一種增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法

2024-04-16 14:40:05

1.本發明屬於生物農藥技術領域，尤其涉及一種增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法。


背景技術：

2.目前，根腐病病原較為複雜，真菌被認為是根腐病的最主要致病因素，其中鐮刀菌(fusarium spp.)所佔比例最高，其寄生性和致病力也較強，是根腐病中危害性最大的病原菌。其中尖孢鐮刀菌(fusarium oxysporum)、腐皮鐮刀菌(fusarium solani)、層出鐮刀菌(fusarium proliferatum)都能引發多作物根腐病的發生。
3.病原菌侵染寄主的首要步驟是吸附於寄主表面，鐮刀菌屬病原真菌未分化出明顯的侵染結構，而是依靠釋放某些酶類和產生降解植物防禦反應的物質和毒素達到侵染目的，其中，孢子萌發是病原菌侵染的第一步。目前，防治根腐病的發生主要依靠施用化學農藥。化學抑菌劑雖具有良好的抑菌效果，但長期重複使用化學抑菌劑使得致病菌產生了抗藥性；此外，化學抑菌劑對生態環境具有破壞性，威脅生物生命安全。因此，尋找安全環保的抑菌劑迫在眉睫。許多研究表明，植物精油具有抑制病原菌生長的潛力，目前在抑菌機理研究上已取得一定成果。植物精油是一類在植物體內廣泛存在的具有芳香氣味的次生代謝物質，其組成成分的複雜性與植物的種類、生長條件及採集部位和採收季節等密切相關。精油組成的複雜多樣性使其具有多靶標和廣譜抗菌的生物活性。中藥精油的主要成分是單萜類、倍半萜類、芳香族類、脂肪族類等低沸點的化合物。揮髮油會抑制孢子的產生、萌發和菌絲生長，從而降低病原菌的危害性。精油含有多種組成成分，因此抗菌作用不能由單一化合物的作用來完全概括。和化學農藥相比，揮髮油來源於天然植物，具有使用安全，補償藥物殘留，對人體安全不造成威脅，來源廣泛，提取工藝簡單的特點。
4.小茴香(cuminum cyminum)始載於《唐本草》，又名小懷香，茴香菜。果實作香料用，亦供藥用，根、葉、全草均可入藥。小茴香是一種非常重要的調味品，食品方面作為藥食同源的調料或製成花茶和胃散寒。小茴香精油是以小茴香為原材料，通過萃取而製得的提取物。由於揮髮油具有濃烈的香氣、低的水溶性和在可變環境中的不穩定性，且有些精油只有在高濃度下才發揮抑菌活性，所以其實際應用受到了極大的限制。納米乳劑是近些年來研究較多的一種劑型，由水相、油相、表面活性劑、助表面活性劑等成分組成，是一個均一的乳劑體系。揮髮油納米乳劑是利用納米技術將揮髮油納米化後得到的一類乳劑產品，一般小於100nm的就可稱作納米乳劑。由於納米乳的粒徑小於可見光的波長範圍，故一般看起來都是澄清透明的。納米乳化技術是一種新型藥物製劑技術，屬於納米技術的一種，由於藥物粒子達到了納米級別，如此小的粒徑使其很容易穿透病原菌細胞膜或細胞間隙而發揮抑菌活性。這種小尺寸效應是納米乳劑型有別於其他劑型的重要一點，加上粒徑變小後藥物的比表面積大幅增加，和靶蛋白的接觸面也得到增大，最終使得藥物生物利用度提高。這種小尺寸效應直接解決了很多傳統技術無法解決的難題。
5.通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：目前長期重複使用化學抑菌劑使
得致病菌產生抗藥性，且對生態環境具有破壞性，威脅生物生命安全。


技術實現要素：

6.針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法，尤其涉及一種小茴香揮髮油的納米乳劑的製備新工藝、小茴香揮髮油製備納米乳劑在製備防治鐮刀菌引發的根腐病用藥物中的應用。
