包含轉基因植物材料的穩定組合物的製作方法

2023-09-19 18:40:35 1

專利名稱：包含轉基因植物材料的穩定組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及在工業處理(如食品或飼料組合物的製造)中酶的應用。
背景技術：
在家畜飼養中應用酶已成為極平常的措施。這些酶在由工業酶生產者操作的大規模發酵罐中生長的微生物產生。發酵期的最後，微生物的肉湯常經歷一系列過濾步驟以從酶中分離生物量。酶溶液或是在添加各種穩定劑之後作為液體或是處理成幹製劑後出售。
酶液和幹製劑由飼料工業以商業規模利用。液體在造粒(pelleting)之後用於飼料以防止通過造粒處理引起的酶的熱失活。問題是在最終飼料製劑中酶的數量十分小，這使實現酶分子在飼料中均質分布比較困難。液體明顯地比乾燥成分混合起來更困難。在造粒之後把液體加到飼料中需要特定的設備，而目前大多飼料製造廠中沒有這些設備。
另一方面，酶的幹製劑有在造粒過程中酶熱失活的缺點。在造粒過程中，飼料通過模具壓縮，形成的條塊切割成不同長度的合適的小丸。當進入造粒設備時團塊的溼度通常在大約18％到大約19％之間。在造粒之後，立即把溫度升高到60-95℃。高含水量和高溫的結合影響對大多數酶有害。這些缺點在飼料的其它類型的熱變形處理中(如擠壓(extrusion)和膨脹(expansion))也同樣存在。
為了克服這些問題，有人發表了一種用於生產包含一種或多種酶的熱穩定性酶預混物的方法，所說的酶在商業飼料造粒處理中保留了有效水平的活性(Haarakilta，A(1988)歐洲專利申請#0257996 B1)。所說方法包括的步驟如下把生理上可接受的並能吸收含水的酶溶液的穀物載體和含水的酶溶液混合一段時間，這一時間足以把一種或多種酶吸附在載體上以形成載體/酶複合物；造粒載體/酶複合物；然後把造粒的載體/酶複合物乾燥到含水量在7％到15％之間，優選地是小於大約10％(重量比)。這種方法很費工，而且就我們所知沒有產生提高的造粒抗性。
各種酶製造廠商開發了不同的製劑方法以在飼料造粒和存儲期間提高幹酶產品的穩定性。已有人提出，例如，特徵在於產品顆粒被塗上一層粒子的製劑會提高對造粒條件的抗性(WO 92/12645)。這些努力強調了這一問題的重要性和工業上對解決這一應用問題的需要。
發明概述現在，我們令人驚奇地發現當酶以轉基因植物材料的形式添加到飼料中時，酶對熱變形處理(如造粒)更具抵抗力，在植物材料中這些酶通過轉基因的表達產生。這樣，本發明公開了包含作為有效成分的多肽的熱變形處理的組合物，所說的組合物可以通過使包含轉基因植物材料的原材料經受熱變形處理獲得，由於在所說植物材料中轉基因的表達，所說的多肽已經在該植物材料中生物合成。優選的熱變形處理是造粒、擠壓和膨脹。
本發明公開了這些組合物作為動物飼料或其預混物的用途。具體地說，在促進動物的生長的過程中，使用本發明的組合物，其中給動物飼餵包含這些組合物的飼料。
本發明進一步公開了包含作為有效成分的多肽的熱變形處理的組合物的製備方法。
發明詳述在本發明中應用的熱變形處理經常在商業飼料處理中使用，其中處理方法以許多形式存在，如膨脹、擠壓和造粒，或這些方法的結合。所有這些處理的特徵在於熱能(通常以蒸汽的形式)和機械能(例如，通過螺旋驅動飼料)的輸入。
在飼料生產中，造粒是經典的處理方法，它也可以如對任何原材料一樣應用熱變形處理。混合原材料，並在加上幾巴的低壓蒸汽之後把原材料轉移到旋轉模具上。模具通常包含幾百個洞，產物通過洞。通過模具裡的旋轉滾筒擠壓。
擠壓是一種用於飼料生產的替代方法，它可以如用於任何原材料一樣用作熱變形地處理。
