一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子及其應用的製作方法

2023-09-19 18:44:00 2

專利名稱：一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子及其應用。
背景技術：
隨著植物分子生物學的飛速發展、植物遺傳分析和遺傳工程技術的不斷革新，轉基因植物在基礎研究和生產實踐上都具有重要意義。尤其是轉基因植物生物反應器的研究和開發使植物能以極低的成本大量生產外源蛋白，為人類提供了一個更加安全和廉價的生產體系，與微生物發酵、動物細胞和轉基因動物等生產系統相比，它具有許多潛在的優勢和極大的商業價值。
植物生物反應器是指以植物懸浮細胞、某一組織和器官或整株植物為工廠大量生產具有重要功能的蛋白。自1986至1990年間，人們建立了植物表達系統成功地表達了人類生長激素融合蛋白，幹擾素和人血清白蛋白。之後，隨著技術的發展，科學家對於植物生物反應器的研究漸趨深入，主要表現在三個方面首先是應用的廣泛性。從生產植物抗體到口服疫苗到重要的藥用蛋白，其分子的複雜程度和修飾度都在提高。自十幾年前轉基因菸草成功地表達免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因並組裝成功能抗體以來，植物已經能夠生產完整的IgG和IgA分子，分泌型IgG和IgA分子，雙特異性抗體，膜錨定抗體等不同類型抗體。目前已經實現的口服疫苗包括細菌疫苗、病毒疫苗、寄生蟲疫苗等；第二是可用做反應器的植物種類的擴展。從最初的模式植物菸草，到現在的馬鈴薯、番茄，玉米，油菜，大豆，擬南芥，香蕉，番木瓜，豇豆，菠菜，苜蓿、蕪青等。Elizabeth E Hood報導的用轉基因玉米生產的重組抗生素蛋白的表達量佔種子中抽提的總可溶蛋白的2％，在目前表達外源蛋白的所有轉基因玉米中表達量最高；第三實現植物生物反應器的技術改良。如，提高蛋白表達水平，人們在葉綠體內合成複雜的需要翻譯後加工的或亞基裝配的真核蛋白質，如sIgA；整合到菸草葉綠體基因組中的外源基因拷貝數能夠達到每個細胞10000個拷貝，相應的重組蛋白佔全部可溶性蛋白的比例也提高到47％。
轉基因植物生物反應器研究使農業這一概念大大拓寬，突破了傳統農業範疇，但要使外源基因在植物中穩定的整合，並且能夠在特定的器官或細胞中特異性表達，一個很重要的前提條件是要有合適的啟動子。植物基因工程中常用的啟動子按其作用方式及功能可分為三類組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子。組織特異性啟動子，可以使基因的表達僅限於某些特定的器官或組織部位，並降低對植物的負面影響。
目前，在植物中發現的種子特異性啟動子主要有谷醇溶蛋白基因啟動子、花生種子豆球蛋白legA基因啟動子、水稻穀蛋白gluA和gluB基因啟動子和玉米醇溶蛋白基因啟動子等。
玉米澱粉的合成途徑中有許多相關酶，其中玉米澱粉去分支酶有兩種類型一種是支鏈澱粉酶型去分支酶(the pullulanase-type DBEs)，一種是異澱粉酶型去分支酶(the isoamylase-type DBEs)。ZPU1是一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶，在不同玉米組織中檢測Zpu1基因轉錄的mRNA，發現在玉米授粉20天後種子胚乳中大量存在，而在胚和穗中只有微量的表達，但在葉和根中沒有表達。說明調控Zpu1基因的調控序列可能是胚乳特異性或種子特異性的。而且該基因只在胚乳、幼胚和穗中表達，也即只在生殖組織中表達，表明該基因的調控序列可能存在與生殖相關的功能區域。

發明內容
本發明的目的是提供一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子。
本發明所提供的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子，是玉米澱粉合成途徑中的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶Zpu1基因的啟動子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID №1或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交後用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列的啟動子名稱為zpu1P-4，由516個鹼基組成。
含有本發明的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子的載體、細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
