製備探針及對游離核酸樣本進行篩選的方法
2023-09-19 13:05:05 3
製備探針及對游離核酸樣本進行篩選的方法
【專利摘要】本發明公開了製備探針及對游離核酸樣本進行篩選的方法，其中探針特異性識別游離核酸，製備探針的方法包括：對游離核酸進行測序，以便獲得多個測序序列；確定該多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，以及多個測序序列的每一個的測序深度；將該測序深度針對該起點在參考序列上的位置進行作圖，其中，測序深度為Y軸，起點在參考序列上的位置為X軸；確定前面所得到的圖中的峰所對應的參考序列上的位置，以便獲得探針目的位點；基於探針目的位點，確定探針的核酸序列；以及基於該核酸序列，合成探針。利用該方法能夠有效地製備特異性識別游離核酸的探針，並且製備獲得探針對游離核酸的篩選捕獲效果好，效率高。
【專利說明】製備探針及對游離核酸樣本進行篩選的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及製備探針以及對游離核酸樣本進行篩選的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著游離DNA的研究不斷深入，游離DNA檢測在無創產前診斷和腫瘤用藥等研究領域得到了廣泛應用，如何高效完整的研究游離DNA成為一個研究和應用熱點。由於游離DNA本身的特點，目前基於全基因組測序的方法成為主要的研究方法，而全基因組測序依然昂貴，限制了廣泛應用。近期一些研究利用DNA序列捕獲的方法，將游離DNA進行捕獲，深度測序，從而發現低頻突變。但是，目前對游離DNA進行捕獲和深度測序的難度大，特別是DNA捕獲效率比較低，無法滿足各領域研究的需求。
[0003]因而，目前對游離核酸進行捕獲的方法仍有待改進。
【發明內容】
[0004]本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種能夠高效地篩選捕獲游離核酸的方法。
[0005]根據本發明的一個方面，本發明提供了一種製備探針的方法。根據本發明的實施例，所述探針特異 性識別游離核酸，所述方法包括以下步驟:
[0006]( I)對所述游離核酸進行測序，以便獲得多個測序序列；
[0007](2)確定所述多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，以及所述多個測序序列比對到參考序列上的每一個鹼基的測序深度；
[0008](3)將所述測序深度針對所述起點在參考序列上的位置進行作圖，其中，所述測序深度為Y軸，所述起點在參考序列上的位置為X軸；
[0009](4)確定所述步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的參考序列上的位置，以便獲得探針目的位點；
[0010](5)基於所述探針目的位點，確定所述探針的核酸序列；以及
[0011](6)基於所述核酸序列，合成所述探針。
[0012]發明人驚奇地發現，利用本發明的製備探針的方法能夠有效地製備特異性識別游離核酸的探針，並且製備獲得探針對游離核酸尤其是來源於參考基因組特定區域例如人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的游離核酸的捕獲效果好，捕
獲效率非常高。
[0013]另外，根據本發明上述實施例的製備探針的方法還可以具有如下附加的技術特徵:
[0014]根據本發明的實施例，所述游離DNA來源於哺乳動物優選人的外周血。
[0015]根據本發明的實施例，利用選自Hiseq、Miseq、1n Torrent、Proton、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。由此，能夠高效地對游離核酸進行測序，並且測序結果準確，可重複性好，從而有利於後續步驟的進行。[0016]根據本發明的實施例，所述參考序列為人類基因組序列。由此，針對來源於人血液的游離核酸樣本，能夠有效地確定多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，進而有效確定步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的參考序列上的位置，以便獲得探針目的位點，進而有利於後續步驟的進行。
[0017]根據本發明的實施例，所述參考序列為選自人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種的序列。由此,針對來源於人血液的游離核酸樣本，能夠有效地確定多個測序序列的每一個的起點在人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種的序列上的位置，進而有效確定步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種的序列上的位置，從而能夠有效獲得探針目的位點，進而基於該位點設計製備的探針能夠特異性識別人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種的序列，利用該探針能夠高效地捕獲游離核酸，進而捕獲的游離核酸測序可以高效地用於檢測人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種的序列範圍內的游離核酸(也可以為其他感興趣的基因序列，例如遺傳病、胎兒發育病相關基因在內的游離DNA序列的捕獲)。