7.本發明是這樣實現的，一種增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法，增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法包括：選取陰乾的小茴香種子，採用水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮髮油；分別進行表面活性劑、助表面活性劑和km值的篩選，確定表面活性劑與助表面活性劑的km值為2:1；進行小茴香精油納米乳劑的製備；最後進行小茴香精油納米乳劑的gc-ms分析檢測及穩定性測試。
8.進一步，增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法包括以下步驟：
9.步驟一，小茴香揮髮油的製備；
10.步驟二，表面活性劑與助表而活性劑質量比的篩選；
11.步驟三，小茴香精油納米乳劑的製備；
12.步驟四，小茴香精油納米乳劑的gc-ms分析檢測。
13.進一步，步驟一中的小茴香揮髮油的製備包括：
14.(1)將陰乾的小茴香種子與蒸餾水分別以1:8的比例放入10l圓底燒瓶內，採用水蒸氣蒸餾法蒸餾8h；
15.(2)將收集到的精油用無水硫酸鈉去除多餘水分，脫水到無水硫酸鈉既有結晶又有粉末為止，進行精密稱重，得小茴香揮髮油；
16.(3)將小茴香揮髮油保存於棕色瓶中，封口膜封口，放置於-20℃冰箱備用。
17.進一步，步驟二中的表面活性劑與助表而活性劑質量比的篩選包括：
18.(1)稱取表面活性劑tween 80和助表面活性劑無水乙醇，按照km分別為1:1、2:1、3:1的質量比置於燒杯中；
19.(2)在300w工作功率下，冰浴超聲波處理20min；將混合表面活性劑與小茴香揮髮油相以質量比8:2、6:4、4:6、2:8，總質量為5g進行混合；
20.(3)將混合物在室溫下靜止30min，再用5ml移液管逐漸滴加蒸餾水，邊攪拌邊滴加，反覆操作直至溶液由澄清變渾濁，且狀態不變時記錄臨界點蒸餾水的添加量，重複兩次取均值，計算組分在轉變點時的質量分數；
21.(4)分別以表面活性劑/助表面活性劑、油相、水相作為相圖的3個頂點繪製偽三元相圖，根據乳區的大小確定km值。
22.進一步，步驟三中的小茴香精油納米乳劑的製備包括：
23.(1)將吐溫80和無水乙醇按照質量比為2:1，用磁力攪拌器混合10min，混合均勻；冰浴超聲20min後室溫放置5min，備用；
24.(2)按照小茴香精油與表面活性劑2:8的質量比混合，磁力攪拌10min；再冰浴超聲30min，靜置10min；
25.(3)將溫度為25℃的多頭磁力加熱攪拌器上攪拌並逐滴加入4g蒸餾水，不斷攪拌混勻，最後冰浴超聲20min。
26.進一步，步驟四中的小茴香精油納米乳劑的gc-ms分析檢測包括：
27.將傳統工藝製備的乳劑和步驟三製備的小茴香精油納米乳劑進行gc-ms分析，採用氣象色譜儀進行檢測。其中，色譜柱：hp-5ms 30m
×
250μm
×
0.25μm。ei源電離源溫度：230℃；四級杆溫度：150℃，掃描範圍：30～500m/z；進樣口溫度：285℃，分流比10:1；進樣量：1μl；電子能量：70ev；柱溫箱升溫程序：50℃保持4min，5℃/min升溫至120℃，1℃/min升溫至180℃，10℃/min升溫至280℃保持16min；ri值根據正構烷烴連續碳c9-c25的保留時間計算得到，將化合物保留時間和質譜與nist 17.l資料庫進行數據比對，確定最終化合物。
28.本發明的另一目的在於提供一種應用所述的增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法製備得到的小茴香精油納米乳劑。
