一種定點整合外源基因的方法
2023-09-19 23:29:20
專利名稱：一種定點整合外源基因的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種定點整合外源基因的方法。
背景技術：
溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子，對大部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌均 具有殺滅作用，對於增強嬰幼兒免疫力有著重要的作用，同時溶菌酶在醫療保健，輕工業、 食品業等方面也被廣泛應用。2009年美國FDA批准了世界上首例乳腺生物反應器生產的抗 凝血酶轉基因藥物上市，這標誌著利用轉基因動物生產重組蛋白真正邁入產業化階段。利用乳腺生物反應器生產重組蛋白具有廣闊的市場應用前景，但是傳統的轉基因 技術在乳腺生物反應器研究中仍存在一定的不足。傳統的轉基因研究中，由於外源基因 在基因組中是一種隨機插入，受到位置效應的影響以及載體自身大小限制，不能包含完整 的調控元件往往使外源基因的表達量水平較低，甚至不表達或者異位表達(Clark，1994 ； Dobie 1996 ；Kim, 2007)。同時，由於外源基因的多拷貝隨機插入到宿主基因組中，這種整合 對宿主自身來說可能也存在一定風險(Seggewis，2006 ;McCormack，2004)。這些不利因素 大大降低了轉基因動物育種的可靠性，提高了成本，不利於轉基因育種的發展。食品規範委 員會和美國FDA頒布的轉基因動物規範條例中也明確提出需充分重視這個問題。因此需要 我們尋找使外源基因表達量更高，同時具有較高育種安全性和可靠性的新方法去改變傳統 的轉基因育種。為了提高外源基因的表達量，克服轉入基因受到位置效應的影響，人們嘗試 了多種方法，如在載體中加入了核基質附著元件(MAR)、位點控制元件(LCR)、絕緣子 (Insulator)等元件來克服外源基因表達受到位置效應的影響，但是由於基因表達調控的 複雜性，仍不能取得很好的效果，而且外源基因在基因組上仍是隨機插入，降低了轉基因的 可控性和安全性，這仍是在傳統轉基因研究急待解決的問題。基因打靶技術的出現克服了 傳統轉基因的弊端，大大提高了轉基因的可控性。基因打靶是基因靶向操作的一門轉基因 技術，利用外源基因與基因組序列間的同源性進行同源重組(homologous recombination) 來實現定點對染色體進行修飾的一門技術，具有位點專一性強，可以穩定遺傳以及外源 基因不受位置效應影響，對鄰近基因也沒有影響等優點，將成為今後一種較理想的改造 物種基因的操作方法。2000年K. J. McCreath利用基因打靶的方法將人抗胰蛋白酶基因 (AAT)定點整合到羊原膠原基因座上(C0L1A1)，羊乳中人抗胰蛋白酶表達量為650yg/ ml (McCreath，2000)，遠高於之前McClenaghan隨機整合表達人抗胰蛋白酶的轉基因羊乳 中lSyg/ml的表達量(McClenaghan，1991)，克服了傳統轉基因受位置效應影響使蛋白低 水平表達的弊端。利用基因打靶進行轉基因獨有的優勢使轉基因研究具有了可控性，在轉 基因動物育種方面明顯的提高了轉基因的成功率，提高了轉基因動物自身的安全性，降低 了轉基因育種的風險，同時便於規模化的育種。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效定點整合外源基因的方法，其可以大幅提高外源基 因的表達量，提高育種成功率和安全可靠性。本發明提供的定點整合外源基因的方法，其是採用基因打靶的方法將人溶菌酶基 因或其它目的基因定點整合到牛、羊或兔等哺乳動物的乳腺特異表達蛋白的靶標基因座 上，使溶菌酶基因或其它目的基因捕獲完整的乳腺特異表達蛋白調控序列以及基因座上的 調控序列，來實現人溶菌酶或其它目的蛋白在動物乳腺中的高效表達。