[0018]根據本發明的實施例，基於所述探針目的位點，確定所述探針的核酸序列，包括:在所述參考序列上截取特定序列作為所述探針的核酸序列，其中，所述特定序列包含所述探針目的位點，並且所述特定序列的長度為30~90nt。由此，根據確定的核酸序列製備的探針，能夠特異地篩選捕獲包含探針目的位點的游離核酸。優選地，根據本發明的一些實施例，所述特定序列的長度為60nt。由此，根據確定的核酸序列製備的探針，對包含探針目的位點的游離核酸的捕獲效率更高。需要說明的是，在本文中所使用的表達方式「在所述參考序列上截取特定序列作為所述探針的核酸序列」表示在參考序列上截取包含所述探針目的位點的特定序列，並將該特定序列的互補序列確定為所述探針的核酸序列。即針對同一探針目的位點，所述探針的序列與所述特定序列互補。
[0019]根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種對游離核酸樣本進行篩選的方法。根據本發明的實施例，該方法包括:根據前面所述的製備探針方法，針對所述游離核酸樣本，製備核酸探針；以及利用所述核酸探針對所述游離核酸樣本進行篩選。根據本發明的實施例，利用本發明的對游離核酸樣本進行篩選的方法，能夠有效地篩選捕獲游離核酸尤其是來源於參考基因組特定區域例如人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體和其他遺傳病相關的基因序列和位點的游離核酸，捕獲效果好，捕獲效率非常高。
[0020]根據本發明的實施例，進一步包括:對所得到的經過篩選的游離核酸進行測序。由此，能夠有效確定篩選獲得的游離核酸的序列信息，進而基於該序列信息以及相應的參考序列，能夠有效地確定該篩選獲得的游離核酸是否存在突變，進而這些游離核酸的突變信息能夠為疾病診斷等提供重要依據。
[0021]根據本發明的實施例，利用選自Hiseq、Miseq、1n Torrent、Proton、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。由此，測序效率高，確定的經過篩選的游離核酸的序列信息準確，可靠性好，能夠有效地用於進行突變分析，進而獲得的突變信息能夠為疾病診斷等提供科學依據。
[0022]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0024]圖1顯示了根據本發明的一個實施例，游離核酸測序起點分布圖的代表性示意圖；
[0025]圖2顯示了根據本發明的一個實施例，游離DNA的降解過程示意圖；
[0026]圖3顯示了根據本發明一個實施例的製備探針的方法的流程示意圖；
[0027]圖4顯示了根據本發明的一個實施例，游離DNA的降解過程示意圖；
[0028]圖5顯示了根據本發明的一個實施例，各樣本捕獲的游離核酸測序覆蓋度分布圖；
[0029]圖6為圖4和圖5的疊加圖。
【具體實施方式】[0030]下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0031]需要說明的是，本發明是基於發明人的下列發現而完成的:
[0032]發明人在進行游離DNA相關研究中，通過對多個游離核酸樣本進行深度測序，並統計各測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，以及各測序序列比對到參考序列上的每一個鹼基的測序深度，然後以測序深度為Y軸，以各起點在參考序列上的位置為X軸進行作圖，即為「游離核酸測序起點分布圖」。其中圖1顯示了游離核酸測序起點分布圖的代表性示意圖。基於該圖發明人發現，在特定的區域，游離核酸測序序列覆蓋程度比較高，而在其它的區域，測序序列覆蓋程度非常低，這表明游離DNA是一種降解過程中的DNA，並且其存在一定的降解規律。並且，發明人進一步確定了游離DNA的降解規律，即:游離DNA降解的過程是從約160bp的兩側往中間降解。其中，圖2為游離DNA的降解過程示意圖。
[0033]進而，結合上述的游離DNA降解規律，發明人發現，傳統的探針設計只是根據序列本身的特點，利用重疊的方法覆蓋整個計劃進行捕獲的區域，因而，相對於需要捕獲的目標游離DNA，通過傳統方法設計製備的探針可能或者過長，或者太短無法覆蓋足夠多的區域，使得大量探針被浪費，而降解的DNA卻沒有很好的探針覆蓋。因而，通過傳統方法設計製備的探針在大部分情況下並不適合游離DNA的高效捕獲。
[0034]進一步，發明人發現，如上所述，在對游離DNA進行測序，並將測序序列的測序深度針對測序序列的起點在參考序列上的位置進行作圖後，通過確定該圖中的峰所對應的參考序列上的位置，並以該位置為探針目的位點，進行探針設計而製備獲得的探針，能夠高效地篩選捕獲游離DNA。
[0035]從而，結合發明人的上述發現，本發明提出了一種製備探針的方法，並進而提出了一種能夠高效地篩選捕獲游離核酸的方法，具體如下:
[0036]製備探針的方法[0037]根據本發明的一個方面，本發明提供了一種製備探針的方法，其中所述探針特異性識別游離核酸。
[0038]根據本發明的實施例，結合圖3，本發明的製備探針的方法包括以下步驟:
[0039]( I)對所述游離核酸進行測序，以便獲得多個測序序列。
[0040]其中，根據本發明的實施例，所述游離DNA的來源不受特別限制，根據本發明的具體示例，所述游離DNA來源於哺乳動物優選人外周血。
