經過轉染之後，再克隆。被轉染的外源基因含有人的凝血因子IX基因的完整編碼區和β-BLG基因啟動子，凝血因子IX能被高效表達，每毫升奶中包含125μg的凝血因子IX蛋白。利用克隆進行轉基因，一旦核移植成功，從理論上講，轉基因成功率為100％。原核注射的方法會使大量的非轉基因胚胎被懷孕，這是一種資源浪費，而利用克隆進行轉基因技術不會造成代理母親去懷孕非轉基因動物。此外，利用克隆進行轉基因時，轉基因動物的性別會被提前決定。這樣的話，如果想得到能在乳腺中表達蛋白質，就可以使克隆的轉基因動物全是雌性動物。
由於動物轉基因技術能按照人們的意願改變動物的生產性狀，得到人們所需要的產品，特別是一些蛋白藥品及保健品，科學家們已經開始將動物轉基因技術應用到實踐當中，目前動物轉基因技術主要有以下一些應用(1)、促進動物生長、提高畜產品產量、改善產品品質，(2)、動物抗病育種，(3)建立診斷和治療人類疾病的動物模型，(4)生產藥用蛋白。
動物乳腺生物反應器是一種利用動物轉基因技術在乳腺細胞中表達多肽藥物、工業酶、疫苗和抗體等蛋白的技術。通過基因工程的方法改造乳腺的功能有利於我們進一步研究乳腺癌的機制，提高乳汁的營養成分，甚至可以合成藥物。該技術具有低投入高產出的特點，其效率是利用以大腸桿菌和動物細胞培養技術的一百倍，是一種非常有潛力的高新技術。1987年，Simons等人在轉基因小鼠乳腺中首次成功地表達羊乳球蛋白基因，並且小鼠奶樣中的蛋白含量高達23克/升，大約是動物細胞表達蛋白的400倍以上。該技術一經出現就得到迅猛的發展。目前，牛乳白蛋白基因人組織血纖維蛋白溶酶原因子，人生長激素基因，人體抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人幹擾素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表達。許許多多的著名科學家都認為這將是畜牧業前所未有的革命，可能會給社會帶來巨大的經濟效益。
乳腺生物反應器生產藥物的優越性讓藥物蛋白基因表達在某一特定部位，而不是隨機地在身體任意表達。科學家們一致認為，就藥物而言，理想的表達場所是乳腺。主要有以下原因1、動物乳腺是一個封閉的系統。乳腺組織表達的蛋白質絕大部分不會回到血液循環，這樣就避免大量表達的外源性蛋白質對動物健康造成的危害。2、乳腺組織是一種有效的蛋白質合成器。一頭奶牛一年可生產乳蛋白250～300kg，一隻綿羊和山羊可生產乳蛋白25～30kg，即使一隻家兔，一年生產乳蛋白也可達到3～5kg，如果把百分之一的乳蛋白合成醫用蛋白，其產量就十分可觀。3、乳腺組織可以對人體蛋白質進行正確的修飾和後加工，產品的生物學活性接近天然產品。4、在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳。一旦獲得一個生產某種有價值蛋白質的動物個體，可以用常規畜牧技術繁殖生產群體，研究技術雖然複雜，費用高昂，但其研究生產的放大過程卻較容易5、縮短新藥上市周期。從藥物生產開發周期方面來看，目前一種新藥從它的研製開發、藥審，直到上市，整個過程需要10～15年，如果利用轉基因動物乳腺反應器，新藥生產的周期約5年。6、可以獲取巨額經濟利潤。如荷蘭金髮馬公司用轉基因牛生產乳鐵蛋白，預計每年從乳汁中提煉出來營養奶粉銷售額是50億美元。
利用乳腺生物反應器的方法改造奶牛、奶山羊，使生產出的奶成分近似於人奶，既有營養的功能，又有藥用的功能，這種奶可以使孩子長得高大，促進大腦和神經發育，增強免疫功能，這種新型保健品一定會有廣闊的前途。改善奶的營養成份或生理生化特徵也是人們希望通過改變動物的遺傳組成來實現的目標之一，即製造所謂的營養藥品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工產品可提供人類30％的營養蛋白，含有豐富的必需胺基酸、鈣和無機磷酸鹽，以及消化率很高的酪蛋白，是人類高質量的營養來源；但乳用家畜奶在品質上還不盡如人意。因此，人們一直在研究如何改善奶品質。自Gordon創立動物轉基因技術以來，世界各國都爭先開展轉基因育種及其相關技術研究。研究表明外源基因不僅能在轉基因動物中得到整合與表達，而且能獲得組織特異性(乳腺組織、輸卵管)和發育特異性表達，並且現在能夠利用分子技術找到調節乳成分的所有基因。
牛乳的蛋白含量比人乳的高，牛乳為33g/L，而人乳僅為10g/L。其中最重要的是人乳中乳清蛋白含量(68％)比酪蛋白(32％)比例高，具有免疫活性的乳鐵蛋白(15％)和溶菌酶(4％)含量高，且缺乏β-乳球蛋白和κ-酪蛋白。然而，牛乳中含有較高的各種酪蛋白，相應的乳清蛋白含量較少。蛋白牛乳中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是主要過敏原，新生兒大約7.5％有腸胃、皮膚和呼吸過敏反應，這有望通過轉基因技術封閉、缺失β-乳球蛋白基因或在牛乳腺細胞中插入人乳蛋白基因來調節它的表達水平，從而使牛乳更加接近人乳，滿足消費者需求。動物生物反應器是目前世界範圍內轉基因研究的熱點之一，不僅各國政府投資，一些私人財團也不惜投入大量資金加以研究和開發。
