一種核酸提取、擴增及檢測集成裝置的製作方法

2023-09-20 06:16:20 1

本實用新型涉及一種核酸提取、擴增及檢測集成裝置。

背景技術：

核酸作為一種分子標誌物已被廣泛的用於疾病診斷，食品安全檢測和環境監測領域。基於核酸的診斷一般包括核酸的提取、擴增和檢測三個部分。傳統的方法主要在實驗室依賴於大型儀器和專業的技術人員，存在成本昂貴，耗時耗力等缺點。而在傳染性疾病頻發、食品安全問題突出、環境汙染嚴重的偏遠地區，這些傳統的方法並不適用，因此嚴重耽誤了該地區人們對疾病的診斷與治療、食品的檢測和環境的監控與治理。

近年來，隨著紙基微流體技術的發展，低成本、微型化、攜帶方便、操作簡單的紙基即時檢測裝置日漸受到人們的關注。目前，市面上已有紙基的提取方法(如：Whatman公司發明的紙上提取核酸的方法(如：FTA卡等))和紙基的核酸擴增與試紙檢測方法(如：BioHelix發明的the BESt cassette產品，包括擴增槽和檢測室)。它們都需要進行複雜的提取和擴增操作，還要依賴於實驗室的大型儀器(如：熱循環儀，冰箱)，仍然存在不便於攜帶、操作複雜、成本昂貴等缺陷。不能實現快速、簡單、便攜的核酸檢測。仍然不適用於資源匱乏地區進行分子診斷。

技術實現要素：

本實用新型的目的在於針對現有紙基核酸提取、擴增和檢測方法存在的缺陷，提供一種核酸提取、擴增及檢測集成裝置，該裝置成本低廉、操作簡單，攜帶方便，且檢測時間短，無需專業技術人員進行操作，效率高，適用範圍廣。

為達到上述目的，本實用新型採用以下技術方案予以實現：

核酸提取、擴增及檢測集成裝置，包括上下扣合的上蓋和基座，基座上設置有紙基核酸提取模塊、紙基核酸等溫擴增模塊和試紙檢測模塊；上蓋上開設有用於滴加樣品的進樣孔、控制按鈕以及試紙結果觀察窗；紙基核酸等溫擴增模塊上設置有能夠移動的U型夾，上蓋的側面開設有用於固定U型夾的固定孔；U型夾包括上下兩層緊密疊加在一起的能夠導熱的金屬片，其中一端為拖動端，另一端為紙片區；紙片區的上層鑲嵌有凍幹的依賴解旋酶的等溫擴增試劑的紙片，下層的相應位置上鑲嵌有核酸吸附紙，拖動端由固定孔伸出；

核酸提取時，紙基核酸提取模塊上的紙基裂解通道的末端與核酸吸附紙相接觸，且紙片不與核酸吸附紙相接觸；

等溫擴增時，紙基核酸等溫擴增模塊上的加熱片與核酸吸附紙和紙片相接觸，核酸吸附紙和紙片上設置有起密封作用避免核酸擴增時氣溶膠汙染的PMMA板；

檢測時，核酸吸附紙位於試紙檢測模塊上的試紙條和層析液存儲槽之間，並與二者相接觸。

本實用新型進一步的改進在於：

所述紙基核酸提取模塊包括清洗液儲液池和裂解液儲液池，清洗液儲液池的下端與紙基清洗通道的入口相連，裂解液儲液池的下端與紙基裂解通道的入口相連；紙基裂解通道的下方設置吸水墊；紙基清洗通道的末端設置紙基閥門，在清洗時，紙基閥門與紙基裂解通道相接觸，將紙基清洗通道和紙基裂解通道相連通。