[0041]根據本發明的實施例，對所述游離核酸進行測序的方法不受特別限制，只要能夠有效獲得測序序列即可。根據本發明的一些具體示例，可以利用選自Hiseq、Miseq、1nTorrent>Proton>S0LiD>454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。由此,能夠高效地對游離核酸進行測序，並且測序結果準確，可重複性好，從而有利於後續步驟的進行。
[0042](2)確定所述多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，以及所述多個測序序列比對到參考序列上的每一個鹼基的測序深度。
[0043](3)將所述測序深度針對所述起點在參考序列上的位置進行作圖，其中，所述測序深度為Y軸，所述起點在參考序列上的位置為X軸。
[0044](4)確定所述步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的參考序列上的位置，以便獲得探針目的位點。
[0045]需要說明的是，前面所述的參考序列不受特別限制，但其與所述游離核酸的物種來源一致，例如，根據本發明的一些實施例，當所述游離核酸來源於人時，所述參考序列即為人類的基因組序列的至少一部分。進而，根據本發明的一些實施例，所述參考序列為人類基因組序列。由此,針對來源於人血液的游離核酸樣本,能夠有效地確定多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，進而有效確定步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的參考序列上的位置，以便獲得探針目的位點，進而有利於後續步驟的進行。根據本發明的另一些實施例，所述參考序列為選自人類染色體，優選人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體上的至少一段的序列。由此,針對來源於人血液的游離核酸樣本，能夠有效地確定多個測序序列的每一個的起點在人類染色體，優選21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一段的序列上的位置，進而有效確定步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的人類染色體，優選21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一段的序列上的位置，從而能夠有效獲得探針目的位點，進而基於該位點設計製備的探針能夠特異性識別人類染色體，優選21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種的序列，利用該探針能夠高效地篩選捕獲游離核酸，進而捕獲的游離核酸測序可以高效地用於檢測人類染色體，優選21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一段的序列範圍內的游離核酸(也可以為其他感興趣的基因序列，例如遺傳病、胎兒發育病相關基因在內的游離DNA序列的捕獲)。
[0046](5)基 於所述探針目的位點，確定所述探針的核酸序列。
[0047]根據本發明的實施例，基於所述探針目的位點，確定所述探針的核酸序列，包括:在所述參考序列上截取特定序列作為所述探針的核酸序列，其中，所述特定序列包含所述探針目的位點，並且所述特定序列的長度為30~90nt。由此，根據確定的核酸序列製備的探針，能夠特異地篩選捕獲包含探針目的位點的游離核酸。具體地，特定序列的長度需要根據步驟(3)中所得到的圖中的實際峰尖位置進行選擇確定，並不限於30~90nt。優選地，根據本發明的一些實施例，所述特定序列的長度為60nt。由此，根據確定的核酸序列製備的探針，對包含探針目的位點的游離核酸的捕獲效率更高。根據本發明的另一些實施例，可以在所述參考序列上從所述探針目的位點開始向下遊截取60nt的核酸序列作為特定序列即設計探針的參考序列。由此，獲得的探針能夠高效地捕獲包含探針目的位點的游離核酸。(6 )基於所述核酸序列，合成所述探針。
[0048]發明人驚奇地發現，利用本發明的製備探針的方法能夠有效地製備特異性識別游離核酸的探針，並且製備獲得探針對游離核酸尤其是來源於參考基因組特定區域例如人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的游離核酸的捕獲效果好，捕
獲效率非常高。
[0049]對游離核酸樣本進行篩選的方法
[0050]根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種對游離核酸樣本進行篩選的方法。根據本發明的實施例，該方法包括:
[0051]首先，根據前面所述的製備探針方法，針對所述游離核酸樣本，製備核酸探針。
[0052]然後，利用所述核酸探針對所述游離核酸樣本進行篩選。
[0053]根據本發明的實施例，本發明的對游離核酸樣本進行篩選的方法進一步包括:對所得到的經過篩選的游離核酸進行測序。由此，能夠有效確定篩選獲得的游離核酸的序列信息，進而基於該序列信息以 及相應的參考序列，能夠有效地確定該篩選獲得的游離核酸是否存在突變，進而這些游離核酸的突變信息能夠為疾病診斷等提供重要依據。
[0054]根據本發明的實施例，對所得到的經過篩選的游離核酸進行測序的方法不受特別限制。根據本發明的一些實施例，可以利用選自Hiseq、Miseq、1n Torrent、Proton、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。由此，測序效率高，確定的經過篩選的游離核酸的序列信息準確，可靠性好，能夠有效地用於進行突變分析，進而獲得的突變信息能夠為疾病診斷等提供科學依據。
