用於分子的功能和結構表徵的直接結合傳感器與質譜集成的製作方法

2023-09-19 08:41:50 2

專利名稱：用於分子的功能和結構表徵的直接結合傳感器與質譜集成的製作方法
優先權本申請要求於2004年6月28日申請的美國系列申請No.60/583560的權益，其在這裡通過引用被整體引入。
背景技術：
結構分析與檢測測定組合可以提供關於分子功能和結構的互補信息。以前的工作已證實這種組合方法對例如配體垂釣(ligand Fishing)，表位作圖和胺基酸測序的應用有效用，但僅在基於微流體通道表面等離子體激元共振(SPR)的系統的低通量樣本限定的情況下。見Nelson等，BIA/MS of Epitope-TaggedPeptides Directly from E.coli LysateMultiplex Detection and Protein Identification atLow-Femtomole to Subfemtomole Levels.Analytical Chemistry 1999，712858-2865；Nelson等，Biosensor chip mass spectrometryA chip-based proteomicsapproach.Electrophoresis 2000，211155-1163。將檢測測定與結構分析組合的先前已知方法在效用上受到可以從流動細胞中回收的已結合材料的亞毫微微摩爾(femtomole)數量的極端限制，以及受到產生足夠數量可檢測材料所要求的眾多樣本注入/檢測/洗脫循環的極端限制。見例如，Williams Addona，Theintegration of SPR sensors with mass spectrometrypossible applications for proteomeanalysis.Tibtech 2000，1845-48。
本領域需要能夠使這些分析技術以與生命科學研究的產能和成本目標一致的方式進行的方法。
發明概述本發明的一個實施方案提供一種分析或識別一種或多種分子的方法。該方法包括使包含一種或多種分子的樣本與比色共振反射光學傳感器接觸，以使該一種或多種分子中的一種或多種被固定到比色共振反射光學傳感器上。從比色共振反射光學傳感器對已被固定的一種或多種分子洗脫並施加質譜分析。該固定到比色共振反射光學傳感器上的一種或多種分子可以被檢測。通過峰值波長值(PWV)的偏移可以直接檢測該固定到比色共振反射光學傳感器上的一種或多種分子。該固定到比色共振反射光學傳感器上的一種或多種分子可以利用一個標記物檢測。峰值波長值(PWV)信號也可以被檢測。該檢測可以包括使用分子質量等於、大於或小於該固定到比色共振反射光學傳感器上一種或多種分子作為指示分子。對該一種或多種分子可以進行量化。可以通過比色共振反射光學傳感器表面上的一種或多種結構部分(moieties)將該一種或多種分子固定到比色共振反射光學傳感器上。該一種或多種結構部分可以是TiO、RaM Fc、抗生物素蛋白、生物素、抗體、抗體片段、核酸分子、蛋白質A、蛋白質A雜化物、蛋白質G、蛋白質G雜化物、蛋白質L、蛋白質L雜化物、高密度PVA、CHO或其組合。可以將該比色共振反射光學傳感器偶聯到用於檢測的流動系統。
本發明的另一個實施方案提供一種分析或識別一種或多種分子的方法。該方法包括使包含一種或多種分子的樣本與比色共振反射光學傳感器接觸，以使該一種或多種分子中的一種或多種被固定到比色共振反射光學傳感器上；獲得沒有被固定到該比色共振反射光學傳感器上的任何分子；以及將對該沒有被固定到該比色共振反射光學傳感器上的任何分子施加質譜分析。
本發明的另一個實施方案提供一種分析或識別一種或多種分子的方法。該方法包括使包含一種或多種分子的樣本與基於流動的表面等離子體激元共振傳感器接觸，以使將該一種或多種分子中的一種或多種固定到傳感器上；從傳感器上洗脫已被固定的一種或多種分子；和對該一種或多種分子施加質譜分析。可以檢測和/或量化該已固定到傳感器上的一種或多種分子。
本發明的另一個實施方案提供一種分析或識別一種或多種分子的方法。該方法包括將包含一種或多種分子的樣本與表面等離子體激元共振傳感器接觸，以使該一種或多種分子中的一種或多種被固定到傳感器上；獲得沒有被固定到該傳感器上的任何分子；對該沒有被固定到該傳感器上的任何分子施加質譜分析。可以檢測和/或量化該固定到傳感器上的一種或多種分子。
附圖的簡要說明

圖1示出了利用外部MALDI-TOF板用於蛋白質的比色共振反射光學傳感器/MS分析的序列步驟。該比色共振反射光學傳感器微量反應板配備有固定的配體，其專門用於從被測樣本中檢測目標蛋白質，記錄正PWV偏移。結合之後，洗脫被結合目標，與MALDI基體相混合，進而作為1μl點樣施加在標準MALDI板上進行分析。
