人α-乳清白蛋白單克隆抗體及其製備方法與應用的製作方法

2023-09-19 23:38:05

人α-乳清白蛋白單克隆抗體及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種人α-乳清白蛋白單克隆抗體。由保藏號為CGMCC No.7459的小鼠雜交瘤細胞產生。本發明還提供所述人α-乳清白蛋白單克隆抗體的製備方法及應用。所述單克隆抗體可用於檢測轉基因牛奶與奶粉中的人α-乳清白蛋白。本發明的人α-乳清白蛋白單克隆抗體純度高，效價高，靈敏度高，無交叉反應，專一性強，可特異性識別轉基因樣品，直接對外源表達蛋白進行檢測，避免了基因提取費時費力且容易汙染的問題；本發明檢測成本低廉，結果迅速，靈敏可靠，可以穩定、方便地提供準化的試劑，便於實現工業化生產。CGMCC No745920130426
【專利說明】人Ct-乳清白蛋白單克隆抗體及其製備方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及單克隆抗體的製備與應用，尤其涉及一種人α-乳清白蛋白單克隆抗 體及其製備方法與應用。

【背景技術】
[0002] α -乳清白蛋白（a -LA)是分子量小、酸性的、高親和性的Ca2+結合蛋白。它幾乎 存在於所有的哺乳動物乳汁中。人α-乳清白蛋白的分子量為14. 1KD。α-乳清白蛋白是 人乳中的重要組成成分，約佔總蛋白含量的25-35%，而在牛奶中只佔總蛋白含量的2-5%。 α -乳清白蛋白可與Ca2+、Zn2+等多種二價陽離子結合，能促進微量元素的吸收。在乳腺分 泌細胞中，α-乳清白蛋白作為調節亞基通過與半乳糖苷轉移酶相互作用催化乳糖的合成。 最近還發現人α-乳清白蛋白的不同摺疊突變體具有殺菌和誘導腫瘤細胞死亡的功能，還 能與油酸形成複合物殺死皮膚的乳突淋瘤，具有廣闊的應用前景。
[0003] 由於α-乳清白蛋白具有如此重要的功能，人α-乳清白蛋白可以被開發成嬰幼 兒食品，保健品，運動飲料以及抗菌、抗腫瘤藥物等。據FAO預測，全球每年嬰幼兒食品市場 為58億美元，人α-乳清白蛋白已成為這些產品的重要成分，加上其它產品開發，人α-乳 清白蛋白的市場前景非常巨大。但是目前市場上供應的α-乳清白蛋白主要是從牛奶中純 化的牛α-乳清白蛋白，不過由於牛α-乳清白蛋白在牛乳中含量低（1.2g/L)，純化工藝復 雜，而且成本偏高，生產的α-乳清白蛋白無法滿足市場需求。更重要的是，牛α-乳清白 蛋白並不具備人α-乳清白蛋白的一些營養價值和重要功能，因此人α-乳清白蛋白具有 廣闊的開發應用前景。但是由於來源有限，限制了人α-乳清白蛋白作為藥用蛋白和保健 品的使用，因此人們開始利用轉基因動物即動物乳腺生物反應高效表達重組人α-乳清白 蛋白。
[0004] 同時，與轉基因相伴而生的生物安全問題引起了公眾和管理部門的強烈關注和重 視。建立精準、快速的檢測技術併科學、系統地進行生物安全評價，可防止轉基因動物或產 品在研究、生產、銷售時發生擴散、汙染等安全隱患進行檢測和監測技術儲備和支撐。這不 僅是維護消費者知情權和在國際貿易中維護國家利益的必要手段，也是我國履行國際義 務、維護國家形象的重要保障。
[0005] 乳鐵蛋白的檢測方法有很多，其中ELISA檢測法以其快速、準確、靈敏且一次能處 理多個樣而倍受關注。目前國內外用於ELISA檢測的抗體為多克隆抗體，而以單克隆抗體 為基礎建立起的免疫學檢測試劑盒很少。