擴增本發明啟動子任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。
實驗證明，本發明的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子可啟動報告基因gusA基因在種子中特異性表達，說明它能使目的基因在植物的種子中特異性表達，該啟動子將在玉米種子改良和植物生物反應器中發揮重要作用。


圖1為RT-PCR擴增得到的用於篩庫的片段的電泳圖譜圖2A為第一輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描2B為第二輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描2C為第三輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描2D為第四輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描2E為驗證第三輪和第四輪篩選得到的單克隆雜交顯影的X光片掃描3A為lambda DNA的酶切電泳圖譜圖3B為lambda DNA酶切後的雜交圖譜圖4為用PCR擴增得到的Zpu1基因啟動子序列zpu1P-4圖5為zpu1P-4片段構建到真核表達載體pBI121上的圖譜示意圖具體實施方式
材料與方法1、菌株與質粒大腸桿菌(E.coli)DH5α、農桿菌LBA4404均購自博大公司、λ噬菌體的宿主菌LE392購自Clontech公司。
2、工具酶及生化試劑各種限制性內切酶、pGEM@T-Easy載體試劑盒購自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取試劑盒購自天為時代公司，ExTaq酶購自Takara公司；dNTP混合物購自上海生工；T4DNA連接酶購自Takara公司和BioLabs公司；萘乙酸(NAA)、氨苄青黴素(Amp)、卡那黴素(Km)、鏈黴素(Sm)和噻孢黴素(Cef)購自欣經科公司；同位素α-32P dCTP購自北京亞輝生物公司；硝酸纖維素膜購自Amersham公司。4-甲基傘型酮(4-MU)、4-甲基傘型酮醯-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均購自上海生工。
3、培養基LB液體培養基(1升)10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白腖，pH7.0LB固體培養基(1升)1升液體LB培養基加15g瓊脂YEB液體培養基(1升)1g酵母提取物，10g蛋白腖，0.5g MgSO4·7H2O，5g蔗糖，pH 7.5YEB固體培養基(1升)1升YEB液體培養基加15g瓊脂MS基本培養基(1升)MS大量元素，MS微量元素，MS有機物，各組份的基本成分參照Murashige，TSkoog，F.在1962發表的MS培養基成分(Murashige，TSkoog，F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissueculture.Physiol.Plant.1962，15473-497)MS鹽溶液只含有MS大量元素和微量元素MS固體培養基1升MS基本培養基中加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.8菸草分化固體培養基1升MS基本培養基中加30g蔗糖，8g瓊脂，3mg 6-BA，0.2mgNAA，pH 5.6-5.8菸草誘導生根培養基1升MS基本培養基加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.84.篩選基因組文庫所需溶液1)20×SSC175.3gNaCl(3.0M)88.2g 檸檬酸三鈉(0.3M)用NaOH調pH至7.0，定容至1升，室溫保存備用。
2)20×SSPE175.3gNaCl(3.0M)27.6g 磷酸二氫鈉(0.2M)40ml 0.5M EDTA(終濃度0.02M)用NaOH調pH至7.4，定容至1升，室溫保存備用。
3)50×Denhardt’s solution5.0g 聚蔗糖(Ficoll)5.0g 聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)5.0g BSA(組分V)加水定容至500ml，-20℃保存備用。
4)20％SDS5)10×lambda稀釋緩衝液58.3g NaCl(0.1M)24.65g MgSO4·7H2O(0.1M)350ml 1.0M Tris-HCl(pH7.5)(終濃度0.35M)5.PCR引物P2775』CGCACAGGGGTTCTTGTTGGA 3』P9505』CAACCAACCAAGTTCGTGTGC 3』P37F5』AAGCTTGTGTGACATAGTTATCCACGAACC 3』P38R5』GGATCCTTGCGTCCGCGTTTGGATTC 3』P45F5』CAGGAAGTGATGGAGCATCAG 3』P46R5』TCGTGCACCATCAGCACGTTA 3』以上引物均由上海生工合成。
