生物傳感器的製作方法
2023-09-19 19:34:35 1
專利名稱：生物傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物傳感器，特別涉及分析血液成分的生物傳感器。
圖16是顯示現有的生物傳感器試件構成的立體圖。
在圖16中，1是支撐色譜分析法材料由塑料等構成的反應層擔體支撐體。2是由吸收性大的無紡布或玻璃纖維濾紙等構成的用於添加或塗附被檢查溶液的試樣添加領域。3是以可以溶解的狀態保持標記試劑的標記物保持部位。4是硝化纖維素等組成的展開試樣，進行反應的反應層。5是在反應層4的區域上固定化特異性的蛋白質的特異性蛋白質固定化部。6是最終吸收被檢查溶液的吸水區域。以上所述的試樣添加領域2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白質固定化部5、吸水區域6的各部位形成在反應層擔體支撐體1的上部形成著。
使用圖16對這樣構成的傳感器的操作進行說明。
首先將被檢查溶液液體試樣添加到試樣添加領域2，到達標記物保持部位3的區域。然後保持在標記物保持部位3的區域的標記試劑通過液體試樣的浸透而被溶解，浸透到反應層4的區域。反應層4的區域上有固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5，從標記物保持部位3的區域溶出的標記試劑和液體試樣中的分析對象物與特異性蛋白質之間發生反應。這時只要在液體試樣中存在分析對象物，就在特異性蛋白質固定化部5的區域出現某種顯色反應。最後液體試樣被吸水區域6所吸收，結束反應。
這樣只要添加被檢查溶液，生物傳感器就可以容易地對測定對象物的測定成分進行定性或定量。另外作為這樣的生物傳感器有免疫色譜傳感器。
一般的免疫色譜傳感器設有添加被檢查溶液的添加層和至少一個或多個展開層和終端上的吸收層。另外在展開層的一部分上設有固定化了對被檢查溶液的測定對象物的抗體的抗體固定化部分。而且在抗體固定化部分的上遊，標記了與該抗體固定化部位抗體不同表位的抗體，此抗體以可以由被檢查溶液溶出的乾燥狀態保持著。這裡所述的是不同的表位，但是在同一分子內具有相同的結構的情況、例如使用例如2聚體以上的抗原的情況等並不受此限。
這樣的免疫色譜傳感器是稱作夾層反應的反應形態，在抗體固定化部分固定化的抗體和被檢查溶液中的測定對象物和與抗體固定化部分的抗體不同的表位的抗體之間形成複合物。
對這樣構成的免疫色譜傳感器說明其操作。
首先將必要量的被檢查溶液添加到添加層，被檢查溶液在展開層中浸透，開始測定。因此只要在被檢查溶液中存在測定對象物，就可以利用抗體固定化部分結合的標記抗體得到測定對象物。作為該標記抗體的一般例有金膠體粒子，只要在抗體固定化部分存在測定對象物，就可以通過金膠體粒子利用目測進行確認，由此可以得到測定結果。
這裡為了檢測被檢查溶液中的抗原在試件上使用有抗體，將抗原抗體反應的夾層反應作為測定原理，對此情形進行了說明。但是測定原理不僅限於此，為了檢測被檢查溶液中的抗體，也可以使用在固定化試劑以及標記試劑中含有抗原的反應體系，除此而外，在以競爭反應作為測定原理的情況也同樣可以通過確認抗體固定化部分的標記試劑的結合狀態得到測定結果。
因而作為診斷人的健康狀態的方法廣泛地進行血液生化檢查。例如測定血液中的構成成分的代謝產物、蛋白質、脂肪、電解質、酶、抗原、抗體等的類型或濃度。使用所述的免疫色譜傳感器進行測定時，難於原樣測定全血。通常在使用色譜傳感器測定全血時，必須先將原血置於離心分離機中，將得到的血漿或血清作為檢體進行測定。但是由於離心分離費時費力，特別是欲將少量的檢體快速地處理時，或者想在沒有設備的室外、床側、急救現場進行檢查時等場合不適合。
近幾年在醫療診斷現場上依據POC(治療地點，point of care)的觀點、希望得到迅速、簡便、正確、而且價格低、容易操作的測定裝置。通過添加被檢查溶液可以進行測定的免疫色譜傳感器由於其測定操作簡便，被廣泛地應用在不只是醫療現場限定的測定項目診斷等方面。
但是利用現有的免疫色譜傳感器所代表的生物傳感器進行一般的血液成分分析是困難的。也就是血液成分分析需要將預先採好的血液放至離心分離機上，使用由此得到的血漿或血清，必須在大型的分析儀器進行分析，這樣不僅需要特殊的機器進行測定，而且由於需要預處理，在檢查時需要大量的時間。對血細胞等細胞成分有影響，存在問題。
因此作為不影響血細胞成分的分析血液成分的方法，在特開昭57-53661號公報、特開平8-54387號公報、或者特開平9-196908號公報中公開有過濾全血，從全血中分離血漿的血細胞過濾方法。
例如在特開昭57-53661號公報、特開平8-54387號公報中為了更完全地分離血細胞成分，使用平均直徑0.2～5μm、密度0.1～0.5g/cm3的玻璃纖維濾紙、使血液滲出，由此分離得到血漿或者血清。該方法儘管確實可以提高血細胞的分離效率，但是為了完全地分離血細胞不僅需要相當長的時間，而且為了得到檢查所必須的試樣量，需要大量的血液。也就是相對添加的血液量得到的血清量或者血漿量少，存在問題。
特開平9-196908號公報迴避血細胞引起的過濾材料的堵塞，為了從更少量的血液中得到大量的血漿、或者血清成分，將胺基酸或者無機鹽水溶液混合入全血之後過濾血細胞成分。但是該方法需要在預先得到的血液中添加增量用的水溶液，然後過濾血細胞成分，操作繁瑣，測定需要時間，不能適應緊急時的檢查，存在問題。