圖2示出了來自比色共振反射光學傳感器系統的數據，表示隨實驗時間(橫坐標值)變化的抗體(hIgGcIgG)的連接和抗原(Fab)的結合的正標準PWV偏移(縱坐標值)以及在抗原(Fab)被洗脫時的PWV偏移降低。用10mM甘氨酸緩衝劑pH 2的洗脫量是大約20μL，針對Fab洗脫的大約1.2nm PWV偏移與來自96孔微量滴定比色共振反射光學傳感器板的6mm直徑孔的大約28mm2表面面積的3.6ng/mm2(即捕獲大約100ng的Fab並從傳感器表面上洗脫)相關。Fab具有22300Da的平均分子量值。
圖3A和圖3B。圖3A示出了用於2pmol Fab對照的MALDI-TOF光譜。圖3B示出了用於從圖2中的使用1μL的sinapinic acid點樣MALDI表面上的比色共振反射光學傳感器的單一孔中洗脫1μL材料的MALDI-TOF光譜。在22300Da的分子量下的所期望材料的主要峰值被標記，兩個其它的明顯的峰(11057和44967)與主要產物的峰相關。
圖4示出了來自比色共振反射光學傳感器的數據，表示隨實驗時間(橫坐標值)變化的抗原A的結合(Biogen Idec所有的分子和Ab)的正標準PWV偏移(縱坐標值)以及在抗原A被洗脫時的PWV偏移降低。用10mM甘氨酸緩衝劑pH 2的洗脫量是大約12μL，對於抗原A的洗脫的大約80pm的PWV偏移與來自96孔微量滴定比色共振反射光學傳感器板的6mm直徑孔的大約28mm2表面面積的6.7ng的總質量(即大約0.3pmol的17900Da的分子或0.56μg/mL或28nM)相關。該檢驗指出比色共振反射光學傳感器系統的靈敏度以檢測特異性結合到傳感器上的少量的材料。
圖5示出了從圖4所示的比色共振反射光學傳感器上洗脫的6μL的材料的ESI-MS數據。僅有的明顯的峰與原始的17900預期產物相關。
圖6A示出了傳感器的橫截面圖，其中顯示光照射傳感器的底部；然而，光可以從頂部或底部照射傳感器。n基底代表基底材料，n1代表任選覆蓋層的折射率，n2代表光柵的折射率。圖6B示出了傳感器的另一個示圖。
圖7示出了包括一維光柵的比色共振反射光學傳感器的實施方案。
圖8示出了由一組同心環構成的共振反射結構。
圖9示出了共振反射結構，其包括孔六角形網格(或柱六角形網格)，非常近似圖8的同心環結構，不需要聚焦照射光束到網格的任一特定位置上。
發明的詳細描述在過去的30年中，生物化學分析方法和設備上的多個技術發展已使常規蛋白質特徵表達方法發生很大改進，帶來分析儀器的發展，能夠提供更靈敏和更精確的信息。兩種分析方法在蛋白質特徵表達中已經找到日益增長的應用直接結合檢驗和質譜分析(MS)。直接結合檢驗比如那些由比色共振反射光學傳感器支持的檢驗能夠監控生物分子或細胞之間的相互作用，當已固定受體和溶液中的配體之間發生所述相互作用時。該技術能夠確定蛋白質的功能特徵，並且能夠被用來確定親和力參數。基於MS的技術，例如基體輔助雷射脫附/電離飛行時間(MALDI-TOF)和電噴霧電離(ESI)通過利用結合資料庫檢索的肽質量作圖的從蛋白質序列核對經精確質量確定到蛋白質識別分析，被用於有機分子例如蛋白質和無機分子的結構表徵。
質譜分析不是通用的檢測方法，並且如果不正確調整或集中檢測，則經常不能檢測到存在的許多材料。通過本發明，質譜分析者將了解到材料的確存在以及存在的數量，並且由此能夠開發更好方法來檢測它的存在，獲得通過它的質量和結構來識別材料的能力。
在本發明的一個實施方案中，可實現對質譜方法的簡化。在推動質譜分析技術達到它的最高點上，目前趨勢包括非常複雜樣本的質量分析。本發明允許通過傳感器實現對最複雜樣本的解卷積同時保持質量分析。傳感器允許對來自複雜介質的材料進行特定選擇和量化，由此在將它引入質量分析之前「清理」樣本。
質譜經常會是密集的或對於更大分子量的材料例如但不限於生物材料而言具有重疊信號，這對於來自蛋白質組分析，患者樣本，動物的臨床前樣本，全細胞溶解產物等的複雜樣本尤其是這樣。通過傳感器去除特定材料(例如，在MS分析中通過將樣本中的特定材料固定到傳感器上並且使用包含未結合特定材料的溶液)能夠允許質譜變得更容易確定其它質量。在另外的方法中，質譜可以通過傳感器確定材料的特定去除或選擇，這可以通過沒有粘附到傳感器上的材料的質量分析而實現。
本發明的一個實施方案相對於前述將傳感器與質量分析結合的方法具有顯著的優點。本發明可以採用基於靜態(表示基於非流動的系統)孔的傳感器並且由此相對於其它系統提供顯著的優點。基於靜態的系統能夠探測更短暫的相互作用。分子之間的相互作用由針對兩個分子形成一對所需要花費的時間量和兩個分子解離所需要花費的時間量的速率來描述。當解離速率較快時，結合的識別和分析更複雜。被允許趨於平衡的靜態系統比到目前為止描述的任何基於流動的系統具有更大的機會去探測相互作用並保持它用來分析。如此本發明提供給質量分析人員更多與之工作的樣本，作為優點可以採用任何樣本工作。
本發明的另一個實施方案提供一個系統，在該系統將比色共振反射光學傳感器偶聯到一流動系統上，該流動系統可以提供分子的高通量篩選。
本發明的另一個實施方案提供一種篩選小分子個體或庫的方法。用於藥物開發的小分子範疇由大的化合物文庫組成，所述化合物中許多被認為是純淨的或者實質上是單一的組份，而這些文庫的其它部分由來自在惡劣環境困境下存活的外來有機體的提取物組成。許多方法已被嘗試識別人和牲畜疾病目標的高親合力的特定粘合劑。本發明允許檢測和識別以高親合力和特異性結合所述藥物目標的文庫成員。