原材料放在通常由幾個較小的模具的壓力環組成的一個無底的螺絲上。此螺絲把產物推進模具中。溫度升高是通過螺絲和外套之間的產物摩擦和壓力增加造成的。擠壓機的內部和外部的壓力不同導致部分水在出口汽化，這樣就使產物膨脹。
膨脹是十分類似於擠壓但不以限制的方式使材料成形的方法，因為它通常不通過模具。
產生用於動物飼料中的酶的替代方法已通過在植物和植物種子中表達編碼飼料酶(如微生物肌醇六磷酸酶)的基因發明出來(Pen等，EP-A-0 449375)。直接的或是在處理後植物或植物種子表達的這些酶的使用與動物飼料中的使用是協調的。
本發明的轉基因植物材料優選地包含一種或多種所需的多肽，這種多肽是包含在衍生植物材料的植物中的轉基因的表達產物。這通過把包含編碼所需的多肽的DNA序列的表達構建體導入植物來達到，其中多肽具有相應的活性，例如肌醇六磷酸酶(其中詳尺的描述可在Pen等，EP-A-0 449 375中找到)。本文中的轉基因植物和轉基因植物材料定義為包括植物(以及所說植物的部分和細胞)及其後代，這些後代利用重組DNA技術遺傳改良以在植物或植物器官中產生、增強或改變所需的多肽的產生。在本文中，轉基因可理解為指在轉基因植物中的特定的遺傳修飾，即核苷酸序列。在本發明的組合物中，多肽用作活性成分，由此，活性成分被限定為由轉基因編碼的。
在本發明中使用的多肽在轉基因植物中可在所有組織、所有發育階段組成性地產生。在某些情況下，如在植物細胞壁降解酶存在的情況下，可能需要限制轉基因表達到植物的特定部分，在此部分中，表達的所需的多肽不幹擾宿主植物的發育。因此，編碼所需多肽的基因也可以以階段和/或組織特異性的方式表達，或者可替代的是，可把這些基因置於可誘導的啟動子的控制之下。在一個優選的實施方案中使用了完整的或磨碎(milling orgringing)之後的種子，其中所需的多肽使用種子特異性啟動子特異性表達。然而，本領域技術人員知道多肽在其它植物器官中表達是同樣切實可行的，而且如在本發明中公開的應用中可以產生類似的優點。
植物物種的選擇主要由植物或其部分的預期的用途和對轉化的適應性確定。在本發明內，所選擇的植物包括(但不限於)以下作物生產可食用花的作物，如花椰菜類(如甘藍)、朝鮮薊(洋薊)，生產水果的作物，如蘋果類(蘋果屬，例如Malus domesticus)、香蕉類(芭蕉屬，例如，小果野蕉)、漿果類(如葡萄乾，茶鑣子屬，例如，紅醋慄)、櫻桃類(如甜櫻桃，梅，例如，歐洲甜櫻桃)、黃瓜類(黃瓜屬，例如，黃瓜)、葡萄類(葡萄屬，例如，葡萄)、檸檬類(檸檬)、甜瓜類(甜瓜)、堅果類(如核桃，核桃屬，例如，核桃；花生，落花生)、桔子類(柑桔屬，例如，Citrus maxima)、桃類(梅屬，例如，桃)、梨類(梨屬，例如，洋梨)、梅類(李屬，例如，歐洲李)、草莓類(草莓屬，例如，Fragaria moschata)、番茄類(番茄屬，例如，番茄)，葉用作物，如苜蓿類(苜蓿屬，例如，紫苜蓿)、甘藍類(例如，甘藍)、菊苣類(菊苣屬，例如，Cichoreum endivia)、韭類(蔥屬，例如，蔥)、萵苣類(萵苣屬，例如，生菜)、菠菜類(菠菜屬，例如，菠菜)、菸草類(菸草屬，例如，菸草)，根用作物，如葛類(竹芋屬，例如，竹芋)、甜菜類(甜菜屬，例如，甜菜)、胡蘿蔔類(Daucus，例如，carota)、木薯類(Manihot，例如，esculenta)、蘿蔔類(芸苔屬，例如，蕪菁)、小蘿蔔類(蘿蔔屬，例如，藍花子)、薯蕷類(薯蕷屬，例如，有刺甘薯)、甘薯(lpomoea batatas)以及生產種子的作物，如豆類(菜豆屬，例如，菜豆)、豌豆類(豌豆，例如，豌豆)，大豆類(大豆屬，例如，大豆)、小麥類(小麥屬，例如，小麥)、大麥類(大麥屬，例如，大麥)、玉米類(玉蜀黍屬，例如，玉蜀黍)、稻類(稻屬，例如，稻)、歐洲油菜、小米(稷屬)、向日葵類(向日葵)、燕麥類(燕麥)，生產塊莖的作物，如大頭菜類(芸苔屬，例如，甘藍)，土豆類(茄屬，例如，馬鈴薯)等等。
