一種重組產氣腸桿菌及其應用的製作方法

2023-09-20 01:19:40

專利名稱：一種重組產氣腸桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種產氣腸桿菌及其應用，特別是涉及一種重組產氣腸桿菌及其應用。
背景技術：
氫氣作為一種高效且對環境無汙染的清潔能源，將來很有可能成為石化能源的替代品。但是，目前它的主要生產來源是石油和天然氣，而後兩者都是不可再生的稀缺能源。因此，從自然界中大量存在的生物量中獲取氫氣是最具潛力的制氫方法之一(B.Fabiano，P.Perego. Thermodynamic study and optimization of hydrogenproduction by Enterobacter aerogenes，International Journal of HydrogenEnergy，27149-156，2002；Tatsuya Noike，Hiroo Takabatake，Osamu Mizuno，Mika Ohba.Inhibition of hydrogen fermentation of organic wastes by lacticacid bacteria，International Journal of Hydrogen Energy，271367-1371，2002；Helena L.Chum，Ralph P.Overend.Biomass and renewable fuels，FuelProcessing Technology，71187-195，2001)。
常見的三種產氫細菌為發酵細菌、光合細菌和藍細菌。使用發酵細菌較其它兩種細菌有著獨特的優勢第一，產氫速度快(Shigeharu TanishoHydrogen productionby facultative anaerobe Enterobacter aerogenes，biohydrogenProceedings ofan International Conference on Biological Hydrogen Production，Hawaii USA，June 1997)；第二，無需供給光能；第三，可以利用有機化合物為碳源處理有機廢水以及使生物量低分子化(John R.Benemann.The technology of biohydrogen，BiohydrogenProceedings of an International Conference on BiologicalHydrogen Product ion，Hawaii USA，June 1997)。
發酵制氫的瓶頸在於產氫率較低，實際值僅為理論值的8-20％。目前，產氫的發酵細菌主要有三類腸桿菌(Enterobacter)，芽孢桿菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)(F.R.Hawkes，R.Dinsdale，D.L.Hawkes，I.Hussy.Sustainablefermentative hydrogen productionchallenges for process optimization，International Journal of Hydrogen Energy，271339-1347，2002)。Enterobacter是兼性厭氧菌，後兩者是絕對厭氧菌。產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)在好氧和厭氧條件下都能夠生長，培養方法也要比專性厭氧菌簡單，因而生產成本較低廉，是極有潛力的產氫菌種。到目前為止，利用該菌產氫的最高得率為58mol(H2)/mole(葡萄糖)(S.Tanisho and Y.Ishiwata，Continuous hydrogen production frommolasses by the bacterium Enterobacter aerogenes，International Journal ofHydrogen Energy，20541-545，1995)。提高產氫率是目前生物制氫領域研究的核心內容。採用多菌種混合培養，充分利用不同細菌的功能，是提高產氫率的有效方式。但是，目前的研究只限於工藝優化及其代謝途徑研究等內容，幾乎所有的研究人員都只關注該菌的純培養過程，並且還沒有採用過基因工程的方法對此進行研究。從技術可行性角度考慮，工業化的制氫過程也不可能採用純培養方式。因此，建立混合培養體系，充分發揮目標微生物的功能是提高產氫率的一種方向。對產氣腸桿菌混合培養體系的利用，不但可以進行生物制氫，還可以實現對產氣腸桿菌其它功能的利用，如生產2，3-丁二醇等細胞代謝產物。
為了對混合培養體系進行有效的調控，需要對混合培養體系中的目標微生物的數量進行監控。目前，常規的對混合培養體系中的目標細菌的數量進行監控的方法有螢光原位雜交法(FISH)，16s rRNA定量法，醌測量法等，但這些方法存在不能快速定量，只能半定性定量，且具有破壞性等缺點。