所述清洗液儲液池和裂解液儲液池內均設置有密封橡膠和海綿，海綿位於密封橡膠的下方。

所述紙基核酸等溫擴增模塊還包括與加熱片相連的電源，加熱片採用陶瓷加熱片。

所述試紙檢測模塊包括側流層析試紙條和層析液存儲槽，層析液存儲槽位於側流層析紙條的末端下方；側流層析紙條與上蓋上的試紙結果觀察窗的位置相對應。

所述側流層析紙條包括依次層疊設置的背膠板、樣品墊、結合墊以及醋酸纖維素膜；層析液存儲槽內放置有用於存儲層析液的海綿。

與現有技術相比，本實用新型具有以下有益效果：

本實用新型具有無需額外儀器、成本低廉、攜帶方便、操作簡單、快速等優點。1)利用計算機軟體設計裝置結構，將核酸提取、擴增及檢測集成於一個裝置內，實現了樣品進到結果出的一體化檢測；2)此裝置只需簡單的四部操作：加樣→按壓提取控制按鈕→拖動U型夾到擴增指示線→拖動U型夾到試紙指示線，整個檢測只需要77分鐘(傳統實驗室檢測需要4-5小時)，無需專業技術人員進行操作，解決了操作簡單、快速的問題。3)紙基提取模塊和試紙檢測模塊與海綿結合解決了提取液和層析液的存儲問題。同時，採用凍幹技術將tHDA擴增試劑存儲在紙上，無需低溫冰箱。另外，擴增加熱採用陶瓷加熱片依靠紐扣電池提供電源，無需大型的加熱裝置。而紙基模塊中，液體靠毛細作用力往前流動，無需外接泵，因此以上方法解決了攜帶方便的問題。4)此裝置所選用的部件和化學反應試劑成本低廉，解決了降低成本的問題。

【附圖說明】

圖1為本實用新型所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置上蓋結構示意圖；

圖2為本實用新型所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置基座結構示意圖；

圖3為本實用新型所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置集成模塊(紙基提取模塊、紙基核酸擴增模塊和試紙檢測模塊)結構示意圖；

圖4為本實用新型所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置基座及其集成模塊的示意圖；

圖5為利用本實用新型檢測不同濃度沙門氏菌的檢測結果。

其中，1-進樣孔；2-控制按鈕；3-固定孔；4-試紙結果觀察窗；5-清洗液儲液池；6-裂解液儲液池；7-儲液孔；8-紙基裂解通道；9-紙基清洗通道；10-吸水墊；11-核酸吸附紙；12-紙片；13-加熱片；14-電源；15-PMMA板；16-U型夾；17-層析液存儲槽；18-試紙條。

【具體實施方式】

下面結合附圖對本實用新型做進一步詳細描述：

參見圖1-4，本實用新型紙基核酸提取、擴增和檢測集成裝置，包括採用3D列印技術列印的光固化樹脂材質的上蓋、基座和基座上的集成模塊，上蓋是扣壓在基座上。上蓋包括進樣孔1、固定在上蓋上的控制按鈕2、固定「U」型夾的孔3和試紙結果觀察窗4。基座上集成模塊包括紙基核酸提取模塊、紙基核酸等溫擴增模塊和測試紙檢測模塊。

紙基核酸提取模塊包括直徑為12mm的清洗液儲液池5和直徑為9mm的裂解液儲液池6，清洗液儲液池5和裂解液儲液池6均由海綿和密封橡膠組成，海綿在下，密封橡膠在上；其中每個儲液池與紙通道相連的位置開有尺寸為5mm×2mm的儲液孔7，儲液孔7分別與紙基裂解通道和紙基清洗通道相聯；裂解通道8一端與裂解液儲液池6相連，一端與核酸吸附紙相連，清洗通道9一端與清洗液儲液池5相連，另一端由紙基閥門組成，與紙基裂解通道相連實現多步操作；核酸吸附紙11被固定在U型夾的下層與紙基裂解通道的一端相連，而U型夾的上層通過一個小梁被隔在上面，在核酸提取過程中不與核酸吸附紙相接處；吸水墊10在核酸吸附紙下面。

紙基裂解通道8和紙基清洗通道9的材質選用普通的濾紙，其進樣區採用直徑為5mm～8mm的濾紙，紙基裂解通道8的尺寸為25mm×5mm，紙基清洗通道9的尺寸為10mm×5mm。核酸吸附紙選用玻璃纖維，其尺寸為5mm×7mm，吸水墊選用吸水紙，其尺寸為30mm×20mm。

紙基核酸等溫擴增模塊包括超薄的陶瓷加熱片、鑲嵌有紙的可移動U型夾16、提供電源14的電池和覆蓋在加熱片上的塑料板。其中U型夾材質為二層可導熱的金屬片緊密疊加在一起，其尺寸為8mm×100mm。其中距離U型夾10mm處開有5mm×7mm的小口，上層鑲嵌有凍幹的依賴解旋酶的等溫擴增tHDA試劑的紙片12尺寸為5mm×7mm，下層相應位置鑲嵌有核酸吸附紙11尺寸為5mm×7mm，同時，上層金屬片上有兩條黑色的指示線，分別為距離拖動端47mm的擴增指示線和距離拖動端62mm的檢測指示線；提供電源的電池選用直徑為12mm的3V鈕扣電池，在未進行擴增時，在基座上安放電池槽底部開有一5mm×2mm的小口用於放置絕緣紙來阻斷電源與電線之間的導通，覆蓋在加熱片上的塑料板選用尺寸為25mm×30mm的PMMA板15，此板是為了避免核酸擴增時的氣溶膠汙染。