本發明的另一個實施方案提供一種篩選蛋白質個體或庫的方法。在主要關注於人和病原體基因組之後，理論和藥物研究前沿已花費相當多的時間和精力研究蛋白質組或大量由動物基因組規定的蛋白質的存在、活動性和相互作用。本發明提供使用這裡描述的各種技術來研究動物蛋白質組的方法。
本發明的另一個實施方案提供量化分子的方法。分子可以通過比色共振反射光學傳感器，通過MS，或者通過比色共振反射光學傳感器和MS二者來量化。分子通過比色共振反射光學傳感器量化，其通過將配體分子固定到比色共振反射光學傳感器表面，然後當量化分子被顯露於傳感器+配體表面下時，檢測量化分子的PWV偏移。如果用戶已預先開發出校準曲線(PWV偏移對分子濃度)，那麼分子濃度可以通過比色共振反射光學傳感器被量化。如果配體被顯露於包含許多分析物的複雜測試樣本下，那麼PWV偏移可以由分子的混合物產生。在比色共振反射光學傳感器檢測之後，被結合的分子可以從比色共振反射光學傳感器表面上被清除並懸浮在溶液中。如果在溶液上進行MS分析，那麼可以量化預先結合到傳感器上的分析物。
在本發明的另一個實施方案中，確定用於一種或多種分子的結合常數。包括一系列分析物濃縮物的樣本可以被顯露於比色共振反射光學傳感器上固定的配體下。配體+分析物組合的結合常數被確定。在傳感器顯露於同一濃度不同分析物組，那麼可以通過傳感器PWV信號的幅值相互比較分析物的親合力。附加地或替代地，可以從傳感器表面洗脫已結合材料，可以測量來自被洗脫溶液的MS信號幅值以確定結合常數。
本發明的另一個實施方案提供一種製備基體輔助雷射解吸和電離/MS(MALDI/MS)基體的方法。該基體可以包括具有固定在傳感器表面的一種或多種特定結合物質的比色共振反射光學傳感器。任選地，該一種或多種特定結合物質可以被結合到它們各自的結合配偶體上，該一種或多種特定結合物質可以在傳感器表面被排列成一陣列。
比色共振反射光學傳感器比色共振反射光學傳感器即直接結合傳感器已在例如於2001年8月15日申請的美國專利No.09/929957，2001年8月15日申請的美國專利系列No.930353、2004年1月20日申請的美國專利No.10/415037、2004年1月16日申請的美國專利No.10/399940、2002年1月28日申請的美國專利系列No.09/930352、2002年1月28日申請的美國專利No.10/058626、2002年7月23日申請的美國專利No.10/201878、2002年7月15日申請的美國專利No.10/196059、PCT US01/45455、PCT US03/01175、PCT US03/01298、Cunningham等的Sensors and Actuators B(81316(2002))、Cunningham等的Sensors和Actuators B(85219-226(2002))、Lin等的Biosensors和Bioelectronics(17827(2002))Cunningham等的Sensors和Actuators B(87365(2002))中詳細描述過，所有這些都在這裡全文引入作為參考。
比色共振反射光學傳感器，本文或稱傳感器，可以包括次波長(subwavelength)結構表面(SWS)。SWS可以在特定波長上產生明顯光學共振反射，其可以被用來高靈敏度地跟蹤材料(包括例如特定結合物質或結合配偶體或兩者)的相互作用。SWS充當特定結合物質的表面結合平臺。
SWS是一種非常規類型的衍射光學器件，其可以模擬薄膜塗層的效果(PengMorris，J.Opt.Soc.Am.A，Vol.13，No.5，p.993，May 1996；Magnusson Wang，Appl.Phys.Lett.，61，No.9，p.1022，August，1992；Peng Morris，Optics Letters，Vol.21，No.8，p.549，April，1996)。SWS的結構包括表面浮雕光柵，例如一維，二維或三維光柵，其中與入射光的波長相比光柵的周期較小。
通過添加分子例如特定結合物質，結合配偶體或兩者，或者無機分子到覆蓋層的上表面或光柵表面可以調整這種結構的反射或透射顏色。所添加分子的電介質極化率導致發生最大反射或透射所處的波長的調整。
在一個實施方案中，當用白光照射時，傳感器被設計成僅僅反射單一波長或窄帶波長。當特定結合物質或結合配偶體或兩者被連接或固定到傳感器表面時，被反射的波長(顏色)發生偏移。通過連結特定結合物質到傳感器表面，可以在不使用任一種螢光探針或粒子標記物或任何其它種類的標記物的情況下檢測互補的結合配偶體分子。可是，如果希望，也能夠使用一種或多種標記物或指示分子。例如，標記物分子可以是染料，螢光分子，生物螢光分子等。指示分子可以是分子質量等於、大於或小於固定到比色共振反射光學傳感器上的一種或多種分子的生物或免疫衍生分子，例如蛋白質、肽、核酸、肽核酸、鎖定(locked)核酸等。檢測技術能夠分辨例如大約0.1nm厚度的蛋白質結合的變化，並且可以利用侵入流體或乾燥的傳感器表面來執行。