為了解決這些問題，特願2000-164990公開的方法使用細胞收縮劑，收縮血液中的細胞成分，在色譜試件上展開。其特徵在於為了在色譜試件上不預處理血液檢體而點狀滴加，在試件上擔持細胞收縮劑。但是該方法儘管對血液檢體不進行某種預先處理，短時間內在色譜試件上進行展開，但是由於展開的血液中的血色素的影響本底值上升，S/N比小，不僅在利用儀器測定時帶來靈敏度降低，而且妨礙血色素顯色度的讀取，在進行定量測定時，精度非常差，存在問題。
本發明是為了解決上述的問題而進行的，不使用特別的儀器可以簡便而且迅速地分析具有有色成分的液體試樣中的測定對象物，而且可以更加正確地定性或定量分析測定成分，提供具有所述性能的生物傳感器。
這樣結構的生物傳感器可以利用漂白試劑使液體試樣中的有色成分褪色，利用目測容易地判斷測定結果。另外在反應層上不附著血色素，可以儘可能地抑制測定儀器帶來的分析對象物讀取誤差，得到更加準確的測定結果。
本發明(權利要求2)是在權利要求1所述的生物傳感器中，所述展開層由硝化纖維素構成。
這樣構成的生物傳感器通過使用具有微細空間的多孔質性的擔體硝化纖維素，可以將被檢查溶液的添加量抑制到更少量。
本發明(權利要求3)是在權利要求1所述的生物傳感器中，將具有漂白作用的試劑以可以溶解的狀態直接擔持在所述展開層上。
這樣構成的生物傳感器由於不需要準備將具有漂白作用的試劑預先擔持在特定的部件上的部件，所以可以減少構成生物傳感器的部件數。另外，通過將被檢查溶液添加在直接擔持漂白試劑的部件上，不限制被檢查溶液的浸透性進行展開，利用更加均一的漂白作用和反應性，可以得到高靈敏度而且高性能的測定結果。
本發明(權利要求4)是在權利要求1所述的生物傳感器中，在所述展開層上配設利用毛細管現象流入被檢查溶液的試樣的流入區域，在所述試樣流入區域中保持所述漂白試劑區域。
這樣構成的生物傳感器由於在被檢查溶液吸引的同時立刻溶解漂白試劑，和漂白試劑進行反應，所以利用更加均一的漂白作用和反應性，可以得到高靈敏度而且高性能的測定結果。
本發明(權利要求5)是在權利要求1所述的生物傳感器中，添加的被檢查溶液為全血。
這樣構成的生物傳感器由於不需要預先預處理血液檢體，可以直接作為檢體進行滴下，測定，所以在測定血液中的分析對象物的情況，不需要使用現有的大型儀器，可以進行更加簡便快速的測定，可以得到高靈敏度而且高性能的測定結果。
本發明(權利要求6)是在權利要求1所述的生物傳感器中，具有所述漂白作用的試劑為過碳酸鈉。
這樣構成的生物傳感器由於可以儘可能地抑制對反應重要的蛋白質等帶來的不好影響，可以得到高靈敏度而且高性能的測定結果。
本發明(權利要求7)是在權利要求1所述的生物傳感器中，具有所述漂白作用的試劑為過氧化氫。
這樣構成的生物傳感器由於可以在更短的時間進行有效的漂白，所以部件可以簡便而且快速地進行測定，而且可以得到高靈敏度而且高性能的測定結果。
本發明(權利要求8)是在權利要求1所述的生物傳感器中，具有所述漂白作用的試劑為次氯酸鈉。
利用這樣構成的生物傳感器由於可以無限抑制對反應重要的蛋白質帶來的壞的影響，所以可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
本發明(權利要求9)是在權利要求1所述的生物傳感器中，所述生物傳感器是一步免疫色譜法試件。
利用這樣構成的生物傳感器不需要預先處理含有全血等細胞成分的被檢查溶液。另外由於利用免疫反應，得到測定對象物對應的抗體或抗原，可以測定類型廣泛的測定對象，在使用含有全血類細胞成分的被檢查溶液的場合，可以簡易快速地進行測定。
本發明(權利要求10)是在權利要求1所述的生物傳感器中，所述生物傳感器是乾式分析部件。
利用這樣構成的生物傳感器生物傳感器整體是乾燥擔體，所以不僅搬運容易，而且不需要嚴密地管理保存環境或保存狀態，可以提供操作容易不選擇保存條件可以長期保存的生物傳感器。
本發明涉及的生物傳感器(權利要求11)設有展開被檢查溶液的展開層，還至少設有在所述展開層的局部可以利用被檢查溶液的展開而溶解的保持標記試劑的標記試劑部分，和在所述展開層的局部上固定化了與被檢查溶液中的分析對象物進行特異性反應的試劑的試劑固定化部分；在該生物傳感器中，所述展開層上相對被檢查溶液的浸透方向，比添加被檢查溶液的試樣添加區域為被檢查溶液的浸透方向下遊側的至少局部上設有分別可以溶解地擔持有細胞成分收縮劑和具有漂白作用的試劑的區域。
利用這樣構成的生物傳感器在添加含有細胞成分的被檢查溶液的場合，通過細胞成分和細胞收縮劑接觸將其收縮，細胞成分可以效率高而且不添加展開劑在試件上充分地浸透。也就是不需要預先除去被檢查溶液中的細胞成分的預處理。或者通過漂白試劑的作用，可以利用漂白試劑使液體試樣中的有色成分褪色。可以利用目測容易地判斷測定結果。另外，由於血色素不附著在反應層上，所以可以無限地抑制測定儀器帶來的分析對象物的讀取誤差，可以得到正確的測定結果。
本發明(權利要求12)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述展開層由硝化纖維素組成。
這樣構成的生物傳感器，通過使用具有細微空間的多孔質性擔體硝化纖維素，可以將被檢查溶液的添加量抑制到更少量。