[0055]根據本發明的實施例，利用本發明的對游離核酸樣本進行篩選的方法，能夠有效地篩選捕獲游離核酸尤其是來源於參考基因組特定區域例如人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的游離核酸，捕獲效果好，捕獲效率非常高。
[0056]下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，例如可以採購自Illumina公司。
[0057]需要說明的是，下列涉及的附圖中，圖1、圖4-圖6的縱坐標均為測序深度，橫坐標均為測序序列的起點在參考序列上的位置。
[0058]實施例1:
[0059]參照圖3，根據本發明的製備探針的方法，按照以下步驟，設計製備用於捕獲來源於人類21號染色體10163061位置上SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的游離DNA的探針:
[0060](I)利用Illumina Hiseq PE-100程序測序對多個來源於人外周血的游離核酸樣本進行測序，以便獲得多個測序序列，具體操作流程詳見Hiseq操作說明書。[0061](2)確定所述多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，以及所述多個測序序列比對到參考序列上的每一個鹼基的測序深度。其中，該參考序列即為人類21號染色體上SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。即:
[0062]tgccactgcattccagcttgggtggcagaataatactgtctcaaaaaaagcaaaaaaGGATATATAGATAGACAATAGACATATTCTATTACAGATGGAAAGAAATAAACTAAATAGGTT AAACtagatagaaatagataactgttagaacgagatagatggtaggtatataattaatagaaaagacataaattaggac aattaaatgatagacctaggtaaatacataaatgatagatagataacagatatatTATTAATACATAGGAATA GGTGAGTTAAATTACATAAATGATAGagataggtagataaatatatgacagatatatagagagata actggatagatgcatagatgatagagagctagataggcagataatggagggatgataggcaaatagatacagggatag atgataggtagacaactgatacatagattatagatttgatacataaatatatagataAATGGATGGATAATAG AGGATGGATATATAGTAGATGATAAATAGTAGAGAGCTgataggtagatagatagacag ctagctagctaggcggatagatgataggtagagggataattgatacatagattatagattcaatagataaatacatatatag atagatggatagatggatgg (SEQ ID NO:1)。
[0063](3)將所述測序深度針對所述起點在參考序列上的位置進行作圖，其中，所述測序深度為Y軸，所述起點在參考序列上的位置為X軸。結果，見圖4。由圖4可知,游離DNA降解的過程是從160bp的兩側往中間降解。
[0064](4)確定圖4中的峰所對應的參考序列(即上述SEQ ID NO:1所不的序列)上的位置，以便獲得探針目的位點，如下所示，框線所標註的鹼基位置即為峰尖所在位置:tgccactgcattccagcttgggtggcagaataatactgtctcaaaaaaagcaaaaaaGGATATATAGATAGA
CAATAGACATATTCTATTACAGA[tGGA| AAGAAATAAACTAAATAGGTTAAA Ctagatagaaatagataactgt
tagaacgagatagatggtaggtatataattaatagaaaagacataaattaggacaatta aatgatagacct [aggta,aatacataaatgatagatagataacagatatatTATTAATACATAGGAATAGG TGAGTTAAATTACATAAATGATAGagataggtagataaatatatgacagatatata[gagaga| taactg gatagatgcatagatgatagagagctagataggcagataatggagggatgataggcaaatagatacagggatagatgat aggtagacaactgatacatagattatagatttgatacataaatatat^gat^AATGGATGGATAATAGAGG ATGGATATATAGTAGATGATAAATAGTAGAGAG
CTgataggtagatagatagacagctagc tagctaggcggatagat Igatagj gtagagggataattgatacatagat
tatagattcaatagataaatacatatatagatagat ggatagatggatgg (SEQ ID NO:1)
[0065](5)針對上述確定的每一個探針目的位點，在參考序列上從所述探針目的位點開始向下遊截取60nt的核酸序列作為針對所述探針目的位點的特定序列。
[0066]具體地，下面首先列出了針對各探針目的位點的特定序列，即探針設計的參考序列如下所示:
[0067]參考序列1:
[0068]AGACAATAGACATATTCTATTACAGATGGAAAGAAATAAACTAAATAG GTTAAACtagat (SEQ IDNO:2)；
[0069]參考序列2:
[0070]taaattaggacaattaaatgatagacctaggtaaatacataaatgatagatagataacag (SEQ IDNO:3)；[0071]參考序列3:
[0072]ggtagataaatatatgacagatatatagagagataactggatagatgcatagatgataga (SEQ IDNO:4)；
[0073]參考序列4:
[0074]agattatagatttgatacataaatatatagataAATGGATGGATAATAGAGGATGGATAT (SEQ IDNO:5)；
[0075]參考序列5:
[0076]tagacagctagctagctaggcggatagatgataggtagagggataattgatacatagatt (SEQ IDNO:6)。
[0077](6)根據上述各參考序列的互補序列，合成所述探針。
[0078]即所述探針的序列如下:
[0079]探針1:
[0080]atctaGTTTAACCTATTTAGTTTATTTCTTTCCATCTGTAATAGAATATGTC TATTGTCT (SEQ IDNO:7)；
[0081]探針2:
[0082]ctgttatctatctatcatttatgtatttacctaggtctatcatttaattgtcctaattta (SEQ IDNO:8)；
[0083]探針3:`
[0084]tctatcatctatgcatctatccagttatctctctatatatctgtcatatatttatctacc (SEQ IDNO:9)；
[0085]探針4:
[0086]ATATCCATCCTCTATTATCCATCCATTtatctatatatttatgtatcaaatctataatct (SEQ IDNO:10)；
[0087]探針5:
[0088]aatctatgtatcaattatccctctacctatcatctatccgcctagctagctagctgtcta (SEQ IDNO:11)
[0089]實施例2
[0090]利用實施例1中製備獲得的探針,對10個人全血游離DNA進行游離DNA捕獲,其中基於Illumina Hiseq PE-100測序標準進行文庫構建,具體步驟如下:
[0091]1、樣本提取
[0092]將上述的10個人全血樣本進行雙盲標記後，分別進行如下操作以提取各樣本的游離DNA:
[0093]使用的游離DNA提取試劑，對游離DNA進行提取。主要步驟如下:將全血樣本暫存於4°C冰葙中，開啟高速冷凍離心機開關.將採血管放在4°C條件下1600g離心10分鐘，去除殘餘細胞，再於4°c條件下16000g離心10分鐘，去除殘餘細胞，並將上清轉移至新的2ml
離心管中。
[0094]在2mL離心管中加蛋白酶K600 μ L充分溶解並混勻的血漿，漩渦振蕩器混勻10s，
短暫離心。
[0095]加入600 μ L已混勻GB mix,短暫離心；於56°C水浴10分鐘；取出離心管，室溫冷卻5分鐘，短暫離心；加入300 μ L冰凍無水乙醇，輕輕顛倒混勻，室溫放置5分鐘，短暫離心；吸取730~750 μ L到吸附柱中，8000rmp離心30秒，棄廢液，將管子晾乾後，加入500 μ L⑶,8000rmp離心30秒,棄廢液；加入500 μ L溶液PW, 8000rmp離心30秒,棄廢液。12000rmp離心2分鐘，將吸附柱轉移到乾淨的1.5ml離心管上，室溫晾乾3分鐘至乙醇揮發；在吸附柱中間位置加90 μ L TB，室溫溶解5分鐘，12000rmp離心2分鐘，丟棄吸附柱，離心管內為DNA溶液。
[0096]由此，獲得10份游離DNA。
[0097]2、末端修復和接頭連接
[0098]把樣本提取步驟中所得的10份DNA依次編號1_10，使用末端修複試劑盒進行DNA末端的修復，具體步驟:85 μ L DNA溶液，IOX PNK buffer, dNTP2 μ L, T4DNA聚合酶I μ L,Klenow片段I μ L，T4多核苷酸激酶I μ L，總體積100 μ L，20°C溫浴30分鐘。然後對末端修復後的產品進行純化，溶解體積45 μ L0純化完後對每組樣本分別以Illumina HiseqΡΕ-100測序儀公司提供的10套測序接頭進行接頭連接，連接體系:DNA溶液45 μ L，2Χ連接緩衝液50yL，接頭lyL，T4DNA連接酶，總體積100 μ L。20°C，溫浴15分鐘。取出後短暫離心。用磁珠純化時,取150 μ L的磁珠進行產物純化，回收的DNA溶於34.2 μ L體積ElutionBuffer中。由此,獲得各連接接頭的核酸樣本。實驗的同時，記錄下每個樣本對應的樣本組號信息和接頭標籤信息。
[0099]3、PCR 擴增
[0100]預先從_20°C保存的試劑盤取出 dNTP Solution Set (IOmM)、MgSO4 (50mM)，PCR 引物(10Pmol/uL),與步驟 2中所述的Illumina Hiseq PE-100測序儀公司提供的10套測序接頭對應的PCR擴增引物。置於離心管架上室溫溶解，充分混勻後短暫離心；在1.5mL的離心管中配製反應mix，促勻後短暫離心，分裝；MiX分裝好後，混合後短暫離心。PCR反應體系如下:
[0101]
連接接頭的核酸樣本|32.2uL
Platinum Pfx DNA 聚合酶 0.8μ?