這是首次嘗試利用 基因打靶的方法使外源基因捕獲動物乳腺特異表達蛋白調控元件指導人溶菌酶的在乳腺 中表達，同時我們用人溶菌酶的基因組序列代替cDNA序列，可使溶菌酶獲得更高的表達 量。利用這種新的方法可以克服以往轉基因外源基因隨機整合存在的種種不足，提高轉基 因育種的成功率。根據本發明的一種優選實施例，採用基因打靶的方法將人溶菌酶基因定點整合到 牛asl-酪蛋白基因座上，得到了一種根據上述方法構建的打靶載體，其具有如圖15中所示 的LYZ-K-in載體結構。其可以在牛乳腺中高效表達生產人溶菌酶或其它重組蛋白。上述技術方案具有如下優點(1)人溶菌酶或其它目的基因在乳腺中轉錄非常活躍的酪蛋白基因座定點整合， 克服位置效應，避免目的基因表達沉默，可以實現人溶菌酶或其它重組蛋白在乳腺中較高 水平表達，提高了轉基因育種的成功率，同時可以節約後期生產純化重組蛋白成本；(2)目的基因在染色體定點整合，避免了隨機插入以及多拷貝插入對鄰近重要基 因表達的影響(如插入突變、多拷貝的插入引起染色體不穩定、鄰近基因功能失活、激活原 癌基因、失活抑癌基因等)，提高了轉基因的安全性、可控性，消除部分人群對轉基因食品安 全性顧慮；(3)利用基因完整的內源性啟動子指導外源基因表達，可以實現人溶菌酶基因或 其它目的基因較高水平的表達，同時減少了由於傳統轉基因研究中調控元件不完整造成的 異位表達，提高轉基因成功率；(4)本方案中利用人溶菌酶基因組序列代替cDNA序列，能提高人溶菌酶的表達量。
圖1是本發明實施例1中同源左臂PCR擴增的結果，其中M :lkb marker ;1_3:同 源左臂PCR擴增產物；圖2是本發明實施例1中同源右臂PCR擴增的結果，其中1-5 同源右臂PCR擴增 產物；M :lkb marker ；圖3是本發明實施例1中人溶菌酶基因PCR擴增的結果，其中1-4 人溶菌酶基因 PCR 擴增檢測；M Ikb marker ；圖4是本發明實施例1中LYZ-k-in打靶載體酶切驗證結果， 其 中 1 :SalI (5597bp + 16278bp) ；2 Xho I (6243bp + 1 5632bρ) ；3 =NotI/ Sail (5597bp + 5526bp + 10752bp) ；4 :NotI/XhoI (2593bp + 6243bp + 13039bp) ；5 HindIII(4474bp+17401bp) ；6 =NotI(linear,21875bp) ；7 :P1 asmid as control ;M :Ikb marker ；
圖5是本發明實施例1中asl_酪蛋白和人溶菌酶基因融合示意圖；其中F1，R1和 F2，R2示RT-PCR檢測引物位置；圖6是本發明實施例1中RT-PCR FlRl引物檢測結果，其中M=Ikb marker ； 1-4 陽性細胞檢測結果；5-6 未轉染C127對照；7-8 :RNA模板；9 :H20作為模板；10 :cDNA檢測；圖7是本發明實施例1中RT-PCR F2R2引物檢測結果，其中M=Ikb marker ； 1-4 F2R2引物檢測結果；圖8是本發明實施例1中對RT-PCR引物F2R2PCR產物測序比對結果，DNAMAN1序 列為PCR產物測序結果，DNAMAN2序列為NCBI公布序列asl-酪蛋白非翻譯mRNA和人溶 菌酶基因融合mRNA ；方框標註序列分別為限制性內切酶BioI位點、溶菌酶mRNA翻譯起始 (ATG)和翻譯終止序列(TAA)；圖9是本發明實施例1中Western-blot檢測溶菌酶在乳腺細胞中表達，其中1 未轉染打靶載體C127細胞誘導；2 轉染打靶載體細胞未誘導；3 轉染打靶載體細胞誘導；圖10是本發明實施例1中妊娠期第42天的胎兒；圖11是本發明實施例1中同源重組示意圖，其中A 