檢測系統組成如下例如垂直入射經過例如光纖光探針時照射傳感器的點的光源，和收集同樣垂直入射經過例如第二光纖光探針的反射光的分光計。因為在激勵/檢測系統與傳感器表面之間不產生物理接觸，所以不需要特殊的耦合稜鏡，並且傳感器可以易於適應任何通用的化驗平臺包括例如微量滴定板和微陣列玻片。單個的分光計讀數可以在幾毫秒內執行，因此可以快速測量同時產生在傳感器表面上的大量分子相互作用並實時監控反應動力。
這種技術在同時測量大量生物分子相互作用的應用中上是有用的，特別是當分子標記物改變或抑制所研究分子的功能時。具有蛋白質目標的藥物化合物文庫的高通量篩選，和用於蛋白質組的蛋白質-蛋白質相互作用的微陣列篩選是應用的實例，其需要由本發明的組合物和方法提供的靈敏度和通量。
圖6A和6B是比色共振反射光學傳感器的實例圖。在圖6中，n基底表示基底材料，n2表示光學光柵的折射率，n1表示任選的覆蓋層，nbio表示一種或多種特定結合物質的折射率，t1表示一維、二維或三維光柵結構上的任選覆蓋層的厚度，t2表示光柵的厚度，tbio表示一種或多種特定結合物質的層厚度。在一個實施方案中，n2＞n1(見圖6A)。對層厚度(即覆蓋層，一種或多種特定結合物質，或光學光柵)進行選擇以使頂部表面上的附加分子獲得共振波長靈敏度。對光柵周期進行選擇以在所希望的波長上獲得共振。
傳感器包括由高折射率材料構成的光學光柵、支持光柵的基底和一種或多種固定在與基底相對的光柵表面上的特定結合物質。任選地，覆蓋層覆蓋光柵表面。依據本發明製造的光學光柵被塗覆有或包括高折射率的介電薄膜，其可以由包括例如硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭和氮化矽的材料構成。本發明的傳感器也可以包括光學光柵，其由例如塑料或環氧樹脂構成，塗有高折射率材料。
線性光柵(即一維光柵)具有共振特性，其中照明光偏振極性被定向垂直於光柵周期。具有任選覆蓋層的線性光柵結構的一個實施方案的示意圖如圖7所示。比色共振反射光學傳感器還可以包括例如二維光柵。具有光學特徵的光柵橫截剖面可以包括任何周期重複函數，例如「方波」。光學光柵還可以包括從直線、正方形、圓形、橢圓形、三角形、梯形、正弦波、卵形、長方形和六邊形組成的組中選擇的形狀的重複形式。線性光柵具有與二維光柵相同的間距(即高和低折射率區域之間的距離)、周期、層厚度和材料特性。但是，為了以一種方式共振耦合到光學結構中以導致最陡峭的共振峰，光必須沿垂直於光柵線的方向偏振。因此，偏振軸垂直於線性光柵方向的偏振濾波器必須被插入到照明源和傳感器表面之間。
光學光柵也可以包括例如「階梯狀」型面，其中單一的、固定高度的高折射率區域被嵌入在較低的折射率覆蓋層內。
還可能的是，製作一種共振傳感器，其中高折射率材料不是階梯狀的，而是隨橫向位置變化。例如，二維光柵的高折射率材料n2在高度上正弦變化。為了在特定波長上產生共振反射，正弦的周期與等效階梯狀結構的周期相等。作為傳感器，正弦變化結構的共振作用和它的功能已利用GSOLVER(GratingSolver Development Company，Allen，Texas，USA)計算機模型得到核實。
本發明的傳感器還可以在與基底相對的光學光柵表面上包括覆蓋層。在存在覆蓋層的情況下，將一種或多種特定結合物質固定在與光柵相對的覆蓋層的表面上。優選地，覆蓋層包括具有比包括光柵的材料小的折射率的材料。覆蓋層可以由例如玻璃(包括旋壓玻璃(spin-on glass，SOG))、環氧樹脂或塑料構成。滿足傳感器折射率要求的各種聚合物可以被用於覆蓋層。SOG可以被使用，這是由於它的良好折射率、易於操作和易於利用玻璃表面活化技術用特定的結合物質激活。當傳感器表面的平面度不是特定系統配置的關鍵時，SiN/玻璃的光柵結構可以直接被用作檢測表面，其活化可以採用與玻璃表面上相同的方式完成。
在光學光柵上沒有覆蓋層的情況下共振反射也可以被獲得。例如，傳感器可以包括塗有高折射率材料的結構化薄膜層的基底。在不使用planarizing覆蓋層的情況下，環境介質(例如空氣或水)充滿光柵。因此，特定結合基底，在光學光柵的所有顯露於特定結合物質的表面上而不僅僅是上表面上，被固定到傳感器上。