人乳鐵蛋白(Human lactoferrin，HLF)是一種屬於鐵結合蛋白家族的糖基化蛋白，由Sorensen首次發現，並由Blanc和Isliker命名。乳鐵蛋白可以可逆性地結合兩個鐵離子，其離子結合強度是運鐵蛋白(在體內對鐵起運輸作用的主要蛋白)的300倍。人乳鐵蛋白由692個胺基酸組成，分子量約為80,000Da。在乳鐵蛋白內有兩個具有鐵離子結合能力的葉狀結構，一個是氨基端區，即N-葉(N-lobe)，另一個為羧基端區，即C-葉(C-lobe)。兩區間有40％的同源胺基酸序列。每個區能結合一個鐵離子，同時結合一個二價碳酸根陰離子。人乳鐵蛋白為N端連接的糖基所修飾。經酶促反應，一個寡聚糖苷鏈以共價鍵結合在以Asn-Xaa-Thr/Ser順序排列的天冬醯胺酸殘基上。人乳鐵蛋白有三個可能被糖基化的位點，分別位於C葉的第138的天冬醯胺酸殘基、N葉的第479、624天冬醯胺酸殘基上。在三個位點中，位於138、479的天冬醯胺酸殘基優先被糖基化，第624的天冬醯胺酸殘基的糖基化受第479位天冬醯胺酸殘基糖基化的限制。乳鐵蛋白廣泛存在於哺乳動物的體液和嗜中性粒細胞的次級顆粒中，乳鐵蛋白具有的生理功能主要包括廣譜的抗菌功能、抗炎症功能和免疫生理調節功能。這些功能是通過乳鐵蛋白直接獲取鐵離子或結合在細胞表面而使菌體細胞通透性增加實現的。乳鐵蛋白可結合發生炎症區域的鐵離子，從而阻止游離的鐵離子參與催化有害的氧化反應。乳鐵蛋白同時也能影響T細胞的擴增反應。一些研究表明，乳鐵蛋白在體內的抗菌作用遠比體外強。這可能是由於乳鐵蛋白上存在著抑菌和潛在的免疫調節功能區。在體內，乳鐵蛋白通過與體內的細胞結合而發揮抗菌和免疫調節作用。人乳鐵蛋白的許多生理功能的發揮有賴於與特異性細胞受體的結合。現已發現人乳鐵蛋白受體存在於多種細胞，如腸細胞，血小板，哺乳動物上皮細胞，淋巴細胞等。其它人乳鐵蛋白潛在的功能還包括對骨髓細胞生成的調節，有氧代謝的產生，生長因子作用，DNA結合功能，以及潛在的RNA酶功能。但有些關於乳鐵蛋白功能的研究結果是有爭議的。它的某些生物學功能還不甚明了，尚有待於進一步的研究工作闡明。
乳鐵蛋白具有著廣泛的生物學活性其主要表現在(1)..對嬰兒鐵代謝的作用。一些實驗說明乳鐵蛋白能夠促進嬰兒的鐵吸收，在恆河猴和人的實驗中則發現乳鐵蛋白對鐵吸收沒有明顯的促進作用。(2).抗微生物作用。乳鐵蛋白是人體內的一種廣譜抗微生物蛋白，對病原性的細菌，真菌，原生動物，病毒均有殺傷作用。(3).在炎症反應中的作用。乳鐵蛋白可以通過多種不同的途徑來調節炎症反應。a.調節補體激活途徑。乳鐵蛋白可以阻斷經典途徑中的C3轉換酶，使補體因子C3沉積，從而阻止補體介導的紅細胞裂解。b.脫鐵乳鐵蛋白可以強烈地結合自由鐵，從而限制了活性氧自由基的產生，並進一步抑制了活性氧自由基對細胞的損害，阻止細胞膜脂類的過氧化。c.乳鐵蛋白可以快速動員多形核單核細胞遷移至炎症部位。d.乳鐵蛋白可以影響多種細胞因子的產生，這些細胞因子在炎症反應中發揮著極重要的作用。體外實驗表明，乳鐵蛋白可以抑制脂多糖誘導的單核細胞產生IL-1，IL-6和TNF-α，IL-1的減少引起了GM-CSF的減少，進一步抑制了骨髓細胞的生成。此外，乳鐵蛋白可以增強人多形核白細胞對IL-8的分泌。e.乳鐵蛋白可以與脂多糖結合。其結合部位位於N端1-5和28-34兩個空間位置鄰近的區域。乳鐵蛋白與脂多糖結合蛋白競爭結合脂多糖，因此降低了脂多糖結合蛋白介導的脂多糖與CD14的結合，起到調節炎症反應的作用。(4).其它作用。在患有帕金森氏綜合症鼠的腦中，檢測到乳鐵蛋白的增強表達，說明乳鐵蛋白在機體防禦帕金森氏綜合症中發揮一定的作用。此外在多自身免疫疾病病人身上檢測了乳鐵蛋白的抗體，如類風溼性關節炎、脈管炎、系統性狼瘡、初級硬化脈管炎，說明乳鐵蛋白在這些疾病的治療和診斷中具有一定的作用。最近，有人還發現乳鐵蛋白可以抑制腫瘤細胞的生長和轉移。
人乳鐵蛋白的多功能屬性引發了人們對其編碼基因的研究，以便在此基礎上對該蛋白進行大規模生產。M.J.Powell等人和M.W.Rey等人在1990年首次分別發表了人乳鐵蛋白的cDNA序列和部分基因組序列。後來的研究表明，人乳鐵蛋白位於人的第三號染色體q21-q23的位置，全長約35kb，共有17個外顯子組成，內含子的大小在300bp-3.3kb之間。基於人乳鐵蛋白基因的研究，許多研究者開始致力於人乳鐵蛋白轉基因的研究，以了解通過轉基因的方式大量生產重組人乳鐵蛋白的可能性及重組人乳鐵蛋白的性質。人乳鐵蛋白轉基因研究的最終目的是通過轉基因技術生產大量功能上與人乳鐵蛋白相同或相近的重組人乳鐵蛋白，使之為人類造福。
過去人們曾以真菌、酵母菌、植物、動物細胞系、動物為宿主，進行了人乳鐵蛋白轉基因研究。下表概括了該方面研究的情況。
表1 人乳鐵蛋白轉基因研究的概況Table 1 The outline of the HLF transgenic studyTransgenic hLF Promoter rhLF ExpressingPublished year
host sequence level authorFungi2.3kb300bp5μg/ml(total) 1992，Pauline P.
(Aspergillus cDNA A.nidulans alcA 1.5μg/ml(secreted)Ward，et alnidulans) promoter (ELISA analysis)1Fungi2.1kb1.1kb 2,000μg/ml(secreted) 1995，Pauline P.
