一株產角蛋白酶的金色鏈黴菌及其應用方法
2023-09-19 13:04:05 1
一株產角蛋白酶的金色鏈黴菌及其應用方法
【專利摘要】摘要：本發明公開一株角蛋白產生菌株及其培養條件和粗酶性質，屬於微生物【技術領域】。經鑑定，該菌株為金色鏈黴菌(Streptomycesaureofaciens)，命名為K13，現保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.8047。經初步優化，該菌株的培養基為：羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白腖3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%，氯化鈉0.05%，搖床培養條件為：初始pH值為10.0，接種量10%，培養溫度30℃，轉速220r/min，裝液量30ml/250ml，發酵周期64h，產角蛋白酶活力達到44.2U/ml。該角蛋白酶為中溫鹼性角蛋白酶，最適作用溫度為50-60℃，最適pH為8.5，且該酶在鹼性(pH7.0-10.0)環境中酶活力穩定。
【專利說明】一株產角蛋白酶的金色鏈黴菌及其應用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物【技術領域】，具體涉及一株產角蛋白酶的金色鏈黴菌及其粗酶性質。
【背景技術】
[0002]我國每年產生大量的家禽羽毛和廢次羊毛，其主要成分是角蛋白。由於角蛋白存在大量的二硫鍵、氫鍵和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成環境汙染。角蛋白酶可將家禽羽毛、廢次羊毛降解轉變為可溶蛋白質、多肽或者胺基酸，用作醫藥原料、動物飼料等，變廢為寶，減少環境汙染。許多微生物能產生角蛋白酶，如鏈黴菌、單胞菌、芽孢桿菌等。
[0003]本發明的目的在於提供一株產角蛋白酶的金色鏈黴菌，並初步研究了其粗酶性質。
【發明內容】
[0004]角蛋白酶產生菌株的篩選、鑑定、培養條件優化等方法如下:
(I)平板初篩:從江南大學附近農村羊圈採集土壤樣品，取Ig 土樣添加到IOml生理鹽水中，製備土壤懸液，稀釋塗布至初篩培養基平皿中，30°C培養3d。在分離平板上挑取能生長的較大的單菌落，劃線分離至單菌落。
[0005](2)搖瓶復篩:初篩得到的菌株經搖瓶發酵，測定其上清液角蛋白酶活力，發現13號菌酶活力較高。`
[0006](3)菌株16S rDNA鑑定:提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500 bp,經測序比對,為金色鏈黴菌(Streptomyces aureofaciens),命名為K13,於2013年8月19日保藏在位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8047。
[0007](4)菌株發酵條件初步優化:利用單因素及正交實驗對菌株的發酵培養基及發酵條件進行優化，得到最適培養基配方為羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白腖3-5%，硝酸鈉
0.3%，磷酸氫二鉀0.04%,氯化鈉0.05%,搖床培養條件為:初始pH值為10.0，接種量10%，培養溫度30°C，搖床轉速220r/min，裝液量30ml/250ml，發酵周期64h，產角蛋白酶活力達到44.2U/ml。
[0008](5)粗酶性質研究:分別研究了作用溫度和作用PH對該酶活力的影響，發現該角蛋白酶的最適作用溫度為50-60°C，最適pH為8.5，且該酶在鹼性(pH7.0-10.0)環境中酶活力穩定(土 10%)。該酶為中溫鹼性角蛋白酶。
[0009](6)角蛋白酶活力的測定方法:取一 18ml試管，依次加入粗酶液(發酵上清液)1.0mU0.05mol/l的pH Tris-HCl緩衝液2.0ml、羊毛粉底物IOmg, 37°C恆溫振蕩水浴鍋反應lh，加入0.4mol/l的三氯乙酸2.0mL終止反應，離心取上清液於280nm測定其吸光值。以37°C恆溫振蕩前添加三氯乙酸的反應管作對照。[0010]酶活力定義:在上述反應體系中，280nm下的吸光度值增加0.01個單位為I個酶活力單位(U/ml)。
[0011]其中步驟(1)中所述的初篩培養基為(g/L):羊毛粉5，K2HP04 LNaCl 0.5，瓊脂粉20 ;步驟(2)中所述的復篩搖瓶發酵培養基為(g/L):羊毛粉10，K2HPO4 0.4，NaCl 0.5。
[0012]本發^^所'1飽Pseuckmionas xanthomarina DNl為反硝化細菌,可廣泛應用於各種富營養化水體的淨化。
【具體實施方式】