酪蛋白基因座；B :asl-casein 基因結構圖；C:基因打靶載體；D 同源重組後人溶菌酶整合位點；3' HRF和3' HRR引物 如上圖所示；圖12是本發明實施例1中靶細胞PCR鑑定，其中1_2 發生同源重組的細胞；3 094基因組作為陰性對照；4 基因打靶載體作為對照；5 =H2O ；M =Ikb marker ；圖13是本發明實施例1中對中靶細胞PCR產物測序結果，其中下劃線部分為同源 右臂下遊引物，方框部分為同源右臂側翼序列(asl-酪蛋白基因中同源右臂下遊序列)；圖14是本發明實施例1載體構建流程圖；圖15是本發明實施例2定點整合人乳鐵蛋白基因的基因載體圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。以下實施例所使用的載體、菌種、試劑及其來源Plox載體購於軍事醫學科學院，小鼠C127細胞購於中科院上海細胞所；催乳素、 胰島素、氫化可的松均為Sigma產品；Pyrobest高保真酶、LA-Taq長片段擴增酶、T4DNA連 接酶、內切酶、PMD19-T載體均為Takara公司產品；匪LV反轉錄酶為Promega產品；T0P0-T、 Lipo-2000載體購自hvitrogen公司；質粒純化試劑盒為Omega公司產品；人溶菌酶標準 品和兔抗人溶菌酶一抗均為CALBI0CHEM產品；HRP標記的羊抗兔二抗購於中杉金橋公司。 酶切、連接、回收、轉化、基因組提取、PCR擴增等常規分子生物學實驗操作步驟詳見《分子克 隆(第三版)》。實施例1 :asl-酪蛋白基因座定點整合其它目的基因打靶載體構建(以人溶菌酶 基因為例)1.基因打靶載體的構建1. 1同源臂的擴增、測序根據GeneBank公布的牛asl-酪蛋白序列(Genebank號X59856)設計了上遊引物(見 SEQ ID NO. 1) 5 『 -ATTTGCGGCCGCTAATGTTCCTGTCATACAACTGTGAAT-3 『，引入 NotI 酶 切位點；下遊引物(見SEQ ID NO. 2)5' -CCCTCGAGGTCAAGATCTATGTAAGAAAATAAAATAG-3『， 引入XhoI酶切位點，用來擴增同源左臂(L eft arm,9354-11939, 2586bp)0同時設計了上 遊引物(見 SEQ ID NO. 3)5' -ACGCGTCGACAACCATGAAACTTCTCATCCTTAC-3『，引入 SalI 酶 切位點；下遊引物(見 SEQ ID NO. 4) 5 『 -ACGCGTCGACACATTCTTGGGTATGATAGCACTGC-3 『，引 入Mil酶切位點，用來擴增同源右臂(Right arm, 11940-17530，5591bp)。利用上述合成的 兩對引物分別用Pyrobest和LA-Taq酶以094牛胎兒成纖維細胞基因組DNA為模板分別擴 增得到了同源左臂(圖1)和同源右臂(圖2)。對擴增得到的同源左臂和右臂分別連接到 了 PMD19-T和TOPO-T載體進行測序，序列同源性均為99%以上，構建完成Left arm-T和 Right arm-T 載體。1. 2人溶菌酶基因序列擴增、測序根據GeneBank公布的人溶菌酶序列(Genebank號X14008)設計上遊引物(見 SEQ ID NO. 5) 5 『 -CCGCTCGAGAACATGAAGGCTCTCATTGTTC-3 『，引入 XhoI 酶切位點；下遊弓丨 物(見 SEQ ID N0. 6) 5 『 -CCGCTCGAGTAGAAGTGTAATATGAGGCCAG-3 『，引入 XhoI 酶切位點，以 人基因組DNA為模板擴增得到了人溶菌酶基因序列，包括溶菌酶自身加尾信號(544-6780， 6236bp)(圖；3)，並且連接到Τ0Ρ0-Τ載體進行測序驗證。