(Aspergillus cDNA glucoamylase gene(ELISA analysis) Ward，et alawamori) promoterYeastFull length Yeast 20-30μg/ml(total)1993，Qianwa(Saccharomyces cDNA chelatin promoter 1.5-2.0μg/ml Liang，et alcerevisiae) (secreted)2Baby-hamster 2.3kb full MT-1 20μg/ml(secreted)1991，Stowellkidney cells length cDNA promoter (Determined by theK.M.，et alA280 of the pooled columnfractions)Tobacco cellsFull length CaMV 35s 0.6-2.5％ of the total1994，Amitava(Nicotiana tabacum cDNA promoter cellular protein Mitra，et alL.)Tobacco 2.1kb full DP35ScaMV(1)0.1％ of total 1998，ValériePlantlength cDNA promoter extracted leaf proteinsSalmon，et al.
(2)0.3％ of totalextracted leaf proteins3(ELISA)Potato plant 2.3kb full 1.Mas P2 (1)0.01％of total 2000，Daniel K.X.
length cDNA promoter soluble proteinet al2.CaMV 35s (2)0.1％of totalpromoter soluble protein4(ELISA analysis)Mice Full length 7.7kb0.1-36μg/ml 1994，Gerard
cDNAasl-casein (RIA analysis) J.Platenburg，et alpromoterMice Genomic 6.2kb＞1,000μg/ml1993，De Wit，sequenceasl-casein gene I.C.M，et alpromoterMice 1.hLF asl-casein 400-1,300μg/ml 1997，Jan H.
cDNAgene promoter300-3,800μg/ml Nuijens，et al.
2.hLF (RIA analysis)6genomicsequenceMice 2.5kb hLF 2kb bovine 1-200μg/ml71994，1997，SuncDNAβ-casein gene (ELISA analysis) Jung Kim et alpromoterMice 27kb10kb bovine 60-6,600μg/ml8 1999，Sun Junggenomic β-casein gene (ELISA analysis) Kim，et alsequencepromoterCattle Genomic 6.2kb300-2,800μg/ml9 2002，Patrick H.C.
sequenceasl-casein gene (ELISA analysis) Van Berkelpromoter在過去的研究中，人乳鐵蛋 cDNA曾廣泛用於各類轉基因研究中。這主要是因為人乳鐵蛋白cDNA比基因組全序列基因更易獲得，由於cDNA序列較短，也更易於被構建到表達載體中去。同時，cDNA可用於原核生物的表達，也使它較早地被用於轉基因研究中。Qianwa Ling等1993年首次報導了重組人乳鐵蛋白在酵母菌中表達的研究。在該研究中，人乳鐵蛋白和酵母菌蔗糖酶信號序列區分別用於引導重組人乳鐵蛋白的分泌。含酵母菌蔗糖酶信號序列的酵母菌有較高的重組人乳鐵蛋白表達量，而含人乳鐵蛋白信號序列的酵母菌則重組人乳鐵蛋白的表達量很低。在真菌中，Aspergillus菌種在自然條件下分泌糖基化蛋白，這種屬性使它成為一種理想的表達重組糖基化蛋白的宿主，現在它已經用於糖基化蛋白的商業化生產。已經有用人乳鐵蛋白基因轉化Aspergillus nidulans和Aspergillus awamori的報導。在此兩項研究中，在宿主中高表達的基因的啟動子用於引導重組人乳鐵蛋白的表達。在Aspergillusawamori中，人乳鐵蛋白cDNA和在Aspergillus awamori高效表達的葡糖糖化酶基因連接在一起，中間用KEX-2切割位點隔開。經過翻譯，融合蛋白用KEX-2切割，形成單獨的重組人乳鐵蛋白。在此研究中，在表達重組人乳鐵蛋白的轉化子中引入突變，可獲得較高的重組人乳鐵蛋白的表達量(2,000μg/ml)。此表達量是迄今為止在酵母菌、真菌、細胞系的人乳鐵蛋白轉基因研究中重組人乳鐵蛋白表達量最高的。這可能是因為採用了融合的方法進行轉染並把Aspergillus awamori作為轉基因宿主的緣故。根據以往研究的結果，轉基因所用宿主、啟動子和分泌信號區序列顯著影響著重組人乳鐵蛋白在酵母菌、真菌、細胞系中的表達水平。由於人乳鐵蛋白抗菌的作用，影響了一些酵母菌和真菌的正常生長，在培養後達不到較高的濃度，它們的生長被分泌的重組人乳鐵蛋白所抑制。這樣，選擇對重組人乳鐵蛋白抑菌作用不敏感的細菌就顯得很重要。當轉基因寄主的自身基因的啟動子和信號區序列用於轉基因研究時，往往會得到較高的外分泌重組人乳鐵蛋白的表達水平。到目前為止，還沒有人乳鐵蛋白全基因在真菌和細胞系內進行轉基因研究的報導。在這方面還有進一步研究的餘地。
1993年，Gerard J.Platenburg等首次報導了人乳鐵蛋白基因轉基因小鼠獲得了成功。早期該領域的研究僅局限於人乳鐵蛋白cDNA。後來的研究發現，攜帶有人乳鐵蛋白基因組全序列的轉基因小鼠分泌的重組人乳鐵蛋白的量遠高於攜帶有人乳鐵蛋白cDNA的量。1997年Jan H.Nuijens等分別用人乳鐵蛋白cDNA和人乳鐵蛋白全基因組序列片段與ALPHAsl-casein基因啟動子相連接構建成乳腺組織特異性表達載體。結果顯示，cDNA轉基因小鼠重組人乳鐵蛋白的表達範圍為400-1,300μg/ml，而在基因組全基因片段的轉基因小鼠中為300-3,800μg/ml。在1999年Sun Jung Kim等進行的轉基因實驗中顯示，在同時用Beta-casein作為啟動子的情況下，含人乳鐵蛋白基因全序列片段的轉基因小鼠的泌乳量最高可達6,600μg/ml，而用cDNA得到的轉基因小鼠的重組人乳鐵蛋白的表達量不超過30μg/ml。在有些情況下，用cDNA作為轉基因材料可得到較高的重組蛋白的表達量。如人體蛋白C的cDNA[51]，人IGF-1cDNA，和人EPO cDNA等。但在另外一些情況下，用cDNA轉基因得不到高表達量。為此，有研究採用了模式附著元件(matrix attachment elements，MARs)，位點控制區域(locus control regions，LCRs)，或YAC克隆等克服位置效應，以獲得高表達量的重組外源蛋白。以往的工作表明，有一些基因的內含子內存在著正向的或負向的調控元件，調控著基因的表達。人乳鐵蛋白轉基因的研究表明，在人乳鐵蛋白基因內部存在著重要的調控元件，對人乳鐵蛋白的表達發揮著正向的調控作用。現在尚需進一步的研究以調查人乳鐵蛋白內含子內調控元件對表達起調控作用的機理。過去，對哺乳動物的人乳鐵蛋白轉基因的研究主要局限在小鼠上，對大家畜少有涉及。對牛、羊等大家畜進行人乳鐵蛋白的轉基因研究將是下一步的發展方向。