29.本發明的另一目的在於提供一種所述的小茴香精油納米乳劑在製備防治根腐病用藥物中的應用。
30.進一步，根腐病為尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、層出鐮刀菌中的任意一種或三種。
31.本發明的另一目的在於提供一種所述的小茴香精油納米乳劑在製備肥料添加劑和/或化學農藥添加劑和/或植物源農藥開發前體中的應用。
32.結合上述的技術方案和解決的技術問題，本發明所要保護的技術方案所具備的優點及積極效果為：
33.第一，針對上述現有技術存在的技術問題以及解決該問題的難度，緊密結合本發明的所要保護的技術方案以及研發過程中結果和數據等，詳細、深刻地分析本發明技術方案如何解決的技術問題，解決問題之後帶來的一些具備創造性的技術效果。具體描述如下：
34.本發明提供了一種增強小茴香揮髮油抑菌活性的納米乳劑製備工藝、降低病原真菌孢子萌發、菌絲生長和根腐病發生的方法。該工藝包括小茴香揮髮油提取、精油微乳體系建立、納米乳劑配置、植物根系灌根。本發明提供的一種防治根腐病發生的小茴香揮髮油納米乳劑，屬於植物源殺菌劑，易揮發，易分解，不汙染環境，對人畜安全。揮髮油是多種有效成分的混合物，對致病菌具有多靶標作用特效，致病菌不易產生抗藥性，可長期使用；納米乳劑比傳統工藝粒徑更小，大大減少施用量，有效降低使用成本。本發明提供的小茴香精油納米乳劑原料來源廣泛，價格低廉，製備方法簡單易行，可作為肥料添加劑或者植物源農藥開發前體，廣泛用於防治鐮刀菌屬引發的根腐病的發生。
35.另外，本發明還具有以下有益效果：
36.(1)本發明提供了小茴香揮髮油納米乳劑的製備，使得揮髮油生物活性大大增強，提高了揮髮油藥效期。
37.(2)表面活性劑(tween 80)和助表面活性劑(無水乙醇)聯用溶解小茴香揮髮油，可增加乳化劑的穩定性，與水溶液更易互溶。
38.(3)納米乳劑粒徑小於100nm，小的粒徑使得揮髮油更易穿透病原菌細胞膜，發揮抑菌效應，可大大降低化學農藥使用。
39.(4)小茴香揮髮油納米乳劑來源於天然植物，屬於生物農藥，對環境友好。
40.(5)揮髮油是多成分起效，病原菌不易產生抗性，克服了化學農藥多次使用病原菌產生抗性的現象。
41.第二，把技術方案看做一個整體或者從產品的角度，本發明所要保護的技術方案具備的技術效果和優點，具體描述如下：
42.本發明提供了一種小茴香揮髮油納米乳劑製備工藝，對人和動物安全無毒，對環境友好，且對鐮刀菌屬引發的根腐病有良好防治效果的藥劑，解決目前農業種植中大量使用化學農藥造成農產品品質和影響產業可持續發展的重大問題。
附圖說明
43.為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對本發明實施例中所需要使用的附圖做簡單的介紹，顯而易見地，下面所描述的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
44.圖1是本發明實施例提供的增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法流程圖；
45.圖2是本發明實施例提供的不同km值對小茴香納米乳劑形成的影響圖；
46.圖3是本發明實施例提供的小茴香揮髮油傳統工藝和為小茴香揮髮油納米乳劑的gc-ms分析結果示意圖；其中，eo：小茴香精油，feo-ne：小茴香精油納米乳劑，feo-t：小茴香精油傳統乳劑；
47.圖4是本發明實施例提供的不同條件對小茴香納米乳劑穩定性的影響圖；
48.圖5是本發明實施例提供的傳統工藝和新工藝製備的小茴香精油電鏡照片；其中，圖a、c為傳統工藝製備的小茴香精油電鏡照片及曲線圖，圖b、d為新工藝製備的小茴香精油電鏡照片及曲線圖；