測序結果顯示擴增得到的人溶菌 酶序列外顯子以及剪切位點均未發生突變，構建完成了 LYZ-T載體。1. 3基因打靶載體的構建以Plox載體為骨架載體(7460bp)，用Mil酶切Plox載體和Right arm-T回收 並連接，完成載體R-PLOX的構建。將構建完成的R-PLOX載體用NotIJhoI酶切回收，因為 Left arm和PMD19-T載體大小接近，所以用NotI、XhoI、PvuI酶切後回收Left arm片段，然 後連接到R-PLOX載體完成L-P-R載體的構建。最後用B10I分別酶切LYZ-T和L-P-R載體將 回收得到的WZ序列連結到L-P-R載體B10I位點，完成打靶載體的構建，命名為LYZ-K-in。 對完成的打靶載體進行酶切(圖4)和測序驗證(構建流程見圖14)。2.打靶載體乳腺細胞表達驗證試驗中，基因打靶載體左臂擴增區域為asl_酪蛋白promoter區、外顯子I和部分 外顯子II區域，因此將打靶載體轉染小鼠C127乳腺細胞可以檢測同源左臂能否指導人溶 菌酶的正確表達，驗證載體的正確性。2.1細胞轉染將LYZ-K-in打靶載體用NotI線性化後參照Lipo-2000轉染試劑說明轉染小鼠乳 腺癌細胞C127。轉染4 後細胞按1 6傳代同時加入800yg/ml G418進行篩選，每三天 換一次液，7天左右有克隆點形成，繼續篩選三天，收集細胞用於後期檢測。將篩選得到的細胞用含有催乳素、胰島素、氫化可的松的DMEM誘導4 後，收集細 胞上清並用超濾離心管(％il，3KD)進行超濾濃縮50倍，細胞用於RNA提取和蛋白收集。
( 催乳素 2pg/ml 誘導液濃度 胰島素 lOpg/ml
『 氫化可的松 15pg/ml
2. 2RT-PCR 檢測取誘導細胞收集的1 μ g總RNA進行反轉錄，將反轉錄得到的cDNA作 為模板，以 LYZ 鑑定弓丨物Fl (見 SEQ ID NO. 7) 5 『 -TGCAAAGAGGGTTGTCCGTGAT-3 『，Rl (見 SEQ ID NO. 8) 5 『 -CAATACTTGTAAGCTCATCTGCCTC-3 『禾口 LYZ 融合鑑 定弓丨物F2(見 SEQ ID NO. 9)5 『 -CTTGCTGCTTCTTCCCAGTC-3 『，R2 (見 SEQ ID NO. 10)5 『 -TGATAAGAACTGAATGTGGC-3 『分別進行擴增檢測到 了 1049bp 的 LYZ mRNA 和 1088bp ^asl酪蛋白和LYZ的融合mRNA片段(圖5、6、7)。對引物F2、R2擴增得到的1088bp 序列回收、T-A克隆並進行測序，測序結果顯示，asl-酪蛋白5'非翻譯區mRNA和溶菌酶 mRNA正確融合，並且編碼區沒有發生突變(圖8)。結果表明經過mRNA剪切和拼接，asl-酪 蛋白非翻譯區mRNA和人溶菌酶mRNA正確融合。2. 3ffestern blot 檢測超濾濃縮後的上清中蛋白用碧雲天BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定濃度後，分別以 未誘導陽性細胞上清和細胞裂解蛋白、誘導的陽性細胞上清和細胞裂解蛋白、C127誘導上 清作為陰性對照，上樣量為30 μ g。15% SDS-PAGE膠50V，Ih ；90V, 2h進行電泳。電泳完畢 後利用Bio-Rad溼轉轉膜儀350mA，轉膜30min。轉膜完成後用5%脫脂奶粉封閉過夜，然 後兔抗人一抗(1 3000稀釋)進行孵育lh，TBST洗膜3X lOmin，然後HRP標記的羊抗兔 二抗(1 10000稀釋)孵育lh，TBST洗膜3X10min，最後進行BCL顯色。Western結果顯 示，經過誘導後，陽性細胞上清中有人溶菌酶的表達，而C127細胞上清中沒有檢測到。在未 經誘導條件下，陽性細胞上清和裂解蛋白均沒有檢測到溶菌酶表達(圖9)。