發明內容
本發明的目的是提供一種可發螢光的重組產氣腸桿菌。
本發明所提供的重組產氣腸桿菌，是將含有綠色螢光蛋白基因的表達載體導入產氣腸桿菌中得到的。
其中，用於構建所述含有綠色螢光蛋白基因的表達載體的出發載體可為pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。優選為pUC18或pUC19。
為了便於篩選，所述含有綠色螢光蛋白基因的表達載體還含有卡那黴素抗性基因。
以pUC18或pUC19為出發載體，構建得到的含有綠色螢光蛋白基因和卡那黴素抗性基因的表達載體為PUCKG。
上述含有綠色螢光蛋白基因的表達載體中還可插入tac啟動子及其調控序列。
在PUCKG中插入tac啟動子及其調控序列得到的表達載體為PUCKTG。
將PUCKTG導入產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)IAM1183(購自IAMCulture Collection)得到發螢光的產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCCNo.1193。
產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193已於2004年07月21日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1193。其菌落呈淡黃色、圓形、邊緣光滑、表面溼潤，細胞呈短杆狀。
本發明的重組產氣腸桿菌進行產氫的發酵培養基和發酵條件與其相應的出發菌株相同。
實驗證明，將處於厭氧、微好氧狀態的重組產氣腸桿菌暴露於空氣中，其螢光形成速度和螢光形成最大值這兩個數值均與細胞的數量之間呈正相關關係，因而可用這兩個參數表徵細胞量，實現對產氣腸桿菌的定量追蹤。用此方法可快速實現對培養過程中產氣腸桿菌的定量追蹤(一個小時即可測出螢光形成最大值，5分鐘甚至更短時間內可測出螢光形成速度)，並且對菌體細胞無破壞性，相對於其它半定性方法更能夠準確定量培養體系內帶螢光細胞的實際濃度。
本發明的重組產氣腸桿菌可用於大規模發酵製備氫氣，技術可行性強，此外還可對該菌進行螢光定量追蹤，便於進行生產的工業化控制，因而本發明具有較高的實際應用價值和廣闊的工業應用前景。


圖1為gfp基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2為卡那黴素抗性基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖3a為載體PUCK的物理圖譜圖3b為載體PUCKG的物理圖譜圖4為載體PUCKT的物理圖譜圖5為載體PUCKTG的物理圖譜圖6為重組產氣腸桿菌的螢光顯微鏡照片圖7為產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193暴露於空氣中產生的螢光隨時間變化曲線圖8為螢光形成速度、螢光最大值和產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PUCKG CGMCC No.1193細胞量相關關係曲線圖9為螢光定量追蹤產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PUCKG CGMCCNo.1193細胞生長過程曲線圖10為螢光形成速度、螢光恢復最大值與細胞光密度的擬合曲線具體實施方式
實施例1、表達載體PUCKG的構建1、gfp基因的獲得以載體pQB-2(Metabolic Engineering of Escherichia coliIncrease of NADHAvailability by Overexpressing an NAD+-Dependent Formate DehydrogenaseMetabolic Engineering 4，217-229，2002)為模板，以引物2Pup5』AGAGAATTCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC3』(劃線部分鹼基為EcoRI的酶切位點)和Pdo5』GGAGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCA3』(劃線部分鹼基為KpnI的酶切位點)為引物進行PCR擴增。其中，反應體系採用北京賽百盛公司提供的50微升傻瓜PCR反應體系；反應條件為94℃ 5min；94℃ 45s，54℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；72℃ 5min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示(泳道1-3、5-7為gfp基因，泳道4為Marker)，表明得到大小約為700bp的條帶，與gfp基因大小一致。