特定結合基底和結合配偶體如果存在，通過例如物理吸附或通過化學結合，一種或多種特定結合物質被固定到光柵或覆蓋層上。一個特定的結合物質可以是例如有機或無機分子、核酸、肽、蛋白質溶液、肽溶液、單或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜化物溶液、包含來自組合化學文庫的化合物的溶液、提純的小分子測試化合物例如那些被用在製藥工業以發展藥物先導物的化合物或者小分子測試化合物的混合物、來自各種源例如細菌、病毒、人或其它用於蛋白質組分析的動物源的蛋白質混合物個體或庫、人造的、合成的或動物衍生周質(periplasmic)提取物、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、提純的免疫體(immunobody)(例如，scFv，sFab，F(ab)，全抗體)或免疫體混合物、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物、TiO、RaM抗生物素蛋白、生物素、蛋白質A、蛋白質A雜化物、蛋白質G、蛋白質G雜化物、蛋白質L、蛋白質L雜化物、高密度PVA、CHO、或生物樣本。生物樣本可以是例如血、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤勻漿、滑液、排洩物(feces)、唾液、痰、囊腫(cyst)液、羊水、腦脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、淚液、或前列腺液。聚合物可以選自每個分子具有多個活性部位的長鏈分子組，所述分子由水凝膠、右旋糖苷、聚胺基酸及其衍生物組成，包括聚賴氨酸(包含聚-1-賴氨酸和聚-d-賴氨酸)、聚-苯基丙氨酸-賴氨酸和聚-葡萄糖-賴氨酸。
優選地，一種或多種特定結合物質在傳感器排列成一個或多個不同位置(location)的陣列。特定結合物質陣列包括本發明傳感器表面上的一種或多種特定結合物質，這樣表面包含許多不同位置，每一個具有不同的特定結合物質或具有不同數量的特定結合物質。例如，一個陣列可以包括1、10、100、1000、10000或100000個不同位置。這樣一種傳感器表面被稱為一個陣列，這是因為一種或多種特定結合物質被典型地以規則的網格形狀擺放在x-y坐標中。但是，一個陣列可以包括以任一種規則或不規則的模式擺放的一種或多種特定結合物質。例如，不同位置可以限定一種或多種特定結合物質的點陣列，一個陣列點的直徑可以為大約50至大約500微米，一個陣列點的直徑也可以為大約150至大約200微米。一種或多種特定結合物質可以被結合到它們特定結合配偶體上。
本發明傳感器上的陣列可以通過將一種或多種特定結合物質的微滴放置在例如光柵或覆蓋層表面上的x-y網格位置上產生。當傳感器被顯露於包括一種或多種結合配偶體的測試樣本時，結合配偶體將優先被吸引到微陣列上的不同位置，微陣列包括具有對結合配偶體高親合力的特定結合物質。不同位置中的一些將結合配偶體收集到它們的表面上，而其它位置將不收集。
特定結合物質特異性結合到被添加到本發明傳感器表面的結合配偶體上。特定結合物質特異性結合到它的結合配偶體上，而基本上不結合到被添加到傳感器表面的其它結合配偶體上。例如，當特定結合物質是抗體並且它的結合配偶體是特定抗原，那麼抗體特異性結合到特定的抗原上，而基本上不結合到其它抗原上。結合配偶體可以是例如無機分子、有機分子、核酸、肽、蛋白質溶液、肽溶液、單或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜化物溶液、包含來自組合化學文庫的化合物的溶液、提純的小分子測試化合物例如那些被用在製藥工業以發展藥物先導物的化合物或者小分子測試化合物的混合物，來自各種源例如細菌、病毒、人、或其它用於蛋白質組分析的動物源的蛋白質混合物個體或庫、人造的、合成的或動物衍生的周質提取物、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、提純的免疫體(例如，scFv、sFab、F(ab)，全抗體)或免疫體混合物、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物、TiO、RaM抗生物素蛋白、生物素、蛋白質A、蛋白質A雜化物、蛋白質G、蛋白質G雜化物、蛋白質L、蛋白質L雜化物、高密度PVA、CHO或生物樣本。一個生物樣本可以是例如血、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤勻漿、滑液、排洩物(feces)、唾液、痰、囊腫液、羊水、腦脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、淚液、或前列腺液。
本發明陣列的一個實例是核酸陣列，其中陣列內的每個不同位置包含不同的核酸分子。在這個實施方案中，核酸微陣列內的點檢測與測試樣本中的相反核酸鏈的互補化學結合。
儘管微量滴定板是用於生物化學測定的最普遍形式，但微陣列日益被看作使一次性可以被測量的生物化學相互作用的數目最大化而同時使貴重試劑量最小化的手段。通過用微陣列點樣器(spotter)將特定結合物質施加到本發明的傳感器上，可以獲得10000個特定結合物質/in2的特定結合物質密度。通過將照明光束聚焦來檢查單一微陣列位置，傳感器可以被用作微陣列讀出系統。傳感器表面可以是例如微量滴定板的內部表面。