上述結果表明 同源左臂可以指導人溶菌酶正確表達且人溶菌酶自身信號肽可以弓I導溶菌酶的分泌。2. 4重組人溶菌酶活性檢測配置溶菌酶標準溶液，濃度分別為100、150、200、250、300、350、400U/mL。取90ul 溶壁微球菌懸浮液(OD46tl = 0. 9)置於96孔板中，迅速加入酶液10 μ L，利用TECAN酶標儀 震蕩混勻5S後，測定460nm下的光吸收值。從測定讀數起計時，每隔Imin記錄一次，每組 數據重複三次以上。以0到1分鐘的OD46tl的差值平均值為縱坐標，以標準酶濃度為橫坐標 製作標準曲線。根據標準曲線，我們可以得到回歸方程:y = 0. 0002x-0. 004,R2 = 0. 9954. y表示OD46tl差值，χ代表酶活力(U/mL)。利用上述方法對陽性細胞進行抗菌能力檢測，結果 顯示，細胞上清中溶菌酶的抗菌活力為140U/mL，而陰性對照C127細胞中基本檢測不到抗 菌活性。3.牛成纖維細胞篩選3. 1牛胎兒成纖維細胞系建立牛胎兒成纖維細胞建立採用胰酶消化法。具體方法如下a.屠宰42day的母牛，取 出胎盤放入DMEM培養基中，1 回到實驗室(圖10)。b.在含有5 XDPBS的細胞培養皿中 剔除胎兒頭、四肢、內臟及軟骨組織，將剩餘組織放入一個新的IOcm細胞培養皿中，用眼科 剪儘量剪碎。c.加入Iml完全培養基，用剪頭的Iml槍頭將組織碎塊及培養基轉移到15ml 的離心管中，加入7ml DPBS,用移液器吸打幾下，待組織塊沉下後，吸棄上清，重複洗滌一 次。d.向15ml離心管中加入IOml 0. 25%胰酶，然後37°C水浴中消化30min。e.小心吸取 上清細胞懸液到另一 15ml離心管中，室溫1200rpm，離心5min收集細胞。重複d、e步驟各 一次並收集細胞。f.將離心獲得的細胞按照IXlO6/瓶的濃度接種T25細胞培養瓶中，置於37. 55% CO2培養箱中培養，每隔兩天換一次液，待細胞長滿後凍存，並命名為094牛 胎兒成纖維細胞。3. 2細胞轉染細胞轉染採用amaxa nucleofector進行電轉。具體流程如下將消化並收集的兩 瓶T25細胞(約8X IO6)、線性化的打靶載體12 μ g和400 μ 1 Nucleofector試劑混勻分裝 4個電擊杯進行電擊，然後分別在四瓶T-25培養皿中培養。4 後將培養的細胞消化並鋪 到60個IOcm的皿中含有500 μ g/ml G418和2 μ M GANC的培養基進行細胞篩選，篩選約10 天后挑取單克隆共15個到48孔板培養。待細胞90%匯合後擴繁至M孔板培養，有9個克 隆點生長狀態較好，然後將長滿後的細胞一半凍存，一半用於基因組提取和PCR鑑定。3. 3同源重組鑑定將得到的9個克隆點的細胞提取基因組，取50ng的基因組DNA用於PCR檢測。PCR 檢測上遊引物為 3' HRF (見 SEQ ID NO. 11) :5' -GGTGGGATTAGATAAATGCCTGC-3 『，設計在 序列 neo 中，下遊引物為 3' HRR(見 SEQ ID N0. 12) 5' -GAGTTGAGTAAAAAGTATTGCGG-3 『， 設計到3'同源臂的外側，只有發生同源重組的細胞才能擴增出目的條帶(圖11)。PCR檢 測結果顯示，在得到的9個克隆點中有1個克隆點細胞發生同源重組，擴增檢測到了 6731bp 的目的片段(圖12)，對擴增得到的目的片段回收測序，結果顯示，PCR產物5』端為新黴素基 因序列，3』端為同源右臂側翼序列(圖13)，與同源重組後預期序列相一致，這表明該克隆 點確實為中靶的陽性細胞，人溶菌酶基因定點整合到了牛asl-酪蛋白基因座上。然後將中 靶細胞克隆用於核移植。結果表明打靶載體定點整合到了 asl-酪蛋白基因座中，且HSV-TK 負篩選基因經過同源重組而沒有整合到基因組中。