本發明的優點是當多肽以有效成分添加到組合物中並以轉基因植物材料的形式存在時，與常規的多肽添加到組合物中的方式相比，多肽在熱變形處理步驟期間(如造粒)對滅活具有更大的抗性。很明顯，這些優點不必要限制在本申請的特定實施例的特定實施方案中，即造粒並用作動物飼料的酶(如添加到組合物中的肌醇六磷酸酶或木聚糖酶)。相對地，本發明的優點使用於任何受熱變形處理並包含一種或多種多肽作為有效成分的組合物。在多肽有敏感的生物學活性的情況下(如對熱滅活敏感)，本發明的優點就更突出。在本文中，熱敏感的多肽定義為這樣的多肽，即在受到本發明中使用的熱變形處理時這些多肽失去主要的生物活性。
在本發明的一個優選的實施方案中，多肽和/或編碼它們的DNA序列相對於DNA序列在其中表達的轉基因宿主植物是異源的。本文中的異源可理解為DNA序列和/或多肽對宿主有機體不是天然的，即它們源於其它植物種類、哺乳動物或微生物，如真菌或細菌。當糖基化的蛋白質在轉基因植物中表達時，本發明尤其是有優勢的，它們的糖基化可能和這些蛋白質的天然存在的對應物不同。
包括在本發明中的優選的酶是在動物飼料中使用的酶。本文中的動物飼料可理解為也包括寵物飼料。這些酶的功能是提高飼料轉化率，例如，通過降低粘性或通過降低一定的飼料化合物的抗營養影響。另外，可以使用飼料酶(例如，肌醇六磷酸酶)以減少糞便中對環境有害的化合物的量。用於這些目的優選的酶有磷酸酶，其中優選地是肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶；糖酶，如澱粉分解酶和植物細胞壁降解酶(其中優選地是纖維素酶、半纖維素酶或半乳聚糖酶)；蛋白酶(優選的蛋白酶是中性和/或酸性pH值最優的蛋白酶)；脂酶(其中優選的是磷脂酶，如哺乳動物的胰磷脂酶A2)。此外，包括在本發明中的多肽也包括非酶促生物活性物，如用作疫苗和/或多肽的、用工程方法使其具有加大含量的必需胺基酸的抗原決定簇。
本領域技術人員明白本發明同樣地適用於所需的多肽的組合，其中所說的組合包括表達各種所需多肽的不同轉基因植物的組合，另外還包括在一種轉基因植物中共表達的各種所需多肽的組合。
在本發明的一個具體實施方案中，當黑麴黴肌醇六磷酸酶包含在歐洲油菜(Brassica napus)的磨碎的種子中，而且酶的基因在其中表達時，試驗了黑麴黴肌醇六磷酸酶的造粒穩定性。黑麴黴肌醇六磷酸酶基因的克隆在其它文獻中有描述(van Gorcom等EP-A-0 420 358)。在本發明的另一個具體實施方案中，麴黴屬內源木聚糖酶(endoxylanase)的對造粒穩定的製劑通過編碼這種酶的真菌基因在菸草種子中表達提供。麴黴屬內源木聚糖酶基因的克隆由de Graaff等在EP-A-0 463 706中詳細描述。
實施例1黑麴黴肌醇六磷酸酶基因在cruciferin啟動子控制下在歐洲油菜中穩定的種子特異性表達應用於真菌肌醇六磷酸酶在歐洲油菜中的種子特異性表達的方法之細節由Pen等在EP-A-0 449 375中描述(1991)，本文一併參考。實質上，二元載體pMOG23(以大腸桿菌K12 DH5α於1990年1月29日保藏在CentraalBureau voor Schimmel Cultures，保藏號為CBS 102.90)用作肌醇六磷酸酶的種子特異性表達載體的構建起點。種子特異性肌醇六磷酸酶的表達盒在pMOG23的多接頭中裝配，並包含下列必需成分。