實施例1、玉米支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶Zpu1基因5`側翼序列的克隆一、探針的製備根據GenBank中Zpu1基因的cDNA序列(Accession no.AF080567)設計一對引物(P277和P950)。用Trizol RNA提取試劑盒提取授粉後28天的玉米種子總RNA，提取步驟按試劑盒內提供的方法操作。以提取的玉米種子總RNA為模板，進行反轉錄。
取1μL Oligo(dT)18加到10μL濃度為200ng/uL的總RNA溶液中，70℃，5分鐘後置於冰上冷卻5分鐘，然後加入以下成分試劑體積5×反轉錄緩衝液 5μLdNTP混合物(每種10mM)2.5μLRNasin核糖核酸酶抑制劑(濃度為50U/uL)1μLAMV反轉錄酶(30U/μL)3μLDEPC處理水 定容至25μL參照Promega公司AMV Reverse Transcriptase使用說明書設定如下的反應條件室溫10min，42℃ 60min，70℃ 10min，冰浴2min。然後以合成的cDNA第一鏈為模板，以P277和P950為引物進行PCR擴增。
反應體系為試劑體積10×緩衝液 5μLdNTP混合物(每種10mM)1μL引物P277(濃度為10μM) 1μL引物P950(濃度為10μM) 1μLEx-Taq(5U/μL) 1μL反轉錄產物(濃度為10ng/uL) 5μL滅菌水 定容至50μL反應條件94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃1min(10個循環)；94℃1min，59℃30s，72℃1min(30個循環)；72℃10min；4℃保存。
將得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，表明擴增得到一條600bp左右的片段，將此片段作為篩選玉米基因組文庫的探針。圖1中，M為1kb laddermarker；1為目的片段(箭頭所示)。
二、篩選玉米基因組文庫得到Zpu1基因5`側翼序列1、玉米基因組文庫玉米基因組文庫購自Clontech公司，目錄號為FL1032D。
2、文庫滴度的測定1)、挑取一個宿主菌(LE392)的單斑於10ml LB液體培養基(含10mM MgSO4、0.2％麥芽糖)中，在200rpm、37℃條件下振蕩過夜，使OD600達2.0左右。
2)、文庫噬菌體的稀釋a.從購買的玉米基因組文庫中取2μLλ噬菌體原種加到1ml 1×lambda稀釋緩衝液中(Dilution1＝1∶500)。
b.從Dilution1中取出20μL加到980μL 1×lambda稀釋緩衝液中(Dilution2＝1∶25000)。
c.在六隻試管加入100μL 1×lambda稀釋緩衝液，200μL宿主菌，然後分別加入稀釋噬菌體Dilution20μL、5μL、10μL、50μL、100μL和250μL。
3)、將上述六管在37℃水浴20分鐘左右。
4)、然後加4ml溶解的0.7％LB頂層培養基(50℃左右)，充分混勻後鋪到15％LB固體平板上，快速旋轉培養皿使頂層培養基均勻分布於整個平板。
5)、室溫靜置10分鐘，待頂層培養基凝固後，在37℃倒置培養6-7hr。
6)、統計每個平板上長出的噬菌斑，根據下面的公式計算文庫的滴度(pfu/ml)。
將六個平板測得的滴度求平均值為1.22×108pfu/ml。文庫的滴度大於108pfu/ml，所以該文庫可以用於篩選。
3、用DNA探針篩選文庫1)鋪板宿主菌的準備；接種λ噬菌體的宿主菌LE392單菌落於LB液體培養基(MgSO410mM，麥芽糖0.2％)，37℃，200rpm，振蕩培養至OD600為2.0，取出備用。
2)λ噬菌體侵染宿主菌及鋪板取15ml溶化的頂層培養基加到侵染後的噬菌體和宿主菌的混合物中，充分混勻，迅速均勻地鋪在預先準備好的1.5％LB固體平板上。室溫靜置10分鐘，待頂層培養基凝固後，在37℃倒置培養3-8hr。當噬菌體長到不同噬斑間邊緣剛彼此接觸時，取出平板放於4℃，以備後面的轉膜。
3)噬菌斑原位吸附固定至硝酸纖維素膜a.剪取適當大小(比培養皿略小)的硝酸纖維素膜。在每張膜上剪三個不對稱的缺口，並用鉛筆在膜上標號。
b.將與平板編號相同的膜輕輕放到平板培養基上，儘量不產生氣泡。
c.用滅菌牙籤插在預先在膜上剪好的三個不對稱缺口處，作為膜回位標記。2分鐘後用無菌鑷子小心地揭起硝酸纖維素膜，吸附有噬菌體的一面朝上，放於乾淨濾紙上，室溫晾乾。