【發明內容】

[0006] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種人α-乳清白蛋白單 克隆抗體。
[0007] 為了實現本發明的目的，本發明首先提供一株能分泌產生所述人α -乳清白蛋白 單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0008] 雜交瘤細胞ZZY hLY7El，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編 碼：100101 )，保藏日期為2013年4月26日，保藏編號為CGMCC No. 7459。
[0009] 本發明還提供了人α-乳清白蛋白單克隆抗體，其由所述雜交瘤細胞株分泌獲 得。
[0010] 本發明還提供了人α-乳清白蛋白單克隆抗體的製備方法，用重組蛋白a-LF免 疫雌性BALB/c小鼠，取脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合，經ELISA法進行陽性克隆篩選、 通過有限稀釋法進行亞克隆，獲得穩定分泌抗a-LA的5株細胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1。取 雜交瘤細胞(效價較高同時細胞狀態好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化得人α -乳 清白蛋白單克隆抗體。
[0011] 經鑑定腹水製備前細胞上清效價檢測顯示細胞7Ε1效價最高。7Ε1細胞亞型為 IgGl。7Ε1細胞能與免疫原α-LA反應，不與篩選原牛乳鐵蛋白（bLA)反應。用細胞7Ε1制 備腹水，檢測腹水效價為1:81000,腹水純化檢測單克隆抗體效價為1:81000,抗體純度高 於 95%。
[0012] 本發明還提供前述人a-乳清白蛋白單克隆抗體在檢測轉基因牛奶與奶粉中人 a-乳清白蛋白中的應用。
[0013] 所述人a -乳清白蛋白單克隆抗體可用於檢測轉基因牛奶中表達量數量級為g/L 的人a-乳清白蛋白。Western Blot檢測顯示抗體7E1隻與轉基因牛奶及奶粉反應，不與 非轉基因牛奶及奶粉反應。
[0014] 本發明還提供前述人a-乳清白蛋白單克隆抗體在製備用於檢測轉基因牛奶與 奶粉中人a-乳清白蛋白試劑盒中的應用。
[0015] 所述人a-乳清白蛋白的夾心ELISA檢測試劑盒還包括以下試劑中的一種或多 種：
[0016] 1)洗滌液；
[0017] 2)底物顯色液；
[0018] 3)反應終止液；
[0019] 4)人a -乳清白蛋白標準品。
[0020] 所述洗滌液為PBST，所述底物顯色液為TMB，所述反應終止液為2mol/L H2S04。
[0021] 本發明的有益效果：本發明的人a-乳清白蛋白單克隆抗體純度高，效價高，靈敏 度高，無交叉反應，專一性強，可特異性識別轉基因樣品，可直接對外源表達蛋白進行檢測， 同時避免了核酸檢測方法中，基因提取費時費力且容易汙染的問題。檢測成本低廉，結果迅 速，靈敏可靠，而且可以穩定、方便地提供準化的試劑，便於實現工業化生產。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為免疫抗原（6his-MBP-CCG343)及檢測抗原（PGEX-6P-1-CCG343)的表達純 化；
[0023] 其中，la :6his-MBP-CCG343 樣品；lb :6his-MBP-CCG343 穿柱液；Ic : 6his-MBP-CCG343 洗脫 I ;ld :6his-MBP-CCG343 洗脫 2 ;2a :PGEX-6P-1-CCG343 樣品；2b : PGEX-6P-1-CCG343 穿柱；2c :PGEX-6P-1-CCG343 洗脫 I ;2d :PGEX-6P-1-CCG343 洗脫 2 ;
[0024] 圖2為實施例2Western_blot檢測結果圖；
[0025] 其中，1 為 PGEX-6P-1-CCG343 ;2 為 6his-MBP-CCG343 ;
[0026] 圖3為雜交瘤細胞上清與樣品Wester-blot試驗結果；
[0027] 其中，3 :轉人乳鐵蛋白基因奶牛牛奶樣品；5:牛乳清白蛋白；4:轉人α-乳清白 蛋白基因奶粉樣品；
[0028] 圖4為轉基因牛奶及奶粉樣品Western Blot檢測；
[0029] 其中，1:轉人α-乳清白蛋白基因牛奶樣品；2:轉人α-乳清白蛋白基因奶粉樣 品；3 :三元極致牛奶樣品；4 :人α -乳清白蛋白；5 :牛α -乳清白蛋白；6 :三元極致牛奶樣 品；
[0030] 圖5為轉基因牛奶樣品的檢測標準曲線。