進一步，可以將微陣列和微量滴定板的實施方案相結合，這樣一種或多種特定結合物質被排列為在傳感器表面上的一個或多個不同位置的陣列，所述表面位於微量滴定板的一個或多個孔內並包含微量滴定板的一個或多個表面，優選底表面。特定結合物質的陣列包括微量滴定板孔內的傳感器表面上的一種或多種特定結合物質，這樣表面包含一個或多個不同位置，每個位置具有不同的特定結合物質或具有不同量的特定結合物質。例如，一個陣列可以包括1、10、100、1000、10000、或100000個不同位置，這樣，微量滴定板實施方案的每個孔可以在其內具有一個或多個不同位置的陣列，與微量滴定板實施方案中的其它孔分隔，這允許在本發明的一個微量滴定板上處理多個不同的樣本，每個隔開孔處理一個或多個樣本。任一孔內的一個陣列或多個陣列可以與同一微量滴定板的任意其它微量滴定孔中存在的一個陣列或多個陣列相同或不同。
可以利用本領域公知的方法，將一種或多種特定結合物質固定到傳感器。此外，可以利用本領域公知的方法，從傳感器表面洗脫特定結合物質或結合配偶體兩者。
質譜利用任一種質譜儀和任一種質譜分析方法，通過質譜分析，可以分析測試樣本。此外，在本發明的方法中可以使用與其它設備例如氣相色譜儀、液相色譜儀、超臨界流體色譜儀和毛細管電泳設備連接的質譜儀。在本發明的方法中可以使用傅立葉轉換離子迴旋共振(FT-ICR)分光計和飛行時間(TOF)質譜、電噴霧電離質譜(ESI-MS)、象限儀和四極設備。如果希望，所選的離子監控(SIM)可以被用於量化分析。質譜/質譜(MS/MS)、同位素質譜和元素質譜分析技術也可以被用於本發明的方法中。
本發明的方法比色共振反射光學傳感器陣列與質譜分析技術結合，例如MALDI-TOF或ESI-MS，可以被用於提供有機和無機分子例如來自血清的蛋白質的功能和結構表徵。此外，本發明的方法可以通過表位標記被用在受體去孤兒化(deorphaning)分析和蛋白質識別中。
利用基於微量反應板的比色共振反射光學傳感器格式和無標記物陣列的非破壞性屬性，比色共振反射光學傳感器/MS系統是多維分析方法，其在簡單的、高通量的、高靈敏的平臺中提供例如蛋白質功能和結構的互補信息，例如蛋白質翻譯後變化。在比色共振反射光學傳感器/MS分析期間，在例如384個測試樣本中針對分析物的被固定配體的結合親合力實時被同時監控。可以洗脫被選擇性保留或選擇性不保留在比色共振反射光學傳感器微量反應板孔上的分析物(針對選擇性保留的分子)，並隨後通過質譜分析例如MALDI-TOF或ESI-MS被分析，其可以確定親合保留的分析物的特性並檢測多個親合回收的分析物。通過這種方式使用，傳感器擔當量化特異性結合到目標的事件的靈敏裝置，並且擔當微量純化載體以供進一步分析。
在對生物傳感器選擇保留的分子進行分析時只有直接結合到傳感器表面上的質量才被探測；與傳感器表面發生化學相互作用的死細胞和其它沉澱材料不產生顯著信號。
由於比色共振反射光學傳感器讀取裝置的簡單性和低成本，比色共振反射光學傳感器/MS集成是節約成本的方法，為MS系統使用者帶來新功能和從競爭平臺區分MS系統。
有許多受體具有各種預測的生物功能，但沒有已知的配體；這種受體通常被稱為孤兒。「配體垂釣」或「去孤兒化」是用以針對眾多化合物或細胞/組織提取物篩選這些受體以便為所述受體識別出可能的配體的方法。見Williams，Biotechnology match makingscreening orphan ligands and receptors.Current opinionin Biotechnology 2000，1142-46。
類似的技術也可以被應用到不具有已知結合配偶體的新的蛋白質。對於配體垂釣的最方便的方法常規地是那些基於直接結合的方法，因為陣列的這些類型不取決於配體激活受體或酶的能力。利用比色共振反射光學傳感器/MS系統，孤兒配體被固定到比色共振反射光學傳感器微量反應板中所有孔的底表面上。每個單個孔被顯露於包含針對所述孤兒的可能的配體的單獨測試樣本。包含針對所述孤兒的高親合力結合物的任一孔將在比色共振反射光學傳感器讀取器中記錄為峰值波長值(PWV)正偏移，記錄一次「命中」。只有滿足命中閾值的孔被洗脫以通過MS用於被結合蛋白質的識別。
比色共振反射光學傳感器/MS可以與基因標記技術一起被使用以用於蛋白質識別。見例如，Nelson等，Analytical Chemistry 1999，712858-2865。首先，標記被融合進名義上未知的基因中，用於跟蹤蛋白質通量表達和選擇性地將蛋白質與表達系統(例如E.coli)隔離的目的。使用比色共振反射光學傳感器微量反應板的底表面上的高選擇性的標記-特異性的固定配體，傳感器被用來親合隔離，檢測和量化被標記的從表達系統回收的多肽。比色共振反射光學傳感器分析之後，被標記的多肽的質量被正確通過例如MALDI TOF分析確定，其反過來經過資料庫檢索被用於蛋白質結構表徵例如序列核對。
比色共振反射光學傳感器測定系統可以容易地與基於MS的分析系統合作以同時提供例如蛋白質親合力和蛋白質識別信息。考慮到比色共振反射光學傳感器系統的內在靈敏度、通量和成本優勢，這在以前是沒有過的，目標去孤兒化和表位作圖是利用這種獨特性能的其它應用。初步的檢驗已被執行以確定目標Fab片段的離線比色共振反射光學傳感器+MALDI-TOF分析的基本方法(見實施例)。由於比色共振反射光學傳感器讀取裝置的簡單性和低成本，比色共振反射光學傳感器/MS集成是節約成本的方法，為MS系統使用者帶來新的功能，並從競爭平臺中區分MS系統。
