利用一種融合標籤提高外源蛋白質的表達量的製作方法

2023-09-19 23:35:45

專利名稱：利用一種融合標籤提高外源蛋白質的表達量的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種在枯草芽孢桿菌中提高外源蛋白質表達量的新方法。更特殊地涉及枯草芽孢桿菌鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸(Hag50)作為融合標籤來實現外源蛋白質的過量表達。
背景技術：
大腸桿菌一直是表達外源蛋白的首選表達系統.但由於外源蛋白在表達過程中容易被宿主細胞蛋白酶降解或者形成包涵體，而且大腸桿菌那樣具有熱源性脂多糖，其應用受到了限制.由於枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的遺傳學背景清楚，而且是一種食品級微生物，所以近年來枯草芽孢桿菌作為外源基因表達的宿主發展迅速並展現出良好的工業應用前景。雖然主要利用枯草芽孢桿菌實現外源蛋白質的分泌表達，但是在枯草芽孢桿菌中成功胞內表達的例子也很多(Zweers JC, Barak I, Dorte B, et al. Micro Cell Fact, 2008, 7 :10)。綠色突光蛋白質(Green Fluorescent Protein, GFP)廣泛應用於報告蛋白、融合標記、蛋白質定位等領域。GFP作為一種新型的定量檢測手段，已經廣泛的應用到生物技術的各個方面。
蛋白質的表達量一直是科研工作者關心的重點。通過優化啟動子和核糖體結合位點，共表達分子伴侶，降低蛋白酶表達量，優化編碼基因的密碼子等手段能明顯的提高外源蛋白質的表達量。但是對於一些外源蛋白質，雖然通過以上優化表達量仍然很低或者達不到工業化生產的要求。所以，發現新的能提高外源蛋白質表達量的方法尤為重要。本發明是以GFP為報告蛋白質，通過N端融合Hag標籤而·嘗試提高GFP的表達量。發明內容
本發明的目的通過融合分子標籤Hag50 (Hag的前50個胺基酸)，提高報告蛋白質 GFP的表達量。
本發明所採用的技術方案是
枯草芽孢桿菌鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸(Hag50)作為融合標籤提高外源蛋白質的表達量。具體的，是利用枯草芽孢桿菌鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸(Hag50)編碼基因hag50為分子標籤，與外源目的蛋白基因的編碼序列(GFP)進行融合，構建能夠融合表達重組蛋白的質粒，並轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，從而實現融合蛋白質的表達。本發明選擇鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸(Genbank序列號M26948)作為融合標籤，選擇易檢測和表達毒性低的GFP為外源基因，以具有轉化能力且遺傳學特性清楚的枯草芽孢桿菌菌株作為重組質粒的轉化菌株，如Bacillus subtilis 168及其衍生菌株。
本發明涉及鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸(Hag50)，將該片段的編碼基因與外源目的蛋白基因的編碼序列融合後構建成重組質粒pMA5-Hag50-GFP，該質粒中含有強啟動子 HpaII, Hag50的編碼基因以及外源目的蛋白基因(GFP)，它可在枯草芽孢桿菌中表達融合蛋白。
本發明涉及的構建的融合表達重組蛋白的重組質粒轉化枯草芽孢桿菌後得到的重組菌株，組成型的表達外源目的蛋白GFP，可通過螢光光譜儀檢測重組蛋白GFP的螢光強弱。本發明中的空白對照是把GFP基因直接連接到質粒pMA5上，構成重組質粒pMA5-GFP。 螢光檢測採用日立F-7000型螢光光譜儀，檢測時的激發波長是488nm，發射波長是547nm。 螢光強弱用「相對螢光強度單位」表示。
本發明涉及鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸編碼序列Hag50擴增的引物序列
hag-F AGTGCATATGAGAATTA ACCACA ATATTGC
hag50-R CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG
與本領域已知的方法相比，本發明是利用鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸作為融合標籤提高外源蛋白質在細胞內的表達水平。與對照相比，融合後的GFP表達量提高了 12倍。