49.圖6是本發明實施例提供的傳統工藝和新工藝製備的小茴香精油溶劑粒徑圖；其中，圖(a)為傳統工藝製備的小茴香精油溶劑粒徑圖，圖(b)為新工藝製備的小茴香精油溶劑粒徑圖。
具體實施方式
50.為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
51.針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法，下面結合附圖對本發明作詳細的描述。
52.為了使本領域技術人員充分了解本發明如何具體實現，該部分是對權利要求技術方案進行展開說明的解釋說明實施例。
53.如圖1所示，本發明實施例提供的增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法包括以下步驟：
54.s101，選取陰乾的小茴香種子，採用水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮髮油；
55.s102，分別進行表面活性劑、助表面活性劑和km值的篩選；
56.s103，小茴香精油納米乳劑的製備；
57.s104，小茴香精油納米乳劑的gc-ms分析檢測。
58.本發明實施例提供的小茴香揮髮油是以小茴香種子做為原料，採用水蒸氣蒸餾法製備而得。
59.本發明實施例提供的小茴香揮髮油提取製備方法包括以下步驟：
60.(1)將陰乾的小茴香種子與蒸餾水分別以1:8的比例放入10l圓底燒瓶內，採用水蒸氣蒸餾法蒸餾8h；
61.(2)將收集到的精油用無水硫酸鈉去除多餘水分，脫水到無水硫酸鈉既有結晶又有粉末為止，進行精密稱重即得小茴香揮髮油。保存於棕色瓶中，封口膜封口，放置於-20℃冰箱備用。
62.本發明實施例提供的小茴香揮髮油用表面活性劑(tween 80)和助表面活性劑(無水乙醇)作為溶劑和分散劑，表面活性劑與助表而活性劑質量比的篩選方法包括以下步驟：
63.(1)準確稱取表面活性劑(tween 80)和助表面活性劑(無水乙醇)一定質量比(選取km分別為1:1、2:1、3:1於燒杯中；
64.(2)在300w工作功率下，冰浴超聲波處理20min，然後將混合表面活性劑與油相(小茴香揮髮油)以質量比8:2、6:4、4:6、2:8，總質量為5g進行混合；
65.(3)將混合物在室溫下靜止30min，再用5ml移液管逐漸滴加蒸餾水，邊攪拌邊滴加，反覆操作直至溶液由澄清變渾濁，且狀態不變時，記錄臨界點蒸餾水的添加量(重複兩次取均值)，計算該組分在轉變點時的質量分數；
66.(4)分別以表面活性劑/助表面活性劑、油相、水相作為相圖的3個頂點繪製偽三元相圖，根據乳區的大小來確定km值。
67.本發明實施例提供的小茴香精油納米乳劑的製備方法包括以下步驟：
68.(1)將吐溫80和無水乙醇按照質量比2:1，先用磁力攪拌器混合10min，混合均勻(肉眼觀察無分成，無絮狀)；
69.(2)冰浴超聲20min後室溫放置5min，備用(若混合表面活性劑不立即用，用保鮮膜密封，使用前再適當攪拌)；
70.(3)按照油與表面活性劑2:8的質量比混合，磁力攪拌10min，再冰浴超聲30min，靜置10min；
71.(4)溫度為25℃的多頭磁力加熱攪拌器上攪拌並逐滴加入4g蒸餾水，不斷攪拌混勻，最後冰浴超聲20min。
72.本發明製備的揮髮油納米乳劑，能達到增效、提高揮髮油抑菌活性、降低揮髮油用量、節約成本目的。本發明提供的小茴香揮髮油的製備方法簡單，所需試劑成本低，有利於大量生產，便於防治鐮刀菌屬致病菌引發的根腐病。
73.本發明的技術原理如下：