d.將晾乾的膜分別在變性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl PH8.0)中分別放5min。然後轉到2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸三鈉)中漂洗一下，把膜放到乾淨濾紙上，室溫晾乾。
e.80℃，烘膜2hr，用保鮮膜包好後放於4℃備用。
4)預雜交按以下成分配製預雜交液

預雜液配製好後，將保存於4℃的膜取出放入預雜液中，42℃，40rpm，預雜交4hr以上。
5)標記探針取4μL濃度為20ng/μL的DNA探針加入26μL水中，在沸水中變性5min，接著冰浴5min，然後依次加入以下成分5×標記緩衝液 10μLdATP、dGTP、dTTP(每種1.5mM) 2μLBSA(10mg/ml) 2μLKlenow片段(5U/μL)1μLα-32P-dCTP(10μCi/μL) 5μL。
加入上述成分後，在37℃標記4hr左右。其中，5×標記緩衝液的成分如下250mM Tris-HCL(pH8.0)、25mM MgCl2、10mM DTT、1M HEPES(pH6.6)和26 A260u/ml隨機6鹼基脫氧核苷酸。
6)雜交將標記好的探針在沸水中變性10min，在冰上迅速冷卻後加入預雜交液中。在42℃，40rpm條件下雜交16-20小時。
7)洗膜和壓X光片以及陽性克隆的挑選雜交結束後，加入洗膜buffer 1(2×SSC，0.5％SDS)，42℃，40rpm洗1hr。然後再分別用buffer 2(1×SSC，0.1％SDS)和buffer 3(0.2×SSC)，65℃，40rpm各洗1hr。洗膜結束後，用乾淨濾紙吸去膜上的大部分液體，然後用保鮮膜將膜包裹後壓在X光片之下。根據X光片上影像在膜上標出陽性斑的位置。然後再將膜放入對應編號的培養平板上，缺口和平板上的牙籤對齊。根據膜上的標號挑出含陽性斑的培養基放入1.5ml離心管中，加入1ml滅菌1×lambda稀釋液，室溫放置1-2hr，使噬菌體從培養基上擴散出來，然後12000rpm離心10分鐘，收集上清液，用於下一輪篩選。經過5輪篩選和驗證，共得到10個陽性單克隆(圖2A-圖2E)。
4、λ噬菌體DNA提取1)將10個陽性單克隆分別鋪板，每個陽性克隆鋪兩個200mm平板。當每個平板的表面幾乎完全被噬菌斑覆蓋時，取出平板並直接加入15ml的lambda稀釋緩衝液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4)，室溫放置1-2hr，使噬菌體從上層培養基中擴散出來。
2)將lambda稀釋緩衝液從培養皿中移入50ml離心管中，4℃，8000rpm離心20min，除去細菌碎片。
3)將上清移入一新的離心管中，加入RNaseA(終濃度為2μg/ml)，DNase(終濃度為1μg/ml)，37℃消化30min。
4)加PEG8000(終濃度為10％)，NaCl(終濃度為1M)於lambda稀釋緩衝液中，充分混勻，冰浴1hr以上。
5)4℃，11000rpm，離心10min。棄上清，收集管壁上噬菌體顆粒。
6)加1ml 1×lambda稀釋緩衝液重懸噬菌體，並將重懸後噬菌體分裝到1.5ml離心管中(500μL/管)。向每管中加RNaseA至終濃度1ug/ml，DNaseI至終濃度5ug/ml，37℃消化20min。
7)加EDTA至終濃度20mM，終止酶反應；然後加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，破壞噬菌體外殼蛋白，同時將RNase A和DNase消化掉，加SDS至終濃度0.5％，65℃水浴1小時。
8)等體積苯酚、氯仿抽提兩次，氯仿抽提一次。
9)上清加入等體積的異丙醇，沉澱lambda DNA。
10)70％乙醇洗滌沉澱，抽乾後溶於適量TE，取少量電泳檢測，其餘-20℃保存備用5、Lambda噬菌體DNA酶切分析與亞克隆片段測序取10個陽性克隆中1個的λ噬菌體DNA用多種酶進行單酶切和雙酶切分析，它們的組合如下1.HindIII+BamHI，2.HindIII+EcoRV，3.EcoRV，4.HindIII+SmaI，5.SmaI，6.HindIII+PstI，7.PstI，8.HindIII+PvuII，9.EcoRI，10.HindIII，11.HindIII+SalI，12.HindIII+EcoRI。
單酶切體系10×緩衝液5μLLambda DNA30μL限制性內切酶 6μL滅菌水 定容至50μL。
雙酶切體系10×緩衝液5μLLambda DNA30μL限制性內切酶I 5μL限制性內切酶II5μL滅菌水 定容至50μL。
將酶切產物電泳、轉膜後用篩選文庫的探針進行雜交，具體步驟如下1、電泳及轉膜1)將酶解完全的DNA每管加入5μl 10×loading buffer(70％甘油，0.5×TBE，0.2％SDS，20mM EDTA，0.2％溴酚藍)，混勻。樣品於1×TAE(40mM Tris-乙酸，1mMEDTA)電泳緩衝液，0.8％瓊脂糖凝膠，在40cm電泳槽中100v電壓下使得所有樣品從點樣孔進入凝膠，然後在30v恆壓下，電泳16h。