2、卡那黴素抗性基因的獲得以載體pET28a(Novagene 69864-3)為模板，以引物1Pup5』CGTTGCTGGGACCTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGA3』(劃線部分鹼基為AvaII的酶切位點)和Pdo5』GCGGGTACGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG3』(劃線部分鹼基為AvaII的酶切位點)為引物進行PCR擴增。其中，反應體系採用北京賽百盛公司提供的50微升傻瓜PCR反應體系；反應條件為94℃ 5min；94℃ 45s，63.5℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；72℃ 5min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示(泳道1、3為Marker，泳道2為卡那黴素抗性基因)，表明得到大小約為1.7kbp的條帶，與卡那黴素抗性基因大小一致。
3、tac啟動子及其調控序列的獲得以載體pMAL-p2X(NEB)為模板，以引物4Pup5』CGCCCCTCGAGTGGTGCAAAACCTTTC3』(劃線部分鹼基為XhoI的酶切位點)和Pdo5』CGGGGGAATTCATTATACGAGCCGATG 3』(劃線部分鹼基為EcoRI的酶切位點)為引物進行PCR擴增。其中，反應體系採用北京賽百盛公司提供的50微升傻瓜PCR反應體系；反應條件為94℃ 5min；94℃ 45s，60℃1min，72℃ 1min，30個循環；72℃5min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明得到大小為1.4kbp的條帶，與tac啟動子大小一致。
4、重組質粒載體PUCK及PUCKG的構建(1)重組質粒載體PUCK的構建將卡那黴素抗性基因和載體pUC18(GenBank，L09136)用AvaII限制性內切酶消化後再用T4DNA連接酶將兩者連接起來，通過CaCl2法轉化大腸桿菌JM109，以引物1為引物通過菌落PCR篩選轉化子，並通過AvaII酶切進行結構驗證，結果得到結構正確的重組質粒載體，命名為PUCK(其物理圖譜如圖3a所示)。
(2)重組質粒載體PUCKG的構建將利用引物2得到的克隆產物gfp基因片段用限制性內切酶EcoRI和KpnI消化，與載體PUCK通過相同的內切酶消化後得到片斷連接，轉化大腸桿菌JM109，利用引物2通過菌落PCR篩選轉化子，並通過EcoRI和KpnI酶切進行結構驗證。結果得到結構正確的重組質粒載體，命名為PUCKG(其物理圖譜如圖3b所示)。
5、重組質粒載體PUCKT及PUCKTG的構建(1)重組質粒載體PUCKT的構建以載體PUCK為模板，以引物3Pup5』GGGGGCGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAA 3』(劃線部分鹼基為EcoRI的酶切位點)和Pdo5』ATCACTCGAGAACGCAGGAAAGAACATGTGA 3』(劃線部分鹼基為XhoI的酶切位點)為引物擴增得到載體PUCK 1-229以外區域的片段，同時引入EcoRI和XhoI酶切位點。其中，PCR的反應條件和反應體系(除引物和模板外)與步驟2同。
將擴增得到的載體PUCK 1-229以外區域的片段和步驟3中得到的tac啟動子及調控序列用EcoRI和XhoI用限制性內切酶消化後再用T4DNA連接酶將兩者連接起來，轉化大腸桿菌JM109，以引物4為引物通過菌落PCR篩選轉化子，並通過EcoRI和XhoI酶切進行結構驗證，結果得到結構正確的重組質粒載體，命名為PUCKT(其物理圖譜如圖4所示)。
(2)重組質粒載體PUCKTG的構建將質粒載體PUCKT和gfp基因用EcoRI和KpnI限制性內切酶消化後再用T4DNA連接酶將兩者連接起來，轉化大腸桿菌JM109，利用引物2通過菌落PCR篩選轉化子，並通過EcoRI和KpnI酶切進行結構驗證，結果得到結構正確的重組質粒載體，命名為PUCKTG(其物理圖譜如圖5所示)。
實施例2、重組產氣腸桿菌的構建及其特性將載體PUCKG或PUCKTG採用CaCl2轉化法分別導入產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)IAM1183(購自IAM Culture Collection)中，經篩選得到含有PUCKG或PUCKTG的重組產氣腸桿菌，其中含有PUCKTG的重組產氣腸桿菌為產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193。
將上述兩株菌於LB(含10μg/ml卡那黴素，1mM IPTG)液體培養基中，在37℃，150rpm條件下培養12h，用螢光顯微鏡觀察，結果表明上述兩株菌帶螢光(圖6)。