[0013]實施例1角蛋白酶產生菌株的篩選與鑑定
1、培養基配方
(I)初篩培養基(g/Ι):羊毛粉5，K2HPO4 LNaCl 0.5，瓊脂粉20。
[0014](2)種子液體培養基
高氏培養基(g/Ι):可溶性澱粉 20，KNO3 I, NaCl 0.5，K2HPO4 0.5，M gS04 7H20 0.5， FeSO4.7 H2O 0.01。
[0015]LB培養基(g/Ι):蛋白腖10，酵母粉5，氯化鈉10。
[0016]察氏培養基(g/Ι):蔗糖30，NaNO3 3，K2HPO4 I, M gS04 7H20 0.5, KCl 0.5，FeSO4 7H2O 0.01。
[0017](3)發酵培養基(g/Ι):羊毛粉 10，K2HPO4 0.4，NaCl 0.5
2、平板初篩及角蛋白活力測定
從江南大學附近農村羊圈採集土壤樣品，取I g 土樣添加到10 ml生理鹽水及幾粒玻璃珠的50 ml三角瓶中，搖床振蕩15 min待土樣分散後,靜置5 min,吸取I ml 土壤懸液至9 ml稀釋液(無菌生理鹽水)，得到10_2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀釋至10_7，由此製得各稀釋度土壤懸液。分別吸取各稀釋度懸液0.1 ml至初篩培養基平板(放置過夜，無雜菌生長)，於30°C恆溫培養3d，用接種環逐個挑取生長較大的形態各異的菌落至新的初篩培養基平板，反覆劃線分離至單菌落。
[0018]經初步分離純化，得到32株菌，其中13株為放線菌，18株為細菌，I株為真菌，選擇生長較良好的菌株繼續培養，最終得到18株菌。
[0019]3、搖瓶復篩
將初篩得到的18株菌株，分別採用高氏培養基、LB培養基和察氏培養基進行培養活化製備種子液，按2%的接種量接種至發酵培養基，300C，220 r/min培養64 h，測定發酵上清液角蛋白酶的活力，發現13號菌酶活力較高,為3.9 U/ml ο
[0020]4、16S rDNA 鑑定
提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500 bp，經測序比對，與的金色鏈黴菌的16S rDNA序列同源性高達99%，初步判斷其為金色鏈黴菌{Streptomyces aureofaciens)，命名為 K13。
[0021]實施例2菌株發酵條件初步優化
利用單因素及正交實驗對菌株的發酵培養基及發酵條件進行優化，得到最適培養基配方為羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白腖3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%,氯化鈉0.05%，搖床培養條件為:初始pH值為10.0，接種量10%，培養溫度30°C，搖床轉速220r/min，裝液量30ml/250ml，發酵周期64h。其產角蛋白酶活力達到44.2U/ml，較優化前提高了
10.3 倍。
[0022]實施例3粗酶性質研究
初步研究了所產角蛋白酶的粗酶性質，分別研究了作用溫度(30、40、45、50、55、60、70及80°C)和作用pH (3.0-10.0)對該酶活力的影響，發現該角蛋白酶的最適作用溫度為50-60°C，最適pH為8.5，且該酶在鹼性(pH7.0-10.0)環境中酶活力穩定(± 10%)。該酶為中溫鹼性角蛋白酶。`
【權利要求】
1.一株角蛋白酶產生菌株金色鏈黴菌（Streptomyces atfreo/acie/75.),命名為K13,現保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8047，保藏日期為2013年8月19日。
2.權利要求1所述菌株的培養方法，其培養基為:羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白腖3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%,氯化鈉0.05%,搖床培養條件為:初始pH值為10.0，接種量10%，培養溫度30°C，轉速220r/min，裝液量30ml/250ml，發酵周期64h，產角蛋白酶活力達到44.2U/ml。
3.權利要求1所述菌株所產的角蛋白酶為中溫鹼性角蛋白酶，最適作用溫度為50-60°C，最適pH為8.5，且該酶在鹼性(pH7.0-10.0)環境中酶活力穩定。
【文檔編號】C12N9/52GK103642739SQ201310701537
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】張旦旦, 王月, 史勁松, 許正宏, 張曉梅 申請人:江南大學