2)將電泳後的凝膠切去多餘膠邊，並切一小角以表明方向，置於0.25M HCl中輕搖15min。
3)將一磁碟加入0.4M NaOH溶液，架上一塊玻璃板，上放4層寬於凝膠的吸水紙，兩頭浸於液體中，濾紙間不能有氣泡。
4)膠用蒸餾水衝洗後，點樣孔向下置於濾紙之上，排盡其間氣泡，膠塊四周放好隔水條。
5)剪長寬比膠塊大1mm的硝酸纖維素膜(Hybond-N+，Amersham)，置於0.4MNaOH中均勻浸透後鋪於膠上，再鋪上四張與膜相同大小的濾紙，其間均不能有氣泡。
6)加數層紙巾，其上壓一塊玻璃板及750g重物，吸印20～24小時。
7)吸印完畢後，用鉛筆做標記，2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸，pH7.0)浸泡10分鐘。
8)將膜移至濾紙上，超淨臺吹乾。
9)將膜夾於濾紙和兩塊玻璃之間，於80℃烘箱中烘1～2小時，用保鮮膜包裹，4℃保存備用。
2、雜交轉膜完畢之後的雜交方法與篩選玉米基因組文庫時所用的雜交方法完全相同，雜交所用的探針也是篩選文庫時所用的探針。雜交結果如圖3B所示。
酶切結果如圖3A所示，酶切結果表明所用的幾種限制性內切酶對λ噬菌體DNA的酶切都比較完全，不同大小的條帶基本都已分開。酶切片段的雜交結果如圖3B所示，表明由HindIII、EcoRV、SmaI、HindIII+SalI、HindIII+PvuII和EcoRI酶切的產物中能雜出信號的片段都比較大，包含有較長的啟動子區域，可以選擇其中一個酶的酶切片段回收，進行亞克隆分析。(圖3A和圖3B中，M為1kb ladder marker；1.HindIII+BamHI，2.HindIII+EcoRV，3.EcoRV，4.HindIII+SmaI，5.SmaI，6.HindIII+PstI，7.PstI，8.HindIII+PvuII，9.EcoRI，10.HindIII，11.HindIII+SalI，12.HindIII+EcoRI)。
根據已知的cDNA序列可知在探針的下遊距離zpu1基因的起始密碼子約1kb的區域有一個HindIII切點，在探針之中有一個EcoRI的酶切位點，探針距離zpu1基因的起始密碼子約300bp左右。由圖3A和圖3B的酶切雜交結果可知HindIII單酶切產物中有信號的片段比較大，雖然可能包含較長的啟動子區域，但是不易連接到測序載體上。由HindIII和EcoRI雙切及EcoRI單切的結果可知EcoRI單切的得到的片段約3～5kb左右，這樣的長度易於連接且包含啟動子的區域也比較長。雖然其他內切酶酶切的片段長度也有適宜的，但是與測序載體上的酶切位點不一致。因此決定回收由EcoRI酶切的片段。然後又用EcoRI酶切了λDNA幾次，確定目標條帶約在3.7kb左右，最後回收該片段將其連接到測序載體pGEM-3zf上，送上海聯眾公司測序。測序結果表明該3.7kb片段全長為3603bp，其中有2267bp是Zpu1基因ATG上遊的5`側翼序列，另外的1332bp序列為Zpu1基因組序列。將3603bp的序列提交GenBank中進行比對，其中1332bp序列中外顯子序列與cDNA序列同源性為100％。說明所得到的2267bp序列確為Zpu1基因的5`側翼序列。
實施例2、zpu1P-4啟動子的克隆及其真核表達載體的構建及轉化菸草一、zpu1P-4啟動子的克隆及其真核表達載體的構建
1、從Zpu1基因5`側翼序列中擴增zpu1P-4啟動子根據測序得到的Zpu1基因的5`側翼序列設計了2條引物P37F和P38R。以連接在測序載體上的3.7kb序列為模板，通過PCR擴增方法從Zpu1基因5`側翼序列中擴增出一條500bp左右的片段。
擴增體系10×buffer 5μLdNTP混合物(每種10mM) 1μLP37F(10μM) 1μLP38R(10μM) 1μLTaq酶(5U/μL)0.5μL模板(濃度為10ng/μL) 0.5μL滅菌水 定容至50μL擴增條件為94℃10min94℃1min，55℃30s，72℃1min(30個循環)72℃10min4℃保存。
結果如圖4所示，將用引物P37F與P38R擴增得到的片段命名為zpu1P-4(序列1，516bp)。圖4中，M為1kb ladder marker；1為zpu1P-4(箭頭所示)。
將擴增出的zpu1P-4片段連接到pGEM@T-Easy測序載體上，送上海聯眾公司測序。測序結果與所得的2267bpZpu1基因的5`側翼序列比較，一致性為100％，表明擴增沒有出現錯配。