試紙檢測模塊包括側流程析試紙條18和層析液儲存槽17。其側流程析試紙由有尺寸為60mm×3mm的背膠板、15mm×3mm的樣品墊、10mm×3mm的結合墊及20mm×3mm的醋酸纖維素膜層疊構成，吸水紙為尺寸為6mm×14mm的「T」型，層析液存儲槽放置了尺寸為10mm×5mm×5mm的海綿用來存儲層析液。

本實用新型按照如下方法來製備：

(1)利用計算機軟體設計上蓋和基座的結構，將設計好的上蓋和基座結構導入3D列印軟體中，用3D印表機分別列印。

(2)用雷射切割機製備相應尺寸的海綿、橡膠密封墊、PMMA板和絕緣疏水紙；

(3)將儲液海綿分別浸泡於相對應的液體中使海綿充滿液體；

(4)根據紙基模塊的尺寸，用雷射切割機製備相應尺寸的紙基通道，用打孔器製備進樣區濾紙片和核酸吸附區玻璃纖維片。

(5)用線切割工具機製備U型夾的銅片。

(6)用冷凍乾燥的方法製備依賴解旋酶的等溫擴增tHDA試劑紙片。

(7)用納米金標記檢測探針，組裝粘貼試紙相關成分，用切割機製備側流程析試紙條。

(8)將紙基核酸提取模塊中的相應部件儲液海綿，密封橡膠，紙基通道，紙基核酸擴增模塊的相應部件陶瓷加熱片，鈕扣電池，絕緣疏水紙，PMMA板，鑲嵌有核酸吸附紙和凍幹的依賴解旋酶的等溫擴增tHDA試劑的紙片的U型夾和試紙檢測模塊的相應部件側流程析試紙條和層析液儲存海綿分別放置於相應的位置。

(9)將集成裝置中的每個部件分別粘貼於基座的相應位置；

(10)將上蓋和基座組裝形成紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置。

本實用新型使用方法如下：

(1)將樣品滴加在進樣孔1處。

(2)按下上蓋的控制按鈕2，等待2分鐘後，提取完成。

(3)用手拖動U型夾到擴增指示線位置處，此時U型夾上的紙片與加熱片緊密接觸，緊接著抽掉電池槽處的絕緣紙，開始核酸擴增，等待60分鐘後，擴增完成。

(4)再次拖動U型夾到檢測指示線位置處，此時U型夾上的紙片區使分隔的層析液海綿和試紙條的樣品墊相連接，樣品靠毛細作用力層析到試紙條上，等待15分鐘後，檢測完成。

(5)通過試紙結果觀察窗觀察檢測結果，對照區域和檢測區域均為紅色時，判定為陽性結果，對照區域為紅色時，判定結果為陰性。

本實用新型樣本的提取流程：把樣品從進樣孔滴加進去，按下控制按鈕，這樣控制按鈕會和密封圈一起擠壓海綿，使海綿中的液體從與紙通道相連的小孔處流出，通過毛細作用力一直到達核酸捕獲區再到吸水墊上。等待2分鐘後，提取工作完成。然後，用手拖動U型夾到擴增指示線，同時，抽掉電池槽背後的絕緣紙，等待60分鐘後，擴增完成。緊接著，再次拖動U型夾到檢測指示線，靠毛細作用力進行檢測，15分鐘後在試紙結果觀察窗觀察檢測結果。

為了驗證此裝置的可行性，採用不同濃度的沙門氏菌樣品進行提取、擴增和檢測，結果見圖5，濃度為106，105，104，103，102，101(CFU/ml)的樣本對照區域和檢測區域均為紅色，判定為陽性結果，100和NC對照區域為紅色時，檢測區域無顏色，判定結果為陰性。

綜上所述，本實用新型裝置在使用時整個過程需要大約70min、操作簡單僅需4步(加樣→按壓提取控制按鈕→拖動U型夾到擴增指示線→拖動U型夾到試紙指示線)、便於攜帶。與現有檢測方法相比，此裝置解決了儲液問題，降低了成本和減少複雜多步操作，不需要使用大型的儀器和專業的技術人員就可以完成。本實用新型在未來可用於資源匱乏地區以實現現場快速檢測。

以上內容僅為說明本實用新型的技術思想，不能以此限定本實用新型的保護範圍，凡是按照本實用新型提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本實用新型權利要求書的保護範圍之內。