74.1.小茴香是一種非常重要的香料，氣芳香，芳香走竄，善於闢穢。揮髮油由於都是由小分子物質組成，土壤裡面易擴散。
75.2.納米乳體系由油相、水相、表面活性劑以及助表面活性劑等成分組成，其中表面活性劑其分子結構中，一端親水，一端親油，這種特殊的結構可使得體系在表面活性劑作用下，將油相溶解於水或將水相溶解於油中。
76.3.表面活性劑本身的親水親油平衡值(hlb值)和油相乳化所需的親水親油平衡值相同或相近，做出來的體系比較穩定，能使油相和水相非均勻地共為一體，而不是油相漂浮在水相上面出現分層現象。
77.4.揮髮油製備成納米乳劑之後，提高了揮髮油在水中的溶解度。
78.5.揮髮油製備成納米乳劑粒徑變小後更容易穿透病原菌細胞膜或細胞間隙，同時
比表面積大幅增加，和靶蛋白接觸面也得到增大，增強揮髮油的抑菌活性。
79.6.揮髮油為植物源提取物，且小茴香是藥食同源中藥和常用的香料，對人體無害，解決了目前常用化學農藥對人體肝腎毒性等威脅。
80.7.揮髮油易揮發，故本發明解決了化學農藥殘留降低農產品品質、威脅農業可持續發展的棘手問題。
81.為了證明本發明的技術方案的創造性和技術價值，該部分是對權利要求技術方案進行具體產品上或相關技術上的應用實施例。
82.本發明的應用實施例提供了一種應用增強小茴香揮髮油抑菌活性劑的製備方法製備得到的小茴香精油納米乳劑在製備防治根腐病用藥物中的應用；其中，根腐病為尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、層出鐮刀菌中的任意一種或三種。
83.本發明的應用實施例提供了一種小茴香精油納米乳劑在製備肥料添加劑和/或化學農藥添加劑和/或植物源農藥開發前體中的應用。
84.本發明實施例在研發或者使用過程中取得了一些積極效果，和現有技術相比的確具備很大的優勢，下面內容結合試驗過程的數據、圖表等進行描述。
85.實施例1：小茴香揮髮油的製備方法
86.將陰乾的小茴香與蒸餾水分別以1:8的比例放入10l圓底燒瓶內，採用水蒸氣蒸餾法蒸餾8h後，將收集到的精油用無水硫酸鈉去除多餘水分，脫水到無水硫酸鈉既有結晶又有粉末為止，進行精密稱重即得小茴香揮髮油。保存於棕色瓶中，封口膜封口，放置於-20℃冰箱備用。
87.實施例2：表面活性劑與助表而活性劑質量比(km值)的篩選
88.步驟1：選定表面活性劑(tween 80)和助表面活性劑(無水乙醇)，通過偽三元相圖法來確定km值；
89.步驟2：室溫下，將確定的表面活性劑和助表面活性劑按km值分別為1:1、2:1、3:1的比例混勻；
90.步驟3：混合表面活性劑與確定的油相(小茴香精油)分別按質量比8:2、6:4、4:6、2:8的比例分別混勻，然後逐滴加入蒸餾水，不斷攪拌直至溶液變渾濁，靜置30min後溶液仍呈渾濁，記錄體系的滴水量，並計算體系中各成分在轉變點時的質量分數；
91.步驟4：分別以表面活性劑/助表面活性劑、油相、水相作為相圖的3個頂點繪製偽三元相圖，根據乳區的大小來確定km值。
92.由圖2(陰影部分為納米乳區)可知，當表面活性劑與助表面活性劑之比km值為2:1時所形成的納米乳區最大。因此小茴香精油納米乳劑最佳km值為2:1。
93.實施例3：小茴香精油納米乳劑的製備
94.步驟1：室溫下，將確定的表面活性劑和助表面活性劑按km值為2:1的比例混勻於燒杯中，稱量好後在轉速為中速，溫度為25℃的多頭磁力加熱攪拌器上攪拌5min；
95.步驟2：在300w工作功率下，冰浴超聲波處理20min後室溫放置5min；
96.步驟3：然後將混合表面活性劑與確定的油相(小茴香精油)分別按質量比8:2，總質量為5g進行混勻；
97.步驟4：保鮮膜密封后放置於轉速為中速，溫度為25℃的多頭磁力加熱攪拌器上攪拌並逐滴加入4g蒸餾