圖1融合表達Hag50_GFP重組質粒pMA5-Hag50_GFP構建流程圖。Amp和bla表示氨苄青黴素抗性基因，用於篩選大腸桿菌轉化子，並用來擴增質粒用。Hag50-GFP為鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸編碼片段與綠色螢光蛋白GFP基因的融合片段，Promoter HpaII 是組成型強啟動子HpaII ；ori為大腸桿菌複製子。
圖2對照重組質粒pMA5-GFP構建示意圖。直接把GFP基因連接到載體pMA5上而構成質粒PMA5-GFP。
圖3重組菌株PG800和PHG800中GFP的相對螢光強度。重組菌株PG800表達不含分子標籤Hag50的GFP蛋白質；重組菌株PHG800帶有分子標籤Hag50的Hag50_GFP融合蛋白質。
具體實施方式
1.枯草芽孢桿菌鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸編碼序列的獲得
B. subtilis 168 的 hag 基因(Genbank 序列號M26948)全長為 915bp,是枯草芽孢桿菌中表達量最大的蛋白質之一。將培養好的B. subtilisl68菌液按照細菌基因組快速提取試劑盒說明書提取基因組DNA。根據NCBI發表的B. subtilisl68全基因組中hag基因序 列設計PCR引物hag-F和hag50-R，在上遊和下遊引物中分別引入NdeI和EcoRI酶切位點，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸編碼序列，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小與預期相符。 擴增用的聚合酶是東洋紡(上海)生物科技有限公司的KOD plus。引物序列如下，其中下劃線代表的是酶切位點。
hag-F AGTGCATATGAGAATTAACCACAATATTGC
hag50-R CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG
克隆得到的PCR產物進行產物純化，_20°C保存備用。
2.綠色螢光蛋白質基因gfp的擴增
根據NCBI發表的gfp基因(Genbank序列號U55762)序列設計PCR引物。利用引物GFP-f和GFP-R，以質粒pEGFP為模板，擴增出有EcoRI和BamHI酶切位點的gfp基因。以GFP-F和GFP-R為引物，以質粒pEGFP為模板，擴增出有NdeI和BamHI酶切位點的gfp基因。擴增用的聚合酶是東洋紡(上海)生物科技有限公司的KOD plus。經核酸電泳檢測， 大小與預期相符。進一步產物純化並-20°C保存備用。
GFP-F GGCGCATATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC
GFP-f CCGGAATTCAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC
GFP-R GGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA
3.質粒 pMA5-Hag50_GFP 的構建
構建流程如圖1，首先是把利用KOD plus (平末端)擴增出帶有EcoRI和BamHI酶切位點的gfp基因連接到經過EcoRV酶切的PUCX05，構成質粒pUCX_GFP。通過採用NdeI和 EcoRI雙酶切PCR產物Hag50，經膠回收後克隆於經相同酶切的pUCX_GFP的質粒中，得到質粒 pUCX-Hag50-GFP。用 NdeI 和 BamHI 酶切質粒 pUCX-Hag50_GFP，並膠回收 Hag50_GFP 片段，連接到經相同酶切的PMA5質粒中，得到重組質粒pMA5-Hag50-GFP。
4.重組質粒pMA5-GFP的構建
採用NdeI和BamHI雙酶切以GFP-F和GFP-R為引物擴增出的PCR產物gfp，經膠回收後克隆於PMA5的相應位點，得到整合型重組質粒pMA5-GFP(如圖2)。
5.重組質粒轉化枯草芽孢桿菌與轉化子的篩選鑑定
採用電擊法將重組質粒pMA5-Hag50_GFP和pMA5_GFP分別轉化枯草芽孢桿菌 WB800 菌株中(2. Okv, Imm,電擊 I 次，時間常數=4. 5 5. Oms, Gene Pulser Xcell),塗布含卡那黴素的LB平板。過夜培養後，從平板上挑取單菌落點接種至5mL含終濃度為50 μ g/ mL卡那黴素的LB液體培養基。收集菌體並按照細菌基因組快速提取試劑盒說明書提取基因組DNA，通過PCR驗證重組質粒是否轉化成功。鑑定為含有pMA5-Hag50-GFP菌株命名為 PHG800，含有pMA5-GFP的菌株命名為PG800。
6.枯草芽孢桿菌重組菌株中GFP的檢測
把重組菌株PHG800和PG800分別接種於5ml的LB液體培養基中，37°C培養12h。 IOOOOrpm離心15min收集菌體，然後用PBS洗滌三次，並重懸於等體積的PBS重懸菌體。 然後加入終濃度為5mg/mL的溶菌酶，37°C水浴保溫lh，利用超聲波破碎菌體(2min，300W， Sonic, VCX500)。然後利用日立F-7000型螢光光譜儀檢測破碎液中螢光的強弱，檢測時的激發波長是488nm，發射波長是547nm。
本發明涉及一種在枯草芽孢桿菌中提高外源蛋白質表達量的新方法。以枯草芽孢桿菌鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸(Hag50)作為融合標籤來實現外源蛋白質GFP時,可以提到提高GFP表達量達12倍。它的發現對於實現外源蛋白質在枯草芽孢桿菌中的過量表達提供了可能。
權利要求
1.利用鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸作為融合標籤提高外源蛋白質在枯草芽孢桿菌中的表達量。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，利用枯草芽孢桿菌芽孢鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸作為融合標籤，與外源目的蛋白基因融合，構建融合表達載體，並轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌，重組菌株能有效的提高外源蛋白質的表達水平。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，外源目的蛋白基因為編碼具有生物活性的蛋白或酶。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的重組質粒是將枯草芽孢桿菌鞭毛蛋白編碼序列與外源目的蛋白基因融合得到的質粒，重組質粒中含Hag的前50個胺基酸編碼片段、氨苄青黴素和卡那黴素的抗性選擇標記基因、組成型強啟動子HpaII和外源目的蛋白質的編碼基因，構建的質粒轉化枯草芽抱桿菌。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的重組枯草芽孢桿菌帶有游離型質粒，含有融合標籤的重組菌株的外源蛋白質的表達量明顯提高。
全文摘要
本發明屬於分子生物學領域，涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)鞭毛蛋白Hag的前50個胺基酸的應用，提高外源蛋白質在枯草芽孢桿菌中表達量的新方法，具體是通過融合表達的方式提高外源蛋白質的表達量。融合標籤Hag50編碼序列與外源目的蛋白質的編碼基因進行融合重組，構建融合表達的重組質粒，並轉化枯草芽孢桿菌。得到的重組菌已經能成功提高外源蛋白質的表達量。
文檔編號C12N15/75GK103031328SQ20121047679
公開日2013年4月10日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者陳衛, 王光強, 宋元達, 陳海琴 申請人:江南大學