2、真核表達載體的構建根據引物P37F和P38R兩端設計的酶切位點，用HindIII和BamHI將zpu1P-4片段從pGEM@T-Easy載體切下，把酶切後回收的zpu1P-4片段與經HindIII和BamHI酶切的pBI121載體片段相連。將連接產物轉化DH5a菌株中，提取質粒DNA，用HindIII和BamHI酶切鑑定、利用引物P37F與P38R PCR鑑定zpu1P-4片段與pBI121載體的連接物。將構建好的載體命名為pBI121-zpu1P-4(其示意圖如圖5所示)。
二、轉化菸草大量提取構建的表達載體(pBI121-zpu1P-4)的質粒DNA，取20μL(約1ug)轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，在28℃、YEB培養基(含卡那黴素Km 100ug/ml，鏈黴素Sm 125ug/ml)上培養兩天。各挑選兩個克隆做菌液PCR鑑定，均擴增出目標條帶。
將含有表達載體的農桿菌接種於YEB培養基(含卡那黴素Km 100ug/ml，鏈黴素Sm 125ug/ml)，28℃振蕩培養至OD600為0.6-0.8，室溫離心10分鐘(4000rpm)。沉澱用MS鹽溶液(pH7.0)懸浮，並稀釋至原體積的20-50倍。取菸草無菌苗葉片，切去葉片邊緣和主脈，將葉片切成約0.4×0.6cm2左右大小，放入製備好的菌液中浸泡5-10min，用無菌濾紙吸乾表面菌液，轉入表面鋪有一層濾紙的MS固體培養基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，pH 5.8)中，28℃暗培養。三天後，轉入MS篩選培養基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那黴素100ug/ml，噻孢黴素250ug/ml，pH5.8)中，28℃光照培養，每日光照12-16小時。每2周繼代一次，每次將變黃的葉片和愈傷組織丟掉，大的愈傷組織切割成小塊，經2-3次繼代後，培養的愈傷組織陸續分化出幼苗。將幼苗轉移入罐頭瓶裝的MS固體培養基(含卡那黴素Km 100ug/ml，鏈黴素Sm 125ug/ml，pH 5.8)中，28℃光照培養，待其根系發育完全後，移栽到溫室中。
實施例3、菸草轉基因後代的分子檢測及zpu1P-4啟動子活性的檢測一、菸草轉基因後代的分子檢測1、菸草總DNA小量提取取菸草幼嫩葉片150mg左右於1.5ml離心管中，研成粉末。加800μL 65℃預熱的SDS裂解緩衝液(0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振蕩混勻。65℃水浴20分鐘，加入250μL 5M KAc，冰浴5分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘。取上清於另一1.5ml離心管中，4℃、12000rpm再離心5分鐘。將上清轉入另一乾淨離心管，加入600μL異丙醇，充分混勻，4℃12000rpm離心15分鐘。最後用70％乙醇清洗沉澱2次，真空乾燥後，加80μL滅菌重蒸水溶解DNA。
2、PCR檢測根據gusA基因的序列設計一對引物P45F和P46R，用這對引物檢測用SDS法提取的轉基因菸草DNA。其中，PCR反應體系組成如下10×緩衝液 2.5μLdNTP混合物(每種10mM)0.5μLP45F(濃度為10uM)0.5μLP46R(濃度為10uM)0.5μLTaq酶(濃度為5U/uL) 0.5μL轉基因菸草總DNA(濃度為20ng/uL) 1μL滅菌水定容至25μL。
PCR檢測結果表明陽性菸草植株與待檢測菸草植株的株數比為72％。
二、支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因的啟動子活性的檢測將PCR檢測結果為陽性的菸草植株，提取其莖、葉和種子的總蛋白，定量檢測gusA基因編碼蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，具體步驟如下1、標準曲線的製作用反應終止液(0.2mol/L Na2CO3)將4-MU(4-甲基傘形酮)配製成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pmol的系列標準濃度，通過測定它們的螢光強度，作出一條標準曲線。
2、總蛋白提取與蛋白濃度的測定1)取0.1g材料於1.5ml離心管中，加入液氮，研成粉末。
2)加600μL酶提取液(0.05M PH7.0磷酸緩衝液，0.1％SDS，0.01M PH8.0EDTA，20％甲醇，0.1％Triton X-100，0.1％巰基乙醇)，在13000rpm 4℃離心10min，取上清於一新的離心管中，-20℃保存備用。
3)取上清，用考馬斯亮藍G250法測定蛋白的含量。
3、β-葡萄糖苷酸酶的酶促反應及其螢光定量1)取50μL含GUS的上清，加入到450μL 37℃預熱的檢測液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混勻。