本發明(權利要求13)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述展開層上具有漂白作用的試劑可以溶解地進行直接擔持。
這樣構成的生物傳感器不需要準備將具有漂白作用的試劑預先擔持在特定的部件上的部件，構成生物傳感器的部件的數量可以減少。另外通過在直接擔持漂白試劑的部件上添加被檢查溶液，不改變被檢查溶液的浸透性地展開，所以利用更加均一的漂白作用和反應性，可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
本發明(權利要求14)是在權利要求11所述的生物傳感器中，在所述展開層上設有利用毛細現象流入被檢查溶液的試樣流入區域，在所述試樣流入區域中保持所述漂白試劑領域。
這樣構成的生物傳感器被檢查溶液添加後可以快速溶解漂白試劑，和漂白試劑反應，所以利用更加均一的漂白作用和反應性可以得到高靈敏度和高性能的測定結果。
本發明(權利要求15)是在權利要求11所述的生物傳感器中，在所述展開層上擔持有細胞收縮劑和具有漂白作用的試劑混合的試劑。
這樣構成的生物傳感器在添加含有細胞成分的被檢查溶液的場合，通過細胞成分和細胞收縮劑接觸將其收縮，細胞成分可以效率高而且不添加展開劑在試件上充分地浸透。也就是不需要預先除去被檢查溶液中的細胞成分的預處理。另外由於漂白試劑的作用，可以利用漂白試劑使液體試樣中的有色成分褪色。可以利用目測容易地判斷測定結果。另外，由於血色素不附著在反應層上，所以可以無限地抑制測定儀器帶來的分析對象物的讀取誤差，可以得到正確的測定結果。另外由於將細胞收縮劑和漂白試劑混合擔持，所以可以減少構成生物傳感器的部件數。
本發明(權利要求16)是在權利要求11所述的生物傳感器中，在所述展開層上設有利用毛細現象流入被檢查溶液的試樣流入區域，細胞收縮劑和漂白作用混合的試劑保持在所述試樣流入區域中。
這樣構成的生物傳感器配設有利用毛細管現象的被檢查溶液的流入被檢查溶液的空間，在所述空間中擔持細胞收縮劑和混合漂白作用的試劑，所以可以在吸引被檢查溶液的同時，快速地溶解試劑。
本發明(權利要求17)是在權利要求11所述的生物傳感器中，添加的被檢查溶液為全血。
這樣構成的生物傳感器不預先進行預處理血液樣品，直接作為檢體滴下進行測定，所以在測定血液中的分析對象物的場合，不需要使用現有使用的大型儀器，可以進行更加簡便而且快速的測定，可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
本發明(權利要求18)是在權利要求11所述的生物傳感器中，具有所述漂白作用的試劑為過碳酸鈉。
這樣構成的生物傳感器由於可以無限抑制對反應重要的蛋白質帶來的壞的影響，所以可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
本發明(權利要求19)是在權利要求11所述的生物傳感器中，具有所述漂白作用的試劑為過氧化氫。
這樣構成的生物傳感器可以在更加短的時間內更加有效地漂白，所以不僅可以簡便快速地測定，而可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
本發明(權利要求20)是在權利要求11所述的生物傳感器中，具有所述漂白作用的試劑為次氯酸鈉。
這樣構成的生物傳感器由於可以無限抑制對反應重要的蛋白質帶來的壞的影響，所以可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
本發明(權利要求21)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述細胞收縮劑為無機鹽。
這樣構成的生物傳感器可以在不妨礙血液成分的分析反應的短時間內進行正確地測定。
本發明(權利要求22)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述細胞收縮劑為胺基酸。
這樣構成的生物傳感器可以在不妨礙血液成分的分析反應的短時間內進行正確地測定。
本發明(權利要求23)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述細胞收縮劑為糖類。
這樣構成的生物傳感器可以在不妨礙血液成分的分析反應的短時間內進行正確地測定。
本發明(權利要求24)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述生物傳感器為一步免疫色譜法試件。
利用這樣構成的生物傳感器不需要預先處理含有全血等細胞成分的被檢查溶液。另外由於利用免疫反應，得到測定對象物對應的抗體或抗原，可以測定類型廣泛的測定對象，在使用含有全血類細胞成分的被檢查溶液的場合，可以簡易快速地進行測定。
本發明(權利要求25)是在權利要求11所述的生物傳感器中，所述生物傳感器是乾式分析部件。
這樣構成的生物傳感器生物傳感器整體是乾燥擔體，所以不僅搬運容易，而且不需要嚴密地管理保存環境或保存狀態，可以提供操作容易不選擇保存條件可以長期保存的生物傳感器。
圖2是顯示本發明實施方案2的生物傳感器的立體圖。
圖3是顯示本發明實施方案2的另一種生物傳感器的構成的立體圖。