[0102]
引物4μ?
MgSO4(50mM)2μ L
dNTP Solution Set~2μ L
10X Pfx緩衝液5μΤ
ddH204μ L
總體積50 μ L
[0103]PCR反應程序為:[0104]98 °C 30min
[0105]98°C IOs — 65°C 30s — 72°C 30s (12 個循環)
[0106]72 °C 5min
[0107]16 °C ①
[0108]反應完成後,用磁珠法進行純化,溶入50 μ L。
[0109]由此，獲得各PCR擴增產物。
[0110]4、DNA 捕獲
[0111]採用Agilent公司的sureselect DNA捕獲試劑,利用實施例1中製備獲得的的探針對各PCR擴增產物進行DNA捕獲，其中捕獲雜交操作按照Agilent公司的sureselectDNA捕獲試劑流程進行，這裡不再做詳細描述。
[0112]由此，分別獲得10份捕獲樣品。
[0113]5、PCR 擴增
[0114]I)從_20°C冰箱中取出 Herculase II Fusion DNA聚合酶、PCR引物，5X HerculaseII反應緩衝液，dNTP mix(每種25mM)，將其置於冰上化凍並充分混勻。
[0115]2)在冰上為上述各捕獲樣品分別配製一份Herculase Master Mix,另外加入一個陽性對照及一個無模板的陰性對照，按以下表格組分配製反應Mix並用移液器混勻:
[0116]
【權利要求】
1.一種製備探針的方法，所述探針特異性識別游離核酸，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)對所述游離核酸進行測序，以便獲得多個測序序列； (2)確定所述多個測序序列的每一個的起點在參考序列上的位置，以及所述多個測序序列比對到參考序列上的每一個鹼基的測序深度； (3)將所述測序深度針對所述起點在參考序列上的位置進行作圖，其中，所述測序深度為Y軸，所述起點在參考序列上的位置為X軸； (4)確定所述步驟(3)中所得到的圖中的峰所對應的參考序列上的位置，以便獲得探針目的位點； (5)基於所述探針目的位點，確定所述探針的核酸序列；以及 (6 )基於所述核酸序列，合成所述探針。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述游離DNA來源於哺乳動物優選人的外周血。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，利用選自Hiseq、Miseq、1nTorrent、Proton、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述參考序列為人類基因組序列。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述參考序列為選自人類染色體，優選人類21號染色體、18號染色體`、13號染色體、X染色體和Y染色體上的至少一段的序列。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，基於所述探針目的位點，確定所述探針的核酸序列，包括: 在所述參考序列上截取特定序列作為所述探針的核酸序列，其中， 所述特定序列包含所述探針目的位點，並且所述特定序列的長度為30~90nt。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述特定序列的長度為60nt。
8.一種對游離核酸樣本進行篩選的方法，其特徵在於，包括: 根據權利要求1~7任一項所述的方法，針對所述游離核酸樣本，製備核酸探針；以及 利用所述核酸探針對所述游離核酸樣本進行篩選。
9.根據權利要求8所述的方法，進一步包括: 對所得到的經過篩選的游離核酸進行測序。
10.根據權利要求9所述的方法,其特徵在於,利用選自Hiseq、Miseq、1nTorrent、Proton、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。
【文檔編號】C12N15/10GK103725673SQ201310701453
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】田埂, 郎繼東, 方建火, 張麗娜 申請人:田埂