本發明的另一個實施方案提供一種分析或識別一種或多種分子的方法，包括將包括一種或多種分子的樣本與基於流動的表面等離子體激元共振傳感器接觸，以使該一種或多種分子中的一種或多種被固定於傳感器，被固定的分子可以從傳感器上洗脫或者未固定的分子可以被收集。這些分子然後接受質譜分析。固定到傳感器上的一種或多種分子可以被檢測，該一種或多種分子可以被量化。
任何地方提及的所有專利、專利申請和其它科學或技術文件在這裡被整體引入作為參考。這裡描述的方法和合成物作為目前優選實施方案的代表，是示例性的並且不意味著對本發明範圍的限制。其中的變化和其它應用對本領域的技術人員來說是顯而易見的，並且被包圍在本發明的宗旨裡面。在這裡示意性描述的本發明可以適當地在這裡沒有具體公開的任一要素或多個要素、一個限制或多個限制不存在的情況下實踐。因此，例如，在這裡的每個例子中，術語「包括」、「基本上由......組成」和「由......組成」中任一個可以由其它兩個術語中的任一個所代替。已採用的術語和表達被用作描述的術語但不是限制，並且不意味著這種術語和表達的使用把所示和所描述的特徵的任一等價物或其部分排除之外，但可以意識到在本發明所要求保護的範圍內可以有各種修改。因此應該理解地是，儘管本發明已通過實施方案具體公開並且這裡公開的可選特徵、修改和概念變化被認為是落入本發明由說明書和附加權利要求限定的範圍內。
另外，儘管本發明的特徵或方面以馬庫什組或其它替代物分組方式描述，但本領域的技術人員可以意識到本發明也可以馬庫什組或其它組的任一單一成員或成員亞組的方式描述。
實施例實施例1Tandem BIND/MALDI-MS檢驗執行用以顯示被結合到比色共振反射光學傳感器表面的材料能夠通過質譜被有效地洗脫和分析的檢驗。使捕獲抗體被吸收到比色共振反射光學傳感器表面。在比色共振反射光學傳感器上應用樣本的期間允許相應的抗原被結合到抗體上。被特異性結合到抗體上的任何材料隨後被從表面上洗脫，然後將一小份洗脫材料進行質譜分析。被洗脫的材料與適量的MALDI基體混合併被添加到MALDI板，被用來(TOF)MS分析。
圖1示出了用來將比色共振反射光學傳感器技術與MALDI型質譜檢驗結合的規程。該過程包括在比色共振反射光學傳感器板上吸附抗體(0.1mg/ml)並添加抗人IgG。該對照是雞IgY。IgG結合到被添加的人Fab(MW平均值＝22300Da)上，並且比色共振反射光學傳感器信號被檢測。利用甘氨酸(10mM，pH＝2.0)洗脫抗體，從比色共振反射光學傳感器板取出所述溶液，ZipTip吸液管尖端被用來使取出以便於MS分析的溶液脫鹽。1ul的脫鹽材料被添加到MALDI板並與1ul sinapinic acid混合，在Biogen Idec’s ABI/Voyager系統上獲得MALDI-MS數據。
實施例2基體輔助雷射解吸電離(MALDI)質譜(MS)比色共振反射光學傳感器TiO傳感器被預先用PBS漂洗三次並在室溫中放置30分鐘，讀取幾分鐘的基線讀數並且將10ul的1mg/ml的人IgG或雞IgY被稀釋入已在孔中的90ul PBS，以形成最終100ug/mL的抗體濃度。將蛋白質放入孔中並被允許結合到TiO表面，持續90分鐘。未結合的蛋白質溶液被從孔中取出並且該孔每次用200ul的PBS漂洗三次。
讀取幾分鐘的另一基線讀數，然後將1ul的1mg/ml的抗人IgG(Fab)放入孔中，這些孔被塗覆有hIgG(紅)或cIgY(黃)並被允許培養60分鐘。所有的未結合蛋白質溶液被從孔上取出，該孔用PBS漂洗三次。監控幾分鐘結合信號的穩定性。由hIgG結合的任何保留的Fab在每個孔中用30ul的10mM甘氨酸pH 2緩衝劑洗脫。在傳感器儀器上該洗脫過程被監控並且任何被洗脫的蛋白質被收集以用於質譜分析。
利用BIND檢測抗人IgG(Fab)2和人IgG的特異性相互作用。針對雞IgY(黃)上抗人IgG(Fab)2，存在不可檢測的信號。參見圖2。12uL中有大約0.8nmΔPWV的蛋白質(＝3ng×0.8nm×28或67ng的蛋白質)被從hIgG塗布的傳感器表面洗脫以用於質譜分析。
實施例3Tandem BIND/MALDI-MS檢驗-MS數據圖3A示出了來自在顯露於傳感器表面下之前施加給MS的包含Fab的對照溶液的數據。主要峰值在22300，另外兩個峰值是與母體分子質量相關的特徵峰值。
圖3B示出了來自從傳感器表面洗脫的溶液的MALDI-MS數據。該質譜與圖3A所示的對照譜相同。
實施例4Tandem比色共振反射光學傳感器/電噴霧電離(ESI)-MS檢驗將抗體吸附到CHO比色共振反射光學傳感器板(低密度乙醛板)上(0.1mg/mL)。該抗體是專有的人抗Ag A抗體，將抗原A(20000Da)添加(～20mg/mL)到抗體塗布的傳感器上並且檢測BINDTM信號。未結合的Ag A溶液被從傳感器上取出並且孔被用PBS衝洗三次。任何在傳感器上被捕獲的抗原A被用12uL甘氨酸(10mM，pH＝2.0)從一個直徑為6mm的孔洗脫。包含被洗脫蛋白質的溶液被從比色共振反射光學傳感器板上取出。在Biogen MS系統上獲取ESI-MS數據。