圖4是顯示具有本發明實施方案3的生物傳感器的構成的立體圖。
圖5是顯示本發明實施方案3的另一種生物傳感器的構成的立體圖。
圖6是顯示本發明實施方案4的生物傳感器的構成的立體圖。
圖7是從漂白試劑保持部位看圖6的立體圖。
圖8是從吸水區域看圖6的立體圖。
圖9是圖7的漂白試劑保持部位的上部具有試樣添加區域的構造的立體圖。
圖10是圖8的漂白試劑保持部位的下部具有試樣添加區域的構造的立體圖。
圖11是圖7的漂白試劑保持部位的上部具有收縮劑保持部位的構造的立體圖。
圖12是圖8的漂白試劑保持部位的下部具有收縮劑保持部位的構造的立體圖。
圖13是將圖7的漂白試劑保持部位變更為混合試劑保持部位的構造的立體圖。
圖14是將圖8的漂白試劑保持部位變更為混合試劑保持部位的構造的立體圖。
圖15是顯示在將具有漂白作用的試劑在試件上存在的情況和沒有情況下，測定顯色程度的場合下的性能差的圖。
圖16是表示以往的生物傳感器構成的立體圖。
實施方案1本發明的實施方案1參照圖1進行說明。
圖1是顯示本發明實施方案1的生物傳感器的立體圖。
在圖1上，1是支撐色譜法材料的塑料等液體不透過性材料構成的反應層擔體支撐體。2是吸收性大的無紡布或玻璃纖維濾紙等構成的用於添加或塗附被檢查溶液的試樣添加區域、8是可以溶解地保持具有漂白血色素功能的漂白試劑的漂白物質保持部位、3是可以溶解地保持標記試劑的標記物保持部位、4是硝化纖維素構成的展開試樣進行反應的反應層、5是在反應層4的區域上固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部、6是最終吸收被檢查溶液的吸水區域。以上試樣添加區域2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白質固定化部5、吸水區域6、漂白試劑保持部位8的各部位在反應層擔體支撐體1的上部層合或連接而形成著。
這樣構成的生物傳感器使用圖1說明該動作。
首先將全血檢體作為被檢查溶液添加到試樣添加區域，全血檢體到達漂白試劑保持部位8的區域。隨後保持在漂白試劑保持部位8的區域的漂白試劑利用全血檢體的浸透溶解，全血檢體使血液成分褪色，同時達到標記物保持部位3的區域。然後保持在標記物保持部位3的區域的標記試劑利用全血檢體的浸透溶解，浸透到反應層4的區域。在反應層4的區域上有固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5，從標記物保持部位3的區域溶出的標記試劑和全血檢體中的分析對象物、以及特異性蛋白質之間進行反應。這時，只要在全血檢體中存在分析對象物，就在特異性蛋白質固定化部位5的區域可見某種的顯色反應。最終全血檢體被吸水區域6所吸收，反應結束。
這樣本實施方案1的生物傳感器由於在反應層擔體支撐體上設有具有漂白作用的漂白試劑，所以漂白試劑溶出的同時，被檢查溶液中的成分色素褪色，可以抑制判定區域以外的反應層上的色度，所以可以利用目測容易地判斷測定結果。另外即使在使用測定儀器的測量儀器上，也可以無限低地抑制血色素產生的本底的影響。而且不需要預先分離血細胞等細胞成分，不受血色素的影響，所以可以更加簡便迅速地進行高性能的定性或定量分析。
另外在本實施方案1中，顯示試樣添加區域2和漂白試劑保持部位8分別構成的例子，但也可以是具有除去試樣添加區域2，漂白試劑保持部位8兼為試樣添加區域2的結構。通過這樣的構成，可以減少構成生物傳感器的部件數。另外，由於直接在擔持漂白試劑的部件上添加被檢查溶液，所以不受被檢查溶液的浸透性限制可以進行展開，利用更加均一的漂白作用和反應性，可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
另外作為由多個部件構成圖1的構成進行說明，但也可以是在同一擔體上，形成結構為硝化纖維素等多孔質性擔體構成的反應層4上可以溶解地保持漂白試劑或標記試劑的漂白試劑保持區域8和標記試劑保持區域3，和固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5。
實施方案2
下面對本發明的實施方案2參照圖2以及圖3進行說明。
圖2是顯示本發明實施方案2的生物傳感器的立體圖。圖3是顯示本發明實施方案2的另一種的生物傳感器的構成的立體圖。
在圖2、以及圖3上，7是可以溶解地保持細胞收縮劑的收縮劑保持部位。另外對應其他的構成和圖1具有相同部位者，使用相同的符號，省略說明。以上試樣添加區域2、標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白質固定化部5、吸水區域6、收縮劑保持部位7、漂白試劑保持部位8的各部位在反應層擔體支撐體1的上部層合或連接而形成著。
這裡細胞收縮劑使用無機鹽、或胺基酸或者糖類。另外無機鹽表示包括氯化鈉和氯化鉀、磷酸鈉等鹽的無機化合物，所謂胺基酸是甘氨酸、穀氨酸等在同一分子內具有羧基和氨基的化合物，也包括脯氨酸和羥脯氨酸等亞胺基酸的物質，糖類為葡萄糖和蔗糖、海藻糖等糖、甘露醇等糖醇。
這樣構成的生物傳感器使用圖2說明該動作。