實施例3、重組產氣腸桿菌的螢光定量追蹤用乳糖培養基(每升含有15g乳糖，5g蛋白腖，14g K2HPO4，6g KH2PO4，2g(NH4)2SO4，1g檸檬酸三鈉，0.2g MgSO4·7H2O，pH7.0)對產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)PKG CGMCC No.1193進行厭氧培養0h-22h，將處於厭氧狀態的細胞用PBS緩衝液清洗、重懸後暴露於空氣中(敞口搖瓶置於37攝氏度、170rpm搖床)，使分子氧與細胞內的原始綠色螢光蛋白結合形成成色基團，產生螢光，從而得到厭氧培養6h細胞暴露於空氣中產生的螢光隨時間變化的曲線(圖7)，圖7中帶矩形的曲線，帶圓點的曲線，帶正三角形的曲線和帶倒三角型曲線分別表示細胞光密度分別為0.31，0.155，0.0775，0.03875的螢光形成曲線，表明細胞濃度越大，螢光形成速度和螢光形成最大值也越大。對圖7數據進行擬和，得到如圖8所示的厭氧培養6h細胞的細胞量和螢光形成速度、螢光最大值相關關係曲線，圖8表明螢光形成速度(帶矩形的曲線)、螢光形成最大值(帶圓點的曲線)這兩個數值均與細胞的數量呈正相關關係([ΔF』]/Δt＝93.7×OD600；[F』]max＝162.9×OD，其中，[ΔF』]/Δt表示螢光形成速度，，[F』]max表示螢光形成最大值，F』表示任意時刻螢光恢復形成的螢光量)，從而可以用螢光形成速度和螢光最大值這兩個參數表徵細胞的數量，實現對細菌的定量追蹤。用以上確立的螢光形成方法對在乳糖培養基中厭氧生長的產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PK6 CGMCC No.1193的生長及產氣過程進行追蹤，分別在2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22小時取樣進行分析，監測該時刻螢光形成最大值，螢光形成速度，細胞光密度和總產氣量。結果如圖9所示(帶實心圓點的曲線代表螢光形成最大值、帶空心圓點的曲線代表螢光形成速度、帶矩形的曲線代表細胞光密度OD600、帶三角形的曲線代表培養過程的總產氣量)，表明在細胞培養過程的前10小時，無論是螢光形成速度還是螢光形成最大值都與細胞光密度變化趨勢相同，且成正相關關係。它們的擬合結果如圖10所示，虛線和實線分別是螢光形成速度、螢光形成最大值與細胞光密度的擬合曲線，可以得到[ΔF』]/Δt＝360×OD600-50；[F』]max＝401×OD-44，也就是說在此期間可以對細胞濃度進行定量追蹤。
權利要求
1.一種重組產氣腸桿菌，是將含有綠色螢光蛋白基因的表達載體導入產氣腸桿菌中得到的。
2.根據權利要求1所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於用於構建所述含有綠色螢光蛋白基因的表達載體的出發載體為pUC18、pUC19、pUC118、pUC119。
3.根據權利要求2所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於所述出發載體為pUC18或pUC19。
4.根據權利要求1、2或3所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於所述表達載體還含有卡那黴素抗性基因。
5.根據權利要求4所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於所述表達載體為PUCKG。
6.根據權利要求4所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於所述表達載體還含有tac啟動子及其調控序列。
7.根據權利要求6所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於所述表達載體為PUCKTG。
8.根據權利要求7所述的重組產氣腸桿菌，其特徵在於所述重組產氣腸桿菌為產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)PKG CGMCC No.1193。
全文摘要
本發明公開了一種重組產氣腸桿菌及其應用，其目的是提供一種可發螢光的重組產氣腸桿菌及其應用。本發明所提供的重組產氣腸桿菌，是將含有綠色螢光蛋白基因的表達載體導入產氣腸桿菌中得到的。本發明的重組產氣腸桿菌可用於大規模發酵製備氫氣，技術可行性強，此外還可對該菌進行螢光定量追蹤，便於進行生產的工業化控制，因而本發明具有較高的實際應用價值和廣闊的工業應用前景。
文檔編號C12N1/21GK1587388SQ20041007443
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月15日 優先權日2004年9月15日
發明者張翀, 邢新會 申請人:清華大學