發明內容
本發明針對上述現有技術的空白，擬將基因工程技術，細胞轉染技術與體細胞克隆技術相結合，採用含有完整人乳鐵蛋白基因的長約150kb的BAC序列作為轉基因結構，提供一種生產轉有人乳鐵蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的方法，用以大規模生產具有生物活性的重組人乳鐵蛋白。
生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)利用含有完整人乳鐵蛋白基因的hLF BAC DNA作為乳腺特異表達載體，(2)將hLF BACDNA與雙標記選擇載體或單標記選擇載體按比例混合，導入動物體細胞核內，進行細胞轉染，獲得轉入hLF BAC DNA的轉基因細胞，(3)細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有hLF BAC DNA的轉基因克隆動物。
所述特異性表達載體是長約150kb的hLF BAC DNA，重組人乳蛋白的轉基因小鼠模型中表達的人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白大小一致，具有與天然人乳中乳鐵蛋白相同的免疫活性。
所述轉基因小鼠的人乳鐵蛋白基因表達量為0.5-7.8g/l。
所述雙標記選擇載體是pEGFP-NEO，所述單標記選擇載體是pNEO。
所述hLF BAC DNA與雙標記選擇載體或單標記選擇載體混合的摩爾比為1∶3。
所述導入方法是體細胞顯微共注射。
所述轉基因細胞是通過G418進行篩選獲得的陽性細胞。
所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
所述大型家畜為牛。
本發明利用含有人乳鐵蛋白基因的長約150kb的HLF BAC(包括約90kb的5』調控區，約30kb的編碼區及30kb的3』調控區)作為轉基因結構，通過受精卵原核胚顯微注射法獲得轉有全長HLF BAC DNA的轉基因小鼠，重組人乳鐵蛋白在每隻陽性母鼠乳腺重都檢測到穩定表達，表達量為0.5-7.8g/l，表明利用完整的人乳鐵蛋白基因表達系統可以在其它哺乳動物乳腺中獲得高效特異的表達，也表明用長片斷DNA可以減少位置效應對轉基因表達的影響。
對於大片段DNA(100kb以上)的細胞轉染國內外鮮有文獻報導，本發明也嘗試了很多方法，但由於目的基因太長，採用電擊方法和其它細胞轉染方法進行細胞轉染難以獲得陽性細胞。本發明將在小鼠乳腺中得到高效表達的HLF BAC DNA與雙標記選擇載體pEGFP-NEO或單標記選擇載體pNEO按摩爾比例(1∶3)混合，進行細胞轉染，通過顯微共注射法導入動物體細胞基因組中，通過G418進行篩選獲得陽性細胞。陽性細胞再單克隆培養及擴增，經PCR檢測有150kb的HLF BAC NDA的轉基因細胞才能進行體細胞克隆，獲得轉基因克隆牛。經PCR和Southern檢測，共獲得兩頭轉有含全長人乳鐵蛋白基因的HLF BAC的轉基因克隆牛。根據轉基因小鼠中重組人乳鐵蛋白表達情況，可以推測這些轉基因牛也將高效表達具有生物活性的人乳鐵蛋白。這些轉基因奶牛乳腺特異表達的重組人乳鐵蛋白將可以開發成保健品和藥品，含重組人乳鐵蛋白的牛奶也可直接開發成高附加值的保健牛奶及奶製品。
利用乳腺特異表達的基因調控元件與目的基因構建成乳腺特異表達載體，將該載體導入動物基因組，從而獲得能在乳腺特異高效表達外源藥用蛋白的轉基因動物即動物乳腺生物反應器。乳腺組織可以對人體蛋白質進行正確的修飾和後加工，產品的生物學活性接近天然產品，因此動物乳腺生物反應器是一種利用動物轉基因技術在乳腺細胞中表達多肽藥物、工業酶、疫苗和抗體等蛋白的技術。這樣，轉基因克隆動物就成為了「製藥工廠」，為醫用蛋白和蛋白保健品的開發和生產開闢了廣闊的應用前景。
本發明探索和完善了細胞轉染技術和體細胞克隆技術相結合生產攜帶完整長片斷的外源功能基因的轉基因動物的途徑，並極大提高了轉基因動物，特別是轉基因大家畜的製作效率，本發明所使用的技術路線適於利用這種長片斷DNA作為轉基因結構進行轉基因牛、山羊、綿羊、豬和兔的基礎群生產和擴繁。


圖1hLF轉基因小鼠Southern雜交結果數字代表小鼠號，P代表陽性對照，N代表陰性對照。
圖2減性緩衝液變性後hLF轉基因小鼠乳清樣SDS/PAGE膠電泳泳道5，6為hLF轉基因陽性小鼠的乳清樣，泳道7為人乳清樣，泳道9為人乳鐵蛋白標準樣，泳道10為蛋白分子量標準物，其它泳道為非轉基因小鼠乳清樣。
圖3減性緩衝液變性後hLF轉基因小鼠乳樣western雜交結果第l至7泳道為hLF轉基因陽性小鼠的乳清樣8泳道為人乳清樣，作為陽性對照；9泳道為非轉基因小鼠乳清樣，作為陰性對照；第10泳道為蛋白分子量標準物。
圖4雙標記選擇載體pEGFP-NEO的結構圖EGFP為增強綠色螢光蛋白基因，NEO為新黴素抗性基因，IRES為核糖體結合位點，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，CMV-IE Enhancer為CMV-IE增強子，pEF321為EF321啟動子。
圖5單標記選擇載體pNEO的結構圖
NEO為新黴素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，pPGK為PGK啟動子，Amp為氨苄抗性基因。
圖6hLF轉基因克隆牛的PCR檢測M100bp marker，A為hLF 5』引物，B為hLF引物，ChLF 3』引物.1為鐵娃，2為祥娃，3為陽性對照，4為陰性對照，5為空白對照。
圖7hLF轉基因克隆牛的Southern結果。1鐵娃；2祥娃；3陰性對照；4-6分別為1，5和10個拷貝的陽性對照。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1實驗材料1.1質粒及菌株宿主菌大腸桿菌DH5α和DH10B，pIRES-NEO和pCMV-EGFP-IRES-NEO購自Clontech公司。
1.2實驗動物Holstein奶牛約3月齡的胎兒取自屠宰場，黃牛卵巢來自北京周邊地區屠宰場。
1.3主要試劑DMEM/F12粉末、DMEM粉末培養基、臺盼藍(trypan blue)、TCM199粉末，穀氨醯胺和G418為Gibco公司產品胎牛血清為Hyclone公司產品；dNTP以及PCR引物購於上海生物工程公司；Taq酶購於中國農業大學農業生物技術實驗室；內切酶SspI和BamHI為華美生物工程公司產品；IPTG、X-gal、氨苄青黴素(Amp)、卡那黴素(Kan)、匙孔血藍蛋白(KLH)均購自華美生物公司飽和酚為鼎國生物工程公司產品；胰蛋白酶、青黴素鏈黴素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明質酸酶，HEPES，無脂肪酸BSA，細胞鬆弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸鈉，肝素鈉，礦物油和其它無機鹽等均為Sigma公司產品。