首先將被檢查溶液全血檢體添加到試樣添加部2，全血檢體到達收縮劑保持部位7的區域。隨後全血檢體在細胞收縮劑溶出的同時收縮細胞成分，達到標記物保持部位3的區域。然後保持在標記物保持部位3的區域的標記試劑利用全血檢體的浸透溶解，浸透到反應層4的區域。在反應層4的區域上有固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5，從標記物保持部位3的區域溶出的標記試劑和全血檢體中的分析對象物、以及特異性蛋白質之間進行反應。這時，只要在全血檢體中存在分析對象物，就在特異性蛋白質固定化部位5的區域可見某種的顯色反應。最終全血檢體被吸水區域6所吸收，反應結束。
下面對所述的生物傳感器的另一種的構成使用圖3說明該動作。
首先將被檢查溶液全血檢體添加到試樣添加部2，全血檢體到達收縮劑保持部位7的區域。隨後全血檢體在細胞收縮劑溶出的同時收縮細胞成分，並達到漂白試劑保持部位8的區域。漂白試劑保持部位8的區域保持的漂白試劑利用全血檢體的浸透溶解，全血檢體使血液成分的色素褪色，達到標記物保持部位3的區域。然後標記物保持部位3的區域保持的標記試劑利用全血檢體的浸透溶解，浸透到反應層4的區域。在反應層4的區域上有固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5，從標記物保持部位3的區域溶出的標記試劑和全血檢體中的分析對象物、以及特異性蛋白質之間進行反應。這時，只要在全血檢體中存在分析對象物，就在特異性蛋白質固定化部位5的區域可見某種的顯色反應。最終全血檢體被吸水區域6所吸收，反應結束。
另外這裡顯示的細胞收縮劑是顯示利用細胞的膜平衡的性質，在可以通過細胞的物質的高濃度狀態下，利用浸透壓的作用使細胞收縮的狀態。另外對於細胞收縮劑優選具有通過浸透壓的作用使細胞收縮的效果的物質。
這樣本實施方案2的生物傳感器由於具有在反應層擔體支撐體上保持細胞成分收縮劑的收縮劑保持部位，所以收縮的細胞成分可以在硝化纖維素類的孔徑小的多孔質擔體上也不堵塞，進行浸透，可以不預先處理全血檢體，進行使用。
另外在較收縮劑保持部位液體試樣浸透的下遊側，再設有具有漂白作用的漂白試劑保持的漂白試劑保持部位，所以液體試樣中的血液成分色素在漂白試劑溶出的同時褪色，由此可以更低地抑制浸透反應層擔體上的血色素的色度，利用目測容易地確認液體試樣展開後的顯色反應，而且在使用測定儀器進行測定時，可以無限地更低地抑制血色素帶來的本底值的影響。
在本實施方案2中，顯示試樣添加區域2和漂白試劑保持部位8分別構成的例子，但也可以是具有除去試樣添加區域2，漂白試劑保持部位8兼為試樣添加區域2的結構。通過這樣的構成，可以減少構成生物傳感器的部件數。另外由於直接擔持漂白試劑的部件上，添加被檢查溶液，所以可以不受被檢查溶液的浸透性限制進行展開，利用更加均一的漂白作用和反應性，可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
另外圖2以及圖3的構成以由多個部件構成進行說明，但也可以是在同一擔體上形成的結構為硝化纖維素等多孔質性擔體構成的反應層4上可以溶解地保持細胞成分收縮劑或漂白試劑、標記試劑的、收縮保持區域7和漂白試劑保持區域8和標記試劑保持區域3，和固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5。
實施方案3下面對本發明的實施方案3參照圖4以及圖5進行說明。
圖4是顯示本發明實施方案3的生物傳感器的構成的立體圖。圖5是顯示本發明實施方案3的另一種生物傳感器的構成的立體圖。
在圖4上，9是可以溶解地保持細胞收縮劑和漂白試劑的混合試劑的混合試劑保持部位。另外其他的構成和圖1具有相同部位，使用相同的符號，省略說明。以上標記物保持部位3、反應層4、特異性蛋白質固定化部5、吸水區域6、混合試劑保持部位9的各部位在反應層擔體支撐體1的上部形成著。
在圖5中，11是設在試樣添加區域2上，形成利用毛細管現象可以流入被檢查溶液的空間區域的試樣流入區域。另外在其他的構成中，和圖1具有相同部位，使用相同的符號省略說明。以上試樣添加區域2、標記物保持部位3、特異性蛋白質固定化部3、吸水區域6的各部位在反應層擔體支撐體1的上部形成著。另外混合試劑保持部位9在試樣添加區域2的上部形成著。
這樣構成的生物傳感器使用圖4以及圖5說明其動作。
首先將被檢查溶液添加或吸引，在混合試劑保持部位9上，混合試劑溶出的同時收縮細胞成分，使有色成分褪色，液體試樣到達標記物保持部位3的區域。然後保持在標記物保持部位3的區域的標記試劑利用液體試樣的浸透溶解，浸透到反應層4的區域。在反應層4的區域上有固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5，從標記物保持部位3的區域溶出的標記試劑和被檢查溶液中的分析對象物、以及特異性蛋白質之間進行反應。這時，只要在全血檢體中存在分析對象物，就在特異性蛋白質固定化部位5的區域可見某種的顯色反應。最終全血檢體被吸水區域6所吸收，反應結束。
這樣本實施方案3的生物傳感器由於在反應層擔體支撐體上細胞成分收縮劑和漂白試劑的混合試劑的混合試劑保持部位保持在反應層4上，所以被檢查溶液中的細胞成分和細胞收縮劑溶出的同時，進行收縮，收縮的細胞成分即使在硝化纖維素類的孔徑小的多孔質擔體上也不堵塞，可以進行浸透，而且，含有全血檢體類的細胞成分的被檢查溶液可以不預先處理而使用。另外在混合試劑中還混合有具有漂白作用的漂白試劑，所以被檢查溶液中的血液成分色素類的色素成分在和漂白試劑溶出的同時褪色。由此可以更低地抑制浸透反應層擔體上的血色素的色度，利用目測容易地確認液體試樣展開後的顯色反應，而且在使用測定儀器進行測定時，可以無限地更低地抑制血色素帶來的本底值的影響。