2)立刻取出50μL加入到950μL反應終止液(0.2mol/L Na2CO3)，將該管作為酶促反應的0點。
3)分別在10min、20min、30min、45min和60min從反應液中取出50μL，轉入950μL的反應終止液中。
4)酶促反應結束後，用螢光分光光度計在激發波長365nm、發射波長455nm下，測定不同時間點的螢光值。
5)根據測定的螢光值以及參與反應的總蛋白，求出GUS活性，GUS活性＝單位時間內反應生成的MU/蛋白量(單位pmol 4-MU.min-1.mg-1蛋白)。
β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性測定結果如表1，表2和表3所示，表明(1)Zpu1基因起始密碼子ATG上遊516bp的序列(zpu1P-4)足以啟動報告基因gusA表達。(2)gusA基因在種子中的表達量比在葉中的表達量高9倍，比莖中高20倍，充分說明zpu1P-4啟動子是種子特異性啟動子。
表1、zpu1P-4啟動子驅動gusA基因在菸草葉中表達


表2、zpu1P-4啟動子驅動gusA基因在菸草莖中表達

表3、zpu1P-4啟動子驅動gusA基因在菸草種子中的表達

序列表16012101211516212DNA213玉米屬玉米(Zea mays L.)4001gtgtgacata gttatccacg aaccaaacag acctttaatg gtgttttgaa tagttttagt60ccataaacca aacatgatag ggactaaatt ttagtctcct aactaaatgt tagtcattga120actaaaggaa ccaaacggat accaatactc aatgtatgga aaagacgaga aatcaataac180tttatcaaat atgagaacca gccgtgaaga catggcagaa taaaaaaaac aaagcaaaag240agctggatat accttaacgg ggaagtcttg acgaaaacaa cattacgtgt atagaaatga300gaagataaag aaaagagata agatggccac ggtagctatt agccaaacaa gcactcttct360agttcttccg tttctcactt tctcttcctg agaatctccc ctttatatga ataatataaa420tgtcacataa gtaaataaac aaataaatca atcaatatta ctacgaagct gtcctcaccg480ccttctctct ccctccgaat ccaaacgcgg acgcaa 51權利要求
1.一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID No1或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子的載體。
3.含有權利要求1所述的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子的細胞系
4.含有權利要求1所述的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子的宿主菌。
5.擴增權利要求1所述的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子任一片段的引物對。
6.權利要求1所述的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子在玉米種子改良中的應用。
7.權利要求1所述的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子在植物生物反應器中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子及其應用。該啟動子具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID №1或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的支鏈澱粉酶型澱粉去分支酶基因啟動子可啟動報告基因gusA基因在種子中特異性表達，說明它能使目的基因在植物的種子中特異性表達，該啟動子將在玉米種子改良和植物生物反應器中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/113GK1789418SQ20041009849
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月13日 優先權日2004年12月13日
發明者王國英, 陳小平, 王章英, 王建華 申請人:中國農業大學