1.4培養基的配製SOB培養基配置每升培養基，應在950ml去離子水加入蛋白腖20g酵母提取物5g NaCl 0.5g.搖動容器室溶質完全溶解，然後加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/LNaOH調節到pH7.0。滅菌。
LB液體培養基蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶於800ml水中，調節PH值至7.5，定容制1000ml，高壓滅菌。
LB固體培養基蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶於800ml水中，加脂粉15g，調節pH值至7.5，定容至1000ml，高壓滅菌。
1.5試劑的配製DMEM培養液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青黴素66mg，鏈黴素100mg，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。使用時加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用滅菌的Mill-Q超純水溶解，定容至100ml，用0.2μm濾膜過濾滅菌，-20℃保存。
DPBS液DPBS粉末9.7g，Mill-Q超純水定容到1升，PH7.0-7.2，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
無鈣鎂PBS溶液KCl0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4 12H2O 2.88g，Mill-Q超純水定容到1升，PH7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油將Gimsa粉末在研缽中充分研磨。再加入甘油至總量為22ml，56℃保溫2h，然後再加入33ml甲醇，保存在棕色試劑瓶中，備用。
細胞裂解液10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K貯存液蛋白酶K100mg，溶於5mL滅菌水中，分裝，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶於1L重蒸水中，高壓滅菌。
G418貯液1g G418溶於1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，過濾滅菌，-20度保存。
兩倍電擊緩衝液(2×HeBS)280mMNacl、10mMKcl、1.5mMNa2HPO4、12mMGlucose、50mMHepes，PH7.0-7.4，過濾滅菌，1mL分裝，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris鹼溶於800ml水中，用HCl調PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5Mol/L EDTA(pH8.0)126.1g乙二胺四乙酸二鈉加入到800ml水中，用NaOH調PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
RNase溶液將RNaseA溶於10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的濃度，於100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存於-20℃。
TE緩衝液10mMol/LNaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。
5mol/L LiCl30.2g氯化鋰二水(LiCl.2H2O)完全溶於80ml水後，定容至100ml高壓滅菌。
50×TAE242gTris鹼，57.1ml冰乙酸，100m10.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解後定容至1000ml。
氨苄青黴素(Amp)貯存液將氨苄青黴素鈉溶於滅菌水後用0.22μm的濾器過濾除菌，配製成100mg/ml，保存於-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g無水乙酸鈉溶於80ml水中，用冰乙酸調節pH值至5.2，定容至100ml，高壓滅菌。
1mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2.6H2O，過濾除菌，分裝成10ml每份，貯存於-20℃，製備感受態時取出一份稀釋至100ml，過濾除菌，預冷備用。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，溶解後於4℃棕色瓶內保存。
DNA提取抽提緩衝液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。
2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等體積苯酚、氯仿混合，保存於4℃棕色瓶中。
蛋白酶K溶液用水配成20mg/ml，-20℃保存。
TCM199培養液稱TCM199粉末9.9g，NaHCO32.2g，丙酮酸鈉0.1375g，EDTA 0.372g，用1L超純水定容，PH7.2-7.4，正壓過濾滅菌，4℃保存。培養用工作液中加入10％FCS。
操作液H199在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。
衝卵液DPBS溶液中加入10％FCS。
透明質酸酶透明質酸酶0.2g，溶於10ml無鈣DPBS溶液中，過濾滅菌，-20℃貯存。
工作液用衝卵液稀釋10倍。
融合液0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2，0.5mMHEPES，0.05％BSA，調PH至7.2-7.4，過濾滅菌。
成熟培養液M199培養液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青黴素，100ug/ml鏈黴素。
CR1aa培養液成份終濃度(mM) 加入量g/100mlNaCl 114.7 0.67KCl 3.10.023NaHCO326.2 0.22Na Pyruvate 20.4 0.002Phenol Red1μl/ml100μl將上述成份加入90ml ddH2O中，待所有試劑徹底溶解後，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。調整pH為7.4，用ddH2O加到100ml，滲透壓為265-285mOsm之間。過濾滅菌。
1.6主要儀器設備1)CO2培養箱美國Forma Scientific Inc.