肌醇六磷酸酶cDNA的種子特異性轉錄與其終止分別通過衍生自編碼歐洲油菜12S貯藏蛋白cruciferin的基因的5-和3調節序列控制(cruA基因；Ryan等，1989，核酸研究.173584)。用苜蓿花葉病毒RNA4前導序列來穩定mRNA(Bredcro等，1980，核酸研究.82213)，同時為了實現肌醇六磷酸酶的胞外表達，菸草PR-S信號肽(Cornelissen等，1986，自然，321531)符合讀框地偶聯到編碼成熟蛋白質的肌醇六磷酸酶的cDNA部分。在和大腸桿菌K-12菌株RK2013(包含質粒pRK2013)的三親交配時(Ditta等，1980，美國科學院學報，777347)，把這個包含嵌合的肌醇六磷酸酶基因的二元載體轉移進土壤桿菌屬菌株LBA4404(Hoekema等，1983，自然，303179)，此菌株包含帶有對T-DNA轉移進植物必須的毒性基因的質粒。用此菌株轉化油菜種子(歐洲油菜)。為了這個目的，從5至6周的植物(正好在開花前)採取的表面滅菌的莖段事先在MS培養基上培養24小時(Fry等(1987)，植物細胞報導，6，321)，然後在有同樣培養基的新鮮平板上和土壤桿菌共培養48小時。轉基因小植物從在選擇培養基(500mg/l羧苄青黴素，40mg/l巴龍黴素)中生長的莖段上再生，然後進一步通過Pen等在EP-A-0 449 375中描述的方法分析。
使用上述方法，在歐洲油菜中肌醇六磷酸酶的表達水平達到了與大約500FTU/g相對應的多達10％的可溶性蛋白質的水平。肌醇六磷酸酶活性物的一個單位(FTU)定義為在37℃和pH 5.5時以1μmol/分鐘的速率從1.5mM肌醇六磷酸鈉釋放無機磷的酶的量。
實施例2造粒過程中歐洲油菜中的肌醇六磷酸酶的穩定性造粒條件如下造粒在55℃之後和造粒之後75℃的溫度下獲得。進行了兩個獨立的試驗，一個以實驗室規模進行，另一個以工業規模進行。
令人驚奇地是，我們發現在歐洲油菜中產生的黑麴黴肌醇六磷酸酶實質上比目前市售的黑麴黴肌醇六磷酸酶製劑對造粒條件更具抵抗力。由於使用了磨碎的種子，酶的穩定性明顯地不依賴於種子的完墊性。
Natuphoso是一種包含黑麴黴肌醇六磷酸酶的市售產品，它可以從BASF，Ludwigshafen，德國獲得。
表1造粒對不同酶製劑的穩定性影響。<
>實施例3種子磨碎過程中歐洲油菜中的肌醇六磷酸酶的穩定性在歐洲油菜中肌醇六磷酸酶的商業開發意味著種子的磨碎。因而，比較了不同的磨碎條件以評價在磨碎過程中在歐洲油菜中表達的肌醇六磷酸酶活性的穩定性。所使用的磨碎條件是本領域的熟練技術人員熟知的。結果表明磨碎的方法(表2)不強烈影響酶的穩定性。
表2磨碎條件對在歐洲油菜中表達的肌醇六磷酸酶的穩定性的影響。<
>
實施例4內源木聚糖酶在CaMV 35S啟動子控制下在菸草種子中穩定表達如de Graaff等在EP-A-0 463 706中的詳盡描述克隆了麴黴屬內源木聚糖酶基因。包含麴黴屬內源木聚糖酶基因的大腸桿菌質粒plM100在1990年7月7日保藏在Centraal bureau voor Schimmel cultures，定名為CBS322.90。用plM100作為模板使用融合PCR，除去木聚糖酶基因中的單一內含子。這個人工cDNA在類似於詳盡描述的在菸草中的肌醇六磷酸酶的表達過程之後(Pen等，1993，生物技術，10811)在菸草種子中表達。實質上，編碼成熟酶的cDNA片段在二元表達載體pMOG29中(Pen等，1992，生物技術，10292)符合讀框地融合到編碼菸草PR-S蛋白質的信號肽序列上(Cornelissen等，1986，自然，321531)。