另外由於設有利用毛細管現象形成有被檢查溶液可以流入的空間區域的空間形成部，混合試劑保持在其內部，因而被檢查溶液吸引的同時被混合試劑溶解，細胞成分的收縮和色素成分進行褪色。由此，即使在硝化纖維素類的孔徑小的多孔質擔體上也不堵塞，可以進行浸透，含有全血檢體類的細胞成分的被檢查溶液可以不預先處理而使用，而且可以更低地抑制浸透反應層擔體上的血色素的色度，利用目測容易地確認液體試樣展開後的顯色反應，即使在使用測定儀器進行測定時，也可以無限地更低地抑制血色素帶來的本底值的影響。
另外，本實施方案3中圖4具有直接將液體試樣添加到混合試劑保持部位9上的構造，也可以具有的構造是在比混合試劑保持部位被檢查溶液的浸透方向的上遊測上設有試樣添加區域2。另外圖5具有混合試劑保持在試樣添加區域2上的空間內的結構，具有使細胞收縮劑或標記試劑的任何一方設在反應層上，剩餘的一方保持在空間內的結構也沒有問題。
另外，圖4和圖5的構成是標記試劑保持部位3或吸水區域6由不同的部位構成，或者在支持體上形成反應層4上保持標記試劑保持部位3、不帶有吸水區域的構成也都可以。
實施方案4下面對本發明的實施方案4參照圖6～圖14進行說明。
圖6是顯示本發明實施方案4的生物傳感器的構成的立體圖。
在圖6上，10是用於確認反應層4上的結果的結果確認窗口。另外，對於其他的構成和圖1具有相同部位，使用相同的符號，省略說明。以上按吸水區域6、反應層4、標記物保持部位3、漂白試劑保持部位8的順序各部位以層合的形狀形成試件。
另外圖7是從漂白試劑保持部位8看圖6所示的試件的立體圖。圖8是從吸水區域6看圖6所示的試件的立體圖。另外，圖9是從試樣添加部側看，在圖6所示的漂白試劑保持部位8上層合了由吸收性大的無紡布或玻璃纖維濾紙等構成的，用於添加或塗附被檢查溶液的試樣添加區域2的試件的立體圖。圖10是從吸水區域6側看圖9的立體圖。
圖11是從細胞收縮劑保持部位7側看在圖6所示的漂白試劑保持部位8上層合了無紡布或玻璃纖維濾紙等以可以溶解的狀態保持細胞收縮劑的細胞收縮劑保持部位7的試件的立體圖。圖12為從吸水區域6側看圖11的立體圖。
圖13是從混合試劑保持部位9側，看將圖6所示的漂白試劑保持部位8變更為細胞收縮劑和漂白試劑的混合試劑的混合試劑保持部位9層合的試件的立體圖，圖14是從吸水區域看第13圖的立體圖。
這樣構成的生物傳感器使用圖6～圖14說明該動作。
首先將被檢查溶液添加到添加部，到達收縮劑保持部位7的區域。被檢查溶液在收縮劑溶出的同時收縮細胞成分，達到漂白試劑保持部位8的區域。保持在漂白試劑保持部位8區域的漂白試劑利用被檢查溶液的浸透溶解，使血液色素類色素成分褪色，到達標記物保持部位3的區域。標記物保持部位3的區域保持的的標記試劑利用被檢查溶液的浸透溶解，浸透到反應層4的區域。在反應層4的區域上有固定化特異性蛋白質的特異性蛋白質固定化部5，從標記物保持部位3的區域溶出的標記試劑和被檢查溶液中的分析對象物、以及特異性蛋白質之間進行反應。這時，只要在被檢查溶液中存在分析對象物，就在特異性蛋白質固定化部位5的區域可見某種的顯色反應。最終被檢查溶液吸收在吸水區域6，反應結束。並且測定結果利用目測從結果確認窗口10確認。
這樣本實施方案4的生物傳感器由於形成在試件上保持細胞成分收縮劑的區域，所以不產生細胞成分產生的堵塞，被檢查溶液中的液體成分可以快速地浸透到反應層4上，在添加含有檢體類細胞成分的被檢查溶液的場合也不需要預先進行預處理，可以直接添加進行測定。另外，由於在試件上構成漂白試劑保持部位，漂白試劑溶出的同時被檢查溶液中的色素成分褪色，可以抑制判定區域之外的反應層上的色度。可以不受血色素的影響，更加簡便快速地高性能地進行定性定量測定。
以上本實施方案1～4上的生物傳感器由於使用硝化纖維素或無紡布或玻璃纖維濾紙之類的，以任意的多孔質性擔體構成的色譜法材料構成的試件，所以例如使用抗原抗體反應類的任意的測定原理，分析檢出某種特定物質，可以進行定性定量測定。
另外在本實施方案1～4中以使用標記物抗原抗體反應為例進行說明，只要是在反應前後如酶一樣發生某種變化的標記物，使用哪一種都可以。
另外在本實施方案1～4中的生物傳感器由於將添加到試件上的被檢查溶液為全血，所以不需要預先預處理血液檢體，可以作為檢體直接滴下進行測定，所以在測定血液中的分析對象物的場合，不需要使用已有的大型儀器，可以更加簡便快速地測定，可以得到高靈敏度高性能的測定結果。
另外本實施方案1～4中的生物傳感器其標記試劑可以為金屬溶膠、非金屬溶膠、顏料溶膠、著色粒子、色素、酶、蛋白質等，使用這些標記物的任何種都沒有任何問題。
利用這樣的構成在測定預先含有血液檢體類細胞成分的被檢查溶液的場合，也不需要進行預處理，另外由於不受色素成分產生的影響，可以更加簡便快速地進行高靈敏度高性能的測定。