2)倒置顯微鏡和螢光顯微鏡日本Nikon公司3)培養皿、培養瓶、離心管和細胞凍存管Nunc公司4)電擊儀美國BTX公司(ECM 2001)5)電泳儀DYY-III2穩壓電泳儀，北京六一儀器廠6)超淨工作檯北京淨化設備廠7)-80℃超低溫冰箱日本SANYO公司8)製冰機日本SANYO公司9)超純水儀美國MILLIPORE公司10)低溫離心機Eppendorf公司11)高速冷凍離心機BECKMAN公司12)凝膠成像系統ALPHA INNOTECH公司13)PHS-3C酸度計上海虹益儀器廠14)自動滅菌鍋日本SANYO公司15)測序儀ABI 377型DNA sequencer，美國PERKIN ELMER公司16)恆溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司17)9700型PCR儀美國PERKIN ELMER公司18)ABI 377 DNA測序儀美國PERKIN ELMER公司1.7分析工具軟體及網址同源性分析軟體DNAMANPCR引物設計軟體Oligo6.0DNA序列分析軟體ChromasDNA及蛋白序列資料庫NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2實驗方法2.1 BAC DNA的準備及轉基因小鼠模型的建立2.1.1 hLF基因BAC陽性菌株通過PCR從Genome Systems Inc的人BAC文庫中篩選獲得hLF基因BAC陽性菌株，所用PCR引物如表2。BAC的骨架載體為pBeloBAC11，其的長度為7.35kb。其上有兩個NotI位點，用於連接外源片段。本實驗中所用的hLF基因片段長度約為150kb。其中5』端側翼序列長度約為90kb，3』端側翼序列長度約為35kb。經酶切分析和測序表明，該BAC片段含有17個外顯子在內的完整hLF編碼基因。
2.1.2 BAC的大量提取及純化BAC的大量提取參見《分子克隆實驗指南》從細菌中大量提取細菌所述。BAC提取後經NotI酶切，酶切後的hLF基因片段脈衝電泳後電洗脫回收。
設計一對引物，擴增hLF基因3』端以對基因進行鑑定。引物序列如下HLF55』CCTGGGCAACAAAGCGAGAC 3』HLF65』GCTATGGCTCCTTCTCTACTG 3』PCR的退火溫度分別為68℃。PCR產物的長度為1313bp。
2.1.3顯微注射製備轉基因小鼠回收的完整的hLF片段，經顯微注射製備轉基因小鼠2.1.4轉基因小鼠PCR和Southern鑑定對於轉人乳鐵蛋白小鼠的PCR鑑定，我們在hLF基因編碼區5』端和3』端分別設計了一對引物，引物序列及反應條件如表2；表2轉人乳鐵蛋白基因小鼠的PCR鑑定引物及反應條件引物名 引物序列 產物 退火溫度長度BAC70FSL5』-TTGACTGGATCCCGTAGAGG-3』 310bp 60℃BAC70FSR5』-TCAGTCCAGGGTAAGGAGGA-3』BAC70RSL5』-CACTAAACTCATCGCCACCA-3』 303bp 60℃BAC70RSR5』-CACCTCTCCCTTTTCTTCCTG-3』PCR的檢測表明，在經顯微注射後得到的152隻原代小鼠中，有11隻PCR驗測呈陽性，陽性率約為7％，其中4隻為公鼠。
Southern檢測取PCR檢測為陽性的轉基因克隆牛DNA約10μg用EcoRI消化，低壓慢速電泳，轉膜後，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標記的2.5kb的hLF基因編碼區片段。
結果如圖12.1.5轉基因小鼠奶樣的Western分析對轉基因小鼠的乳樣用重蒸滅菌水稀釋三倍，進行去乳脂、去酪蛋白的處理，最後得到乳清部分。乳鐵蛋白即存在於乳清中。圖2為上樣量為2μl，用減性(reducing)SDS上樣Buffer變性後的PAGE膠圖。從圖中可看到，第5，6泳道的轉基因小鼠乳樣和非轉基因小鼠乳樣之間存在著明顯的差異。
hLF轉基因小鼠乳樣用減性(reducing)SDS上樣Buffer變性的PAGE膠電泳後，進行轉膜，然後進行Western雜交處理，得到如圖3所示的結果。從圖3中可得，轉基因小鼠乳中的rhLF與對照的人乳中的乳鐵蛋白具有一致的遷移率。經Western雜交檢測，F0代14，19，20，44，74號鼠，F1代15，55號鼠，共七隻母鼠呈陽性。
rhLF125I放射性免疫反應的結果表明，7隻F0代和F1代的轉基因小鼠rhLF的表達量在490mg/l至7.8g/l之間。F0代一隻公鼠的女兒(55號)具有最高重組蛋白表達量。
2.2 pEGFP-NEO和pNEO選擇載體構建為了便於篩選陽性細胞，我們首先構建了含綠色螢光蛋白基因(EGFP)和新黴素基因雙選擇標記載體(pEGFP-NEO)以及新黴素基因單選擇標記載體(pNEO)。
1)pEGFP-NEO的構建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO並回收4kb片斷EGFP-IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，並與EGFP-IRES-NEO連接即構成pEGFP-NEO，pEGFP-NEO如圖4。
2)pNEO的構建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO並回收2kb片斷IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，並與IRES-NEO連接即構成pNEO，pNEO如圖5。
2.3細胞培養，基因轉染及陽性細胞篩選2.3.1胎兒成纖維細胞的原代培養在超淨工作檯中將胎兒浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗幾遍，以消毒過的手術器械取下耳部及脊背部的數塊表皮組織於DMEM+10％FCS培養液裡。
↓在直徑60mm平皿中將胎兒組織切碎成為1mm3大小的組織碎塊，再將組織碎塊轉移至15ml離心管中，1000rpm下離心洗滌數次。
↓用消毒玻璃彎頭吸管將小組織碎塊吸至25cm2培養瓶中，通過玻璃吸管彎頭使組織塊均勻分布在瓶壁上。
↓小心翻轉培養瓶(防止組織塊落下)讓組織塊黏附於瓶壁上，置於37度，5％CO2培養箱中放置2～4h，待組織塊貼壁後，再正置培養瓶，補加適量培養液繼續培養。
2.3.2胎兒成纖維細胞的傳代、冷凍、及復甦待種植的原代細胞生長至80％匯合時，將細胞一部分冷凍，一部分傳代繼續培養。
2.3.2.1傳代用消毒玻璃彎頭吸管小心吸除培養瓶中的培養液，沿著細胞生長壁的對面瓶壁注入無鈣鎂PBS(37度溫育)衝洗細胞兩次，以祛除殘餘血清及細胞代謝物。
↓用同樣方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量為可覆蓋細胞單層即可(直徑100mm培養皿一般加入1ml消化液，35mm培養皿中加入200u L消化液)，放入培養箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，待細胞開始變圓時，用手指敲打培養皿壁，使細胞徹底脫壁，然後加入培養液終止消化。
↓用消毒玻璃彎頭吸管反覆吹打，細胞，使其分散成為單個細胞，1000rpm下離心5min收集細胞。用培養液按1∶2或1∶3比例稀釋並重新接種細胞至培養皿中培養。
2.3.2.2冷凍貼壁細胞消化後，收集細胞於離心管中，在1000rpm下離心5min以去盡上清。
↓
加4度預冷的冷凍液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重懸細胞沉澱，使細胞濃度約為107個細胞/ml，轉移細胞至凍存管中。