【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0032] 轉人α-乳清白蛋白基因奶牛樣品來自中國農業大學農業生物技術國家重點實 驗室；單克隆抗體和多克隆抗體由中國檢驗檢疫科學研究院動檢實驗室構建；日本大耳白 兔購自軍事醫學科學研究院實驗動物中心；人α-乳清白蛋白購自Sigma公司。
[0033] 酶標板購自宏捷成生物公司；HRP標記試劑盒（CatNo31488)購自Pierce公司；山 羊抗小鼠 IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP購自中杉金橋生物公司；TMB (可溶型）購自天根生 物公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、96孔酶標板購自北京宏捷成生物科技有限公司； IgG純化試劑盒購自嘉興行建生物科技有限公司，石蠟油購自BBI公司。
[0034] 層析柱購自Phamacia公司；潤旋儀購自江蘇海門市其林貝爾公司；高速微量離心 機購自美國Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM純水系統購自美國Millipore公司；舒適 性恆溫儀購自eppendorf公司；臺式冷凍離心機、真空濃縮儀購自eppendorf公司；電熱恆 溫水浴鍋購自PolyScience公司；NanoDroplOOO紫外/可見分光光度計購自NanoDrop公 司；恆溫鼓風乾燥箱、搖床購自中國智成公司；紫外凝膠成像系統購自UVP公司；PYY-6C型 穩壓穩流電泳儀、DYCP-31C微型水平電泳槽購自北京六一廠；高壓滅菌鍋、-80°C冰箱購自 日本三洋公司；混合型球磨儀購自Retsch公司；酶標儀，BI0-RAD。
[0035] 轉基因牛奶、奶粉樣品來自中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室，非轉基 因牛奶及脫脂奶粉購自超市。
[0036] 實施例1原核表達人α -乳清白蛋白
[0037] 1、委託寶生物工程(大連）有限公司合成429bp的人α-乳清白蛋白基因連接到 ρΜΒΡ 和 pGEX-6P-l 載體，分別命名為 6his-MBP-CCG343 和 pGEX-6P-l-CCG343,表達並純化 兩種蛋白，其中6his-MBP-CCG343為製備單克隆抗體的免疫抗原，PGEX-6P-1-CCG343為制 備單克隆抗體的檢測抗原，蛋白純化見圖1。其中洗脫1+洗脫2作為免疫抗原，共IOmL (0· 8mg/ml)，洗脫1+洗脫3作為檢測抗原共4mL (0· 7mg/ml)。
[0038] 實施例2製備人乳清白蛋白多克隆抗體，並對原核表達的兩種蛋白進行驗證
[0039] 1、兔免疫血清的製備
[0040] 選擇同一批次健康的雌性日本大耳白兔4隻，隨機分為2組，實驗組和對照組，實 驗組3隻免疫hLA (sigma)，對照組1隻用PBS緩衝液代替hLA免疫，每隻兔子皮下注射總 量為2mL用佐劑乳化好的抗原，每隻兔子5mg，在第3次加強免疫，每隻兔子5mg，後7天，耳 靜脈採血,檢測血清中抗體滴度（間接ELISA法)，如滴度未達到1:104, ODLO以上，則再加 強免疫。在抗體滴度已達到I: IO4後的第10天，心臟採集兔血，分離血清，-20°C保存備用。
[0041] 2、多克隆抗體的提取
[0042] 採用IgG的純化提取試劑盒，按說明書提取血清中的IgG，具體操作如下：
[0043] (I) IOmL平衡緩衝液平衡柱子，流速為lmL/min ;
[0044] (2) ImL注射器將抗體推入純化柱中上樣；
[0045] (3) IOmL的結合緩衝液衝洗柱子，流出的液體收集在EP管中；
[0046] (4) 4mL洗脫液進行洗脫，每mL洗脫蛋白加0. ImL中和緩衝液。
[0047] (5)收集的液體用考馬斯亮藍測定濃度，-20°C儲存備用。
[0048] 純化結果通過考馬斯亮藍驗證，洗脫管2和洗脫管3能滿足要求，濃度約為2mg/ Π?Τ, η
[0049] 3、多克隆抗體與原核表達載體Western-blot試驗
[0050] 選擇1號管和2號管的兔血清分別與PGEX-6P-1-CCG343和6his-MBP-CCG343進 行Western-blot試驗，結果在相應位置均有目的條帶，見圖2。
[0051] 由於多克隆抗體的免疫抗原與原核表達的抗原來源不同，前者來源於人奶(產品 編號L7269 I CAS號9051-29-0 I Sigma)此結果證實表達的抗原具有結合相應抗體的能力，可 用於製備單克隆抗體，前期工作中也嘗試使用編號為L7269的抗原製備單克隆抗體，但結 果未篩選到特異性的單克隆抗體，所以後期使用原核表達的抗原製備單克隆抗體。
[0052] 實施例3單克隆抗體抗體的製備
[0053] 1、小鼠抗體的製備