另外，本實施方案1～4中的生物傳感器可以是一步免疫色譜法試件，利用這樣的構成不需要預先預處理含有全血等細胞成分的被檢查溶液，利用免疫反應得到測定對象物對應的抗體或抗原，可以測定類型廣泛的測定對象物，即使在使用含有全血等的細胞成分的被檢查溶液的場合也可以快速地進行測。另外這裡所示的一步是在該測定操作中，不需要預處理含有全血等細胞成分的被檢查溶液，只將被檢查溶液滴至試件上，或在被檢查溶液的滴下前後在試件上使用和被檢查溶液不同的展開溶液，不需要分離B/F的色譜擔體的洗淨操作，所述的免疫色譜法試件是指在色譜展開的擔體上利用抗原抗體反應檢測被檢查溶液中的被檢物質的傳感器。
另外，本實施方案1～4上的生物傳感器也可以是乾式分析元件的免疫色譜法試件，這樣的構成由於生物傳感器整體是乾燥擔體，所以可以提供不僅搬運容易，而且不需要嚴密地控制保存環境和保存狀態，可以操作容易地不選擇保存條件，可以長期保存的生物傳感器。另外，這裡所示的乾式分析元件顯示構成生物傳感器的所有的部件以及擔持的試劑是乾燥狀態。
實施例下面利用實施例更具體地說明本發明。不過本發明不限於這些實施例。
實施例1(橫型色譜傳感器進行的全血中的hCG定量)a)免疫色譜法試件的配製首先使用磷酸緩衝溶液稀釋，準備調整好濃度的抗hCG-β抗體溶液。使用溶液流出裝置將該抗體溶液塗敷在硝化纖維素膜上。這樣可以在硝化纖維素膜上得到檢測用的抗體固定化線段。將該硝化纖維素膜乾燥後，浸漬在含有1％的脫脂乳的Tris-HCl緩衝溶液中，緩慢地搖動30分鐘。30分鐘之後，將膜轉移到Tris-HCl緩衝溶液槽中，緩慢振動10分鐘，之後在另一種Tris-HCl緩衝溶液槽中再緩慢振動10分鐘，以洗淨膜。進行2次如上的洗淨操作之後，從洗淨液中取出膜，在室溫乾燥。
利用0.01％氯金酸、在回流中的100℃的溶液中加入檸檬酸溶液以配製金膠體。再連續回流30分鐘之後室溫放置冷卻，利用0.2M的碳酸鉀溶液調配成pH9。該金膠體溶液中加入hCG-α抗體，進行數分鐘的攪拌，之後添加10％BSA(牛血清蛋白質)溶液pH9使其最終為1％量，進行攪拌，配成抗體金膠體複合物(標記抗體)溶液。其後利用20000G 50分鐘的離心分離，單獨分離標記抗體，將其懸濁於洗淨緩衝液(1％BSA磷酸緩衝液)中，之後進行離心分離，分離洗淨分離標記抗體。用洗淨緩衝溶液懸濁該標記抗體，用0.8μm的濾器進行過濾，配成最初的金膠體溶液量的10分之一，在4℃儲藏。
然後，將這樣配製的標記抗體溶液放置在溶液流出裝置上，塗敷在與抗hCG-β抗體固定化乾燥膜上的抗體固定化位置分離的位置上，之後使膜乾燥。這樣在固定化膜上可以得到標記抗體保持部位。
將配成0.15M的氯化鉀和調製成0.05％的過碳酸鈉的混合水溶液，相對無紡布每單位面積滴下0.1ml，之後直接在液氮下冷凍，進行冷凍乾燥。這樣可以得到氯化鉀和過碳酸鈉含浸的混合試劑保持部件。另外同樣的製作不含0.05％的過碳酸鈉的只含細胞收縮劑的氯化鉀的保持部件。
這樣將含有配製好的標記抗體保持部位的固定化膜貼附在反應層擔體支持體上，以混合試劑保持部件或細胞收縮劑保持部件和玻璃纖維濾紙作為吸水區域，貼附，之後切成0.5cm寬的細片，製成試件。
b)試樣的配製作為抗凝劑加入肝素的人的血液配製成血細胞比容值為45％。在該血液中添加已知濃度的hCG溶液，配成各種已知濃度的hCG溶液。
c)試樣上的顯色程度的測定將含有hCG的血液添加到試件上的試樣添加部成200μl以上，向吸收區域方向展開處理，使其進行抗原抗體反應，在抗體固定化部分進行顯色反應。使用反射型分光光度計(CS9300，島津製作所制)測定相試件中添加試樣5分鐘後的顯色狀況，計算處理顯色度。
將0、100、1000、100000U/l的hCG的血液(血細胞比容值為45％)添加到試件上，進行展開處理。各hCG濃度的血液對應的試件上的抗體固定化部的顯色狀態利用反射型分光光度計進行測定。測定635nm的波長上的吸光度，代入預先製成的hCG濃度和吸光度的關係標準曲線。結果示於圖15。
圖15是顯示具有漂白作用的試劑存在於試件上的場合和沒有的場合下測定顯色度情況的場合的性能的圖，第15(a)圖是顯示使用不含有漂白試劑的過碳酸鈉的生物傳感器的場合，第15(b)圖是顯示使用設有漂白試劑保持部位的生物傳感器的場合的定量性能的圖。橫軸顯示添加到試件上的試樣的hCG濃度。縱軸是顯示將試件上的顯色區域上的標記物產生的信號代入標準曲線，求得的試樣中的hCG濃度的換算值。
本來測定例如含有1000U/l的hCG的血液的吸光度，將吸光度代入檢測線，hCG濃度為1000U/l，實際上有少許偏離。根據其偏離的大小可以得到該測定的準確度。
下面在以全血作為試樣的色譜法定量測定中，不使用漂白試劑的場合和將漂白試劑保持部位設在試件上的場合進行說明。
圖15是顯示將全血添加到免疫色譜法試件上，以5分鐘後的顯色度的測定值為基礎，換算分析對象物的濃度得到的結果。這時使用的標記試劑第15(a)圖以及第15(b)圖均為相同的抗體-金膠體複合體。首先在試件上含有漂白試劑的場合(第15(b)圖)為CV值(變動係數)為0～15％，相對而言不含有漂白試劑的場合第15(a)圖)為受到血細胞色素的影響CV值為20～65％，，顯示大的離散度。定量性能不好。
以上結果可知，通過將漂白試劑放入生物傳感器中，抑制血液原有的色素的影響，可以提高定量性能。
本實施例將過碳酸鈉作為漂白試劑，將氯化鉀作為細胞收縮劑使用，對結果進行了說明，也可以使用除此之外的具有漂白效果和細胞收縮效果的物質。