↓放入4度冰箱預冷30min，再把凍存管插於厚泡沫上，然後置於液氮液面燻蒸2h，然後迅速投入液氮保存。
2.3.2.3復甦從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，並在水浴中不斷快速搖動凍存管以迅速解凍。
↓待冷凍液徹底解凍後，以新鮮培養液稀釋10倍並將溶解液轉移至離心管中，在1000rpm下離心5min去除DMSO以緩減冷凍液毒性。
↓用新鮮的培養液懸浮細胞沉澱，將細胞稀釋至所需濃度，繼續培養。
2.3.3轉染用DNA的準備hLf BAC的大量提取參見《分子克隆實驗指南》從細菌中大量提取細菌所述。BAC提取後經NotI酶切，酶切後的hLF基因片段脈衝電泳後電洗脫回收，用將注射用TE將純化的hLF基因片段溶解稀釋至5ng/μl。同時提取雙標選擇載體pEGFP-NEO和單標選擇載體pNEO，經NotI酶切後電洗脫回收，用將注射用TE將純化的標記基因片段溶解稀釋至1ng/μl。
2.3.4牛胎兒成纖維細胞對G418毒性敏感性檢測細胞培養到第3代後用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105個細胞接種到13個直徑35mm培養皿中以使細胞儘量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入終濃度從100μg/ml到1200μg/ml的G418，還有一孔中不加入G418作為對照。連續培養三周，每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細胞生長或死亡情況。
2.3.5目的基因與標記基因的顯微共注射將洗淨、滅菌後的蓋玻片置於六孔板內，以傳至3-6代的胎兒成纖維細胞接種培養，待細胞生長至60-80％時取出供細胞基因注射。
↓以注射用TE分別稀釋hLF BAC和雙標記選擇載體質粒pEGFP-NEO DNA或單標記選擇載體質粒pNEO DNA至5ng/μl和1ng/μl，然後再等體積混合，使hLF BAC和雙標記選擇載體的注射濃度分別為2.5ng/μl和0.5ng/μl。
↓將生長有胎兒成纖維細胞的蓋玻片移至盛有操作液H199的直徑100mm培養皿中，以吸有混合基因的注射針將基因注入細胞核，等細胞核膨脹後迅速拔出注射針。
↓基因注射後的細胞培養2天後，對細胞進行G418篩選、陽性細胞單克隆培養及擴增2.3.6陽性細胞的單克隆培養在螢光顯微鏡下觀察上述方法所得細胞克隆的發光情況，用記號筆圈住分散良好(遠離其它克隆)且細胞數量多的螢光克隆；吸除培養液，用無鈣鎂PBS漂洗細胞二次，在高倍解剖鏡下，將30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在標記好的細胞克隆上，待克隆的大多數細胞收縮脫壁後，不等細胞懸浮，快速吸取細胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的細胞；轉移細胞到加有500μl培養液的四孔板中，吹打分散細胞團塊；挑出的克隆繼續培養，降低G418濃度至300μg/ml維持篩選待克隆細胞數量擴大後或匯合後，將一部分細胞轉移到35mm培養皿中繼續擴大培養，另一部分用於轉基因檢測，其它擴大後的細胞儘早冷凍。
2.3.7轉染細胞的PCR檢測由於本實驗採用的是150kb的150kb的HLF BAC DNA與pEGFP-NEO或pNEO的顯微共注射方法，因此用G418篩選並不能保證陽性克隆點是轉有150kb的HLF BAC DNA的轉基因細胞，所以在進行體細胞克隆前必須對轉基因細胞進行PCR鑑定。為了確保轉入完整的150kb的HLF BAC DNA，我們在150kb的HLF BAC DNA的5』端和3』端，以及HLF編碼區分別設計了一對引物進行PCR擴增。
2.3.7.1細胞基因組DNA的提取用胰蛋白酶/EDTA液消化收集細胞，並用PBS洗滌兩次。
↓加入200μl細胞裂解液，終濃度為100μg/ml的蛋白酶K，55度水浴消化過夜。
↓用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。
↓加入等體積無水乙醇和0.1倍體積乙酸鈉沉澱DNA。
↓70％乙醇洗滌一次後，溶於TE中，-20度保存。
2.3.7.2 PCR反應引物序列如下表3轉人乳鐵蛋白克隆牛的PCR鑑定引物及反應條件

反應體系模板DNA，3μl；引物1μl；2.5mMdNTP，3μl；10×Tag酶Buffer，5μl；Tag酶，10U最後加ddH2O補足體系至50μl。
反應參數94℃ 5′；94℃ 40″→60℃ 40″→72℃ 1′； 25 cycles 72℃ 10′；4℃保存。
2.4轉基因體細胞克隆2.4.1卵母細胞的成熟培養從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置於30℃的生理鹽水在4h內送到實驗室，37℃的PBS液中清洗三遍後，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2～8mm的卵泡，回收形態均勻、結構緻密的卵丘-卵母細胞-複合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/ml bLH+1μg/ml estradiol)洗滌兩遍，然後將卵丘-卵母細胞-複合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養箱中成熟培養18～20h後，將成熟的卵母細胞放入0.1％透明質酸酶的管內振蕩2～3min後，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態完整，細胞質均勻並排出第一極體的卵母細胞為體細胞核受體。
2.4.2卵母細胞的去核將帶有第一極體的卵母細胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml細胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針於極體上方將透明帶切一小口，再用內徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內的染色體一併吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍後，置於培養箱中備用。
2.4.3移核與融合將血清飢餓2～4d的供體細胞用0.25％trypsin消化2～4min，選擇直徑為10～12μm的體細胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細胞透明帶內，然後將其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min後放入融合槽內，轉動卵細胞使供體細胞與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈衝的場強為2.5kV/cm、脈衝時間為10μs、脈衝次數為2次、脈衝間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)後，迅速將重構胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h後觀察融合率，挑選融合胚進行下一步激活處理。