實施例2 :asl-酪蛋白基因座定點整合其它目的基因打靶載體構建(以人乳鐵蛋 白基因為例)按照上述載體構建的方法，從人乳腺組織中提取總mRNA，反轉錄得到cDNA. 參照NCBI公布人乳鐵蛋白基因序列(Genebank號NM_002343)分別設計上下遊 弓I 物hLF 上遊弓I 物，TGCAAGCTTACCATGAAACTTGTCT(見 SEQ ID N0. 13) ；hLF 下遊 弓丨物，ACGTCTAGAAGCTGGGCCATCTTCTTCG(見 SEQ ID N0. 14)。以反轉錄得到 cDNA 為模板，用高保真酶擴增得到2155bp的hLF編碼區，利用HindIII和)(baI酶切 位點亞克隆到PCDNA3. 1載體，並進行測序。測序結果顯示與公布的序列同源性 100 %。利用上遊引物 TGCCTCGAGACCATGAAACTTGTC (見 SEQ ID N0. 15)和下遊引物 GTACTCGAGTAGAGCCCCAGCTGGT(見SEQ ID N0. 16)擴增得到M49bp的含有人乳鐵蛋白編碼 框和牛生長激素基因加尾信號(bGH pA)的DNA序列，然後將擴增得到的序列B10I酶切正 向連接到實例IL-P-R載體B10I位點，完成牛asl-酪蛋白基因座定點整合人乳鐵蛋白基 因的打靶載體的構建(圖15)。利用此方法，可以通過細胞篩選將目的基因定點整合到牛 asl-酪蛋白基因座，並通過核移植等方法得到乳腺特異高效表達外源基因的轉基因牛，同 樣地，通過本發明所公布的方法，可以將血液蛋白、治療性單克隆抗體等目的基因定點整合 到牛、羊、兔等動物的asl-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、β乳球蛋白等能在乳腺高效特 異表達的基因座上，並通過核移植等方法得到乳腺特異高效表達外源基因的轉基因動物。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種定點整合外源基因的方法，其特徵在於，採用基因打靶的方法將外源基因定點 整合到哺乳動物的乳腺特異表達蛋白的靶標基因座上。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物為牛、羊或兔。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述外源基因為人溶菌酶基因或人乳鐵 蛋白基因。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述外源基因採用基因組序列。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述乳腺特異表達蛋白為asl_酪蛋白、 β-酪蛋白、Y-酪蛋白或β乳球蛋白。
6.利用權利要求1-5任一項所述的方法得到的打靶載體。
7.含有權利要求6所述的打靶載體的宿主或細胞。
8.權利要求6所述的打靶載體用於在動物乳腺中表達生產目的蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種定點整合外源基因的方法。以人溶菌酶為例，其是採用基因打靶的方法將人溶菌酶基因定點整合到牛as1-酪蛋白基因座上，使溶菌酶基因捕獲完整的as1-酪蛋白調控序列以及酪蛋白基因座上的調控序列，來實現人溶菌酶在牛乳腺中的高效表達。利用這種新的方法可以將目的基因定點整合到有利於自身表達的基因座上，克服以往轉基因外源基因隨機整合存在的種種不足，提高轉基因育種的成功率。
文檔編號C12N15/63GK102080101SQ20101056766
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月25日 優先權日2010年11月25日
發明者成功, 李寧, 湯波 申請人:北京濟福霖生物技術有限公司