另外作為本實施例的色譜法測定裝置，使用硝化纖維素和玻璃纖維濾紙類、由任意的多孔質性擔體構成的色譜法材料構成的試件。這樣的材料構成的試件例如使用抗原抗體類的任意的測定原理，分析檢測某種特定的物質，可以定性或定量。另外，使用標記物的抗原抗體反應作為例子進行了說明，在反應前後只有要和酶一樣產生某種變化的物質都可以使用。
產業上利用的可能性如上所述，本發明涉及的生物傳感器不需要特別的儀器，另外不需要預先進行預處理被檢查溶液，僅通過添加，就可以降低血液色素類的被檢查溶液原有的色素成分的影響，利用目測確認分析結果，特別是本發明的生物傳感器適合進行以血液成分為代表的有色成分的液體試樣的分析。
權利要求
1.一種生物傳感器，設有展開被檢查溶液的展開層，至少設有在所述展開層的一部分上可以利用被檢查溶液的展開而溶解地保持標記試劑的標記試劑部分，和在所述展開層的一部分上固定化了和被檢查溶液中的分析對象物進行特異性反應的試劑的試劑固定化部分，其特徵為，在該生物傳感器上，在添加被檢查溶液到所述展開層的試樣添加區域，或者相對於所述試樣添加區域在被檢查溶液的浸透方向下遊側之中的至少局部上設有漂白試劑區域，具有漂白作用的試劑以可以溶解的乾燥狀態被擔持。
2.如權利要求1所述的生物傳感器，所述展開層由硝化纖維素構成。
3.如權利要求1所述的生物傳感器，其中將具有漂白作用的試劑以可以溶解的狀態直接擔持在所述展開層上。
4.如權利要求1所述的生物傳感器，其中在所述展開層上配設利用毛細管現象流入被檢查溶液的試樣的流入區域，在所述試樣流入區域中保持所述漂白試劑區域。
5.如權利要求1所述的生物傳感器，其中添加的被檢查溶液為全血。
6.如權利要求1所述的生物傳感器，其中具有所述漂白作用的試劑為過碳酸鈉。
7.如權利要求1所述的生物傳感器，其中具有所述漂白作用的試劑為過氧化氫。
8.如權利要求1所述的生物傳感器，其中具有所述漂白作用的試劑為次氯酸鈉。
9.如權利要求1所述的生物傳感器，其中所述生物傳感器是一步免疫色譜法試件。
10.如權利要求1所述的生物傳感器，其中所述生物傳感器是乾式分析部件。
11.一種生物傳感器，設有展開被檢查溶液的展開層，還至少設有在所述展開層的局部可以利用被檢查溶液的展開而溶解的保持標記試劑的標記試劑部分，和在所述展開層的局部上固定化的了被檢查溶液中的分析對象物進行特異性反應的試劑的試劑固定化部分；其特徵為，在該生物傳感器中，所述展開層上相對被檢查溶液的浸透方向，比添加被檢查溶液的試樣添加區域為被檢查溶液的浸透方向下遊側的至少局部上，設有分別可以溶解地擔持有細胞成分收縮劑和具有漂白作用的試劑的區域。
12.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述展開層由硝化纖維素組成。
13.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述展開層上具有漂白作用的試劑可以溶解地進行直接擔持。
14.如權利要求11所述的生物傳感器，其中在所述展開層上設有利用毛細現象流入被檢查溶液的試樣流入區域，在所述試樣流入區域中保持所述漂白試劑區域。
15.如權利要求11所述的生物傳感器，其中在所述展開層上擔持細胞收縮劑和具有漂白作用的試劑混合的試劑。
16.如權利要求11所述的生物傳感器，其中在所述展開層上設有利用毛細現象流入被檢查溶液的試樣流入區域，細胞收縮劑和漂白作用混合的試劑保持在所述試樣流入區域中。
17.如權利要求11所述的生物傳感器，其中添加的被檢查溶液為全血。
18.如權利要求11所述的生物傳感器，其中具有所述漂白作用的試劑為過碳酸鈉。
19.如權利要求11所述的生物傳感器，其中具有所述漂白作用的試劑為過氧化氫。
20.如權利要求11所述的生物傳感器，其中具有所述漂白作用的試劑為次氯酸鈉。
21.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述細胞收縮劑為無機鹽。
22.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述細胞收縮劑為胺基酸。
23.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述細胞收縮劑為糖類。
24.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述生物傳感器為一步免疫色譜法試件。
25.如權利要求11所述的生物傳感器，其中所述生物傳感器是乾式分析部件。
全文摘要
本發明涉及的生物傳感器,如圖1所示,設有向展開層上添加被檢查溶液的試樣添加區域,或者相對所述試樣添加區域在被檢查溶液的浸透方向下遊側的至少局部具有漂白作用的試劑以可以溶解地狀態擔持的區域。這樣構成的生物傳感器可以利用漂白試劑使液體試劑中的有色成分褪色,通過降低其反應區域的有色,不僅可以目測判斷,而且可以無限低地抑制測定器產生的讀取誤差,可以有效地得到正確的測定結果。
文檔編號G01N33/558GK1383488SQ01801839
公開日2002年12月4日 申請日期2001年6月28日 優先權日2000年6月28日
發明者高橋三枝, 灘岡正剛, 田中宏橋, 北肋文久 申請人:松下電器產業株式會社