2.4.4重構胚的激活與培養將重構胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min後換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h後再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養箱中培養2d後觀察分裂率，7d後觀察囊胚發育率2.4.5胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體母牛的子宮角內。受體母牛選擇的都是經產母牛，其中紅系冀南黃牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入魯西黃牛，在移植後的第60d進行直腸檢測，以確定妊娠率。
2.5轉基因克隆的PCR和Southern鑑定2.5.1轉基因克隆牛的PCR鑑定對於轉人乳鐵蛋白克隆牛的PCR鑑定，由於我們採用的轉基因為150kb的hLF BAC，為了檢測轉基因的完整性，我們在hLF基因上遊調控區5』端設計了一對引物，在其編碼區設計了一對引物，在其下遊調控區3』端也設計了一對引物，引物序列及反應條件如表4；表4轉人乳鐵蛋白克隆牛的PCR鑑定引物及反應條件

PCR結果如圖6，從圖6可以看出，我們設計的三對引物在兩頭克隆牛基因組中擴增出相應的特異產物，表明兩頭轉基因克隆牛均整合完整的hLF BAC DNA。
2.5.2轉基因克隆牛的Southern鑑定Southern檢測則取PCR檢測為陽性的轉基因克隆牛DNA約10μg用EcoRI消化，低壓慢速電泳，轉膜後，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標記的2.5kb的hLF基因編碼區片段。
以乳鐵蛋白基因編碼區的一個2.5kb大小的片段對這兩頭轉基因克隆牛進行Southern鑑定。從圖7中可以看出，這兩頭克隆牛基因組中的確轉有人的乳鐵蛋白基因，而且鐵娃的轉基因拷貝數為1，祥娃的轉基因拷貝數為2。
附SEQ ID NO 1人乳鐵蛋白的一級結構即胺基酸序列，共711個胺基酸1 MKLVFLVLLF LGALGLCLAG RRRRSVQWCA VSQPEATKCF QWQRNMRRVR51GPPVSCIKRD SPIQCIQAIA ENRADAVTLD GGFIYEAGLA PYKLRPVAAE101 VYGTERQPRT HYYAVAVVKK GGSFQLNELQ GLKSCHTGLR RNAGWNVPIG151 TLRPFLNWTG PPEPIEAAVA RFFSASCVPG ADKGQFPNLC RLCAGTGENK201 CAFSSQEPYF SYSGAFKCLR DGAGDVAFIR ESTVFEDLSD EAERDEYELL251 CPDNTRKPVD KFKDCHLARV PSHAVVARSV NGKEDAIWNL LRQAQEKFGK301 DKSPKFQLFG SPSGQKDLLF KDSAIGFSRV PPRIDSGLYL GSGYFTAIQN351 LRKSEEEVAA RRARVVWCAV GEQELRKCNQ WSGLSEGSVT CSSASTTEDC401 IALVLKGEAD AMSLDGGYVY TAGKCGLVPV LAENYKSQQS SDPDPNCVDR451 PVEGYLAVAV VRRSDTSLTW NSVKGKKSCH TAVDRTAGWN IPMGLLFNQT501 GSCKFDEYFS QSCAPGSDPR SNLCALCIGD EQGENKCVPN SNERYYGYTG551 AFRCLAEDAG DVAFVKGVTV LQNTDGNNNE AWAKDLKLAD FALLCLDGKR601 KPVTEARSCH LAMAPNHAVV SRMDKVERLK QVLLHQQAKF GRNGSDCPDK651 FCLFQSETKN LLFNDNTECL ARLHGKTTYE KYLGPQYVAG ITNLKKCSTS701 PLLEACEFLR K
權利要求
1.生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)利用含有完整人乳鐵蛋白基因的hLF BAC DNA作為乳腺特異表達載體，(2)將hLF BACDNA與雙標記選擇載體或單標記選擇載體按比例混合，導入動物體細胞核內，進行細胞轉染，獲得轉入hLF BAC DNA的轉基因細胞，(3)細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有hLF BAC DNA的轉基因克隆動物。
2.根據權利要求1所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述特異表達載體是長約150kb的hLF BAC DNA，重組人乳蛋白的轉基因小鼠模型中表達的人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白大小一致，具有與天然人乳中乳鐵蛋白相同的免疫活性。
3.根據權利要求2所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述轉基因小鼠的人乳鐵蛋白基因表達量為0.5-7.8g/l。
4.根據權利要求1所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述雙標記選擇載體是pEGFP-NEO，所述單標記選擇載體是pNEO。
5.根據權利要求1所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述hLF BAC DNA與雙標記選擇載體或單標記選擇載體混合的摩爾比為1∶3。
6.根據權利要求1所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述導入方法為體細胞顯微共注射。
7.根據權利要求1所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述轉基因細胞是通過G418進行篩選獲得的陽性細胞。
8.根據權利要求1所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
9.根據權利要求6所述的生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，所述大型家畜為牛。
全文摘要
生產重組人乳鐵蛋白的動物乳腺生物反應器——人乳鐵蛋白轉基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)利用含有完整人乳鐵蛋白基因的hLF BAC DNA作為乳腺特異表達載體，(2)將hLF BAC DNA與雙標記選擇載體或單標記選擇載體按比例混合，導入動物體細胞核內，進行細胞轉染，獲得轉入hLF BACDNA的轉基因細胞，(3)細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有hLF BAC DNA的轉基因克隆動物。這些轉基因轉基因克隆動物乳腺特異表達的重組人乳鐵蛋白將可以開發成保健品和藥品，含重組人乳鐵蛋白的牛奶也可直接開發成高附加值的保健牛奶及奶製品。
文檔編號C12N15/85GK1687425SQ20051006611
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者湯波, 戴蘊平, 龔國春, 劉兆良, 趙春江, 張磊, 李寧 申請人:李寧