抗原蛋白質被取出，如由傳感器分析確定的差別信號所證明。MS數據示出了從傳感器上洗脫的特定抗原蛋白質材料的明確捕獲和質量測定。抗原A在42分鐘的時間點(橫坐標值)結合到被固定到CHO比色共振反射光學傳感器上的抗體A上。未結合的抗原A洗脫質量/孔(抗原)＝＞6.7ng或0.3pmol。被洗脫抗原濃度＝＞0.56ug/mL或28nM。
圖4示出了來自ESI-MS檢驗的原始質譜，檢驗中注入6uL的從單個6mm傳感器孔洗脫的材料。圖5示出了來自ESI-MS檢驗的質譜，檢驗中注入6uL的從單個6mm傳感器孔洗脫的材料。母體峰位於感興趣分子的期望質量上，18052mw處的峰值是與主要峰的糖基化相關的特徵峰值。圖5證明了傳感器「清理」樣本的能力，因此提供一更簡單的質量分析檢驗。為了在臨床前檢驗中捕獲人單克隆Ab，傳感器最初塗有蛋白質A。mAb加入到傳感器表面之後，100％的人血清被添加到傳感器上。上述的數據曲線，隨著100％的人血清被添加到傳感器表面之後，自歸零的基準點起始。在圖5中的8分鐘處，1uL或5uL於血清中的抗原被添加到包含mAb的不同孔中。另一個包含非特異性人IgG的對照孔被添加5uL的包含抗原的血清。數據清楚地示出，在8.5分鐘處，1和5uL的mAb表面顯示不同的濃度，同時非特異性hIgG沒有顯示明顯的變化。清洗傳感器之後，保留的Ag被洗脫並準備好用於質量分析，不含來自從100％人血清中的其它混雜材料。通過傳感器響應，我們能夠看出我們將15ng(0.18nm×3ng/mm2/nm×28mm2)的Ag傳送給質量分析物。
實施例證明了比色共振反射光學傳感器能夠提供給質譜分析的材料量的兩個極端點。此外，在比色共振反射光學傳感器系統上已利用50％的血清樣本收集了相似的ESI-MS結果。
權利要求
1.一種分析或識別一種或多種分子的方法，包括(a)使包含一種或多種分子的樣本與比色共振反射光學傳感器接觸，以將該一種或多種分子中的一種或多種固定到該比色共振反射光學傳感器上；(b)從該比色共振反射光學傳感器上洗脫該已固定的一種或多種分子；和(c)對該一種或多種分子施加質譜分析，其中對一種或多種分子進行分析或識別。
2.權利要求1的方法，其中檢測已被固定到該比色共振反射光學傳感器上的該一種或多種分子。
3.權利要求1的方法，其中對該一種或多種分子量化。
4.權利要求1的方法，其中確定該一種或多種分子的結合常數。
5.權利要求2的方法，其中確定該一種或多種分子的結合常數。
6.權利要求2的方法，其中通過峰值波長值(PWV)的偏移直接檢測已固定到該比色共振反射光學傳感器上的該一種或多種分子。
7.權利要求2的方法，其中使用標記物檢測已固定到該比色共振反射光學傳感器上的該一種或多種分子。
8.權利要求7的方法，其中還檢測峰值波長值(PWV)信號。
9.權利要求2的方法，其中檢測已固定到該比色共振反射光學傳感器上的該一種或多種分子包括使用分子質量等於、大於或小於已固定到該比色共振反射光學傳感器上的一種或多種分子的指示分子。
10.權利要求1的方法，其中通過該比色共振反射光學傳感器表面上的一種或多種結構部分將該一種或多種分子固定到該比色共振反射光學傳感器上。
11.權利要求10的方法，其中該一種或多種結構部分包括TiO、RaM Fc、抗生物素蛋白、生物素、抗體、抗體片段、核酸分子、蛋白質A、蛋白質A雜化物、蛋白質G、蛋白質G雜化物、蛋白質L、蛋白質L雜化物、高密度PVA、CHO或它們的組合。
12.權利要求2的方法，其中將比色共振反射光學傳感器偶聯到用於檢測的流動系統上。
13.一種分析或識別一種或多種分子的方法，包括(a)使包含一種或多種分子的樣本與比色共振反射光學傳感器接觸，以將所述一種或多種分子中的一種或多種固定到該比色共振反射光學傳感器上；(b)獲得沒有被固定到該比色共振反射光學傳感器上的任意分子；和(c)對沒有被固定到該比色共振反射光學傳感器上的任意分子進行質譜分析，其中對一種或多種分子進行分析或識別。
14.權利要求13的方法，其中對該一種或多種分子量化。
15.權利要求13的方法，其中確定該一種或多種分子的結合常數。
全文摘要
本發明提供一種對一種或多種分子進行檢測、量化、識別和結構分析的方法。質譜分析(MS)不是普適的檢測器，因為所有的分子不能同等地電離，這樣導致量化信息的弱信號。當材料的存在已知時，可以優化MS以識別結合成分的具體質量。比色共振反射光學傳感器提供一種通用的質量檢測器，因為幾乎所有的生物質量同等地給出比例信號。該組合方法允許選擇和/或通過結合到傳感器上的所有質量的量化進行檢測，具有根據其各自質量和結構分析來識別特定分子的能力。
文檔編號G01N33/543GK101057131SQ200580021876
公開日2007年10月17日 申請日期2005年6月28日 優先權日2004年6月28日
發明者李允中, B·林, C·威廉斯, L·梁 申請人:Sru生物系統公司