[0054] 選擇6周齡同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10隻作為實驗動物，隨機分為2組， 實驗組5隻（1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，對照組2隻。實驗組用6his-MBP-CCG343作為免疫 原進行免疫，用PBS緩衝液代替hLA進行免疫作為陰性對照。每隻小鼠皮下注射總量為 100 μ L用佐劑乳化好的抗原（250 μ LPBS溶解Img抗原後與250 μ L弗氏不完全佐劑混合， 共500 μ L，每隻小鼠注射100 μ L)。第一次基礎免疫劑量為每隻小鼠200 μ g，加強免疫免 疫劑量為每隻小鼠200μ g，基礎免疫時使用弗氏完全佐劑乳化，加強免疫時用弗氏不完全 佐劑乳化。基礎免疫後間隔10天進行加強免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加強免疫後7 天,尾靜脈採血,檢測血清中抗體滴度（間接ELISA法)，如滴度未達到1:10 4, ODL 0以上，則 再加強免疫。在抗體滴度達到I: IO4後的第10天眼眶採血，分離血清，_20°C保存備用。
[0055] 2、間接ELISA法檢測免疫小鼠的抗體水平
[0056] 以PGEX-6P-1-CCG343作為包被抗原，包被濃度：10 μ g/mL，利用間接ELISA法檢測 血清抗體水平。實驗組血清稀釋倍數依次為：1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、 1:240000、1:720000 ;對照組血清 1:3000 稀釋。
[0057] hLA間接ELISA法測定的基本操作步驟如下：
[0058] (1)包被：將PGEX-6P-1-CCG343用包被液(磷酸緩衝液ρΗ9· 6)稀釋至10 μ g/mL， 用微量加樣器吸取稀釋後的抗原加入96孔酶標板，100 μ L/孔，置4°C冰箱過夜。
[0059] (2)洗滌：取出ELISA板，棄去孔內液體，在紙巾上輕輕叩打以除去殘留液體，加入 PBST洗滌液，300 μ L/孔，靜置Imin，重複操作3?5次。
[0060] (3)封閉：用微量加樣器按200 μ L/孔加1%BSA，放入37°C溫箱2h。
[0061] (4)洗滌：同步驟2)。
[0062] (5)加待檢樣本：用PBS緩衝液將血清稀釋，血清稀釋倍數依次為：1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600 ;放入 37?溫箱 Ih ;
[0063] (6)洗滌：同步驟2)。
[0064] (7)加酶標抗體：用PBST洗滌液將HRP標記的山羊抗小鼠二抗稀釋到工作濃度 1:5000,每孔加 100 μ L，37°C溫箱孵育 45min。
[0065] (8)洗滌：同步驟2)。
[0066] (9)加底物溶液：避光按100 μ L/孔加入TMB底物溶液，室溫孵育15min。
[0067] (10)終止反應：室溫下加終止液50 μ L/孔,終止反應。
[0068] (11)測0D450值：檢測450nm波長下的OD值，檢測結果見表1。
[0069] 表1.經三次免疫後小鼠血清效價的測定結果
[0070]

【權利要求】
1. 雜交瘤細胞株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)， 保藏日期為2013年4月26日，保藏編號為CGMCC NO. 7459。
2. 人a _乳清白蛋白單克隆抗體，其特徵在於，其由權利要求1所述雜交瘤細胞株分泌 獲得。
3. 權利要求2所述人a-乳清白蛋白單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，用重組蛋 白a -LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合，經ELISA法進行陽 性克隆篩選、通過有限稀釋法進行亞克隆，獲得穩定分泌抗a -LA的雜交瘤細胞，注射至小 鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化即得。
4. 權利要求2所述的人a -乳清白蛋白單克隆抗體在製備用於檢測轉基因牛奶與奶粉 中人a-乳清白蛋白試劑盒中的應用。
5. 權利要求2所述的人a-乳清白蛋白單克隆抗體在檢測轉基因牛奶與奶粉中人 a _乳清白蛋白中的應用。
【文檔編號】C07K16/18GK104419685SQ201310395917
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】林祥梅, 朱振營, 王勤, 劉建, 付偉, 李曉琳, 孫敏, 薛振華 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院