在pMOG29中的表達盒由下列成分組成有兩個增強子的組成型花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Guilley等，1982，細胞，30763)；穩定mRNA的合成苜蓿花葉病毒RNA4前導序列(Bredero等，1980，核酸研究，82213)；根癌土壤桿菌胭脂氨酸合酶(NOS)終止子(Bevan，1984，核酸研究，128711)。這種包含嵌合內源木聚糖酶基因的二元載體在和大腸桿菌K-12菌株RK2013(包含質粒pRK2013)的三親交配時(Ditta等，1980，美國科學院學報，777347)轉移進土壤桿菌屬菌株LBA4404(Hoekema等，1983，自然，303179)中，此菌株中包含帶有對T-DNA轉移進植物必需的毒性基因的質粒。用此菌株按Horschal等的方法(1985，科學，2271229)轉化菸草(菸草cv Petit Havana SR1)葉圓片。轉基因植物在包含100mg/l的卡那黴素的培養基上選擇。
這種內源木聚糖酶基因在菸草中的部分表達產生了最大表達水平為1.5％的可溶性蛋白質，在種子中相當於大約1625EXU/克種子。內源木聚集糖酶的一個活性單位(EXU)定義為在40℃和pH 3.5下釋放3.346μmol還原糖的酶的量，其中還原糖作為來自燕麥屬德國小麥的1％木聚糖的木糖等價物測定。
實施例5造粒過程中菸草種子內源木聚糖酶的穩定性造粒條件如下飼料在處理期間的65℃和造粒之後的75℃的溫度下獲得。試驗以實驗室規模進行。
磨碎的以Lyxasan Forteo商標出售的種子和微生物酶產品(可從BASF，Ludwigshafen，德國獲得)添加到飼料中至最終濃度為6500EXU/kg飼料。
由此可知，在種子中產生的內源木聚糖酶實質上比目前包含微生物酶的製劑對造粒更具抵抗力。
表3造粒對內源木聚糖酶不同製劑的穩定性的影響
權利要求
1.一種包含作為有效成分的多肽的熱變形處理的組合物，所說的組合物可以通過使包含轉基因植物材料的原材料經受熱變形處理獲得，由於在所說植物材料中轉基因的表達，所說的多肽已經在該植物材料中生物合成。
2.按照權利要求1的組合物，其中所說的熱變形處理選自造粒、擠壓和膨脹，或這些處理的結合。
3.按照權利要求1-2任一之組合物，其中所說的轉基因植物材料是種子。
4.按照權利要求1-3任一之組合物，其中所說的多肽對於轉基因植物是異源的。
5.按照權利要求1-4任一之組合物，其中所說的多肽是酶。
6.按照權利要求5的組合物，其中所說的酶選自磷酸酶、糖酶、蛋白酶以及脂酶。
7.按照權利要求6的組合物，其中所說的酶是真菌肌醇六磷酸酶和/或真菌木聚糖酶。
8.權利要求1-7任一所限定的組合物用作動物飼料或其預混物的用途。
9.一種用於促進動物生長的方法，其特徵在於用包含權利要求1-7任一所限定的組合物的飼料飼餵動物。
10.一種製備包含作為有效成分的多肽的熱變形處理的組合物的方法，其特徵在於使包含轉基因的植物材料的原材料受到熱變形處理，由於在所說植物材料中轉基因的表達，所說的多肽已經在該植物材料中生物合成，所說處理優選地選自造粒、擠壓或膨脹。
全文摘要
本發明公開了包含作為有效成分的多肽的熱變形處理的組合物。所說的組合物可以通過使包含轉基因植物材料的原材料經受熱變形處理(如造粒、擠壓或膨脹)獲得，由於在所說植物材料中轉基因的表達，所說的多肽已經在該植物材料中生物合成。本發明的組合物較好地是用作動物飼料或其預混物。
文檔編號A23K1/14GK1168084SQ96191368
公開日1997年12月17日 申請日期1996年11月6日 優先權日1995年11月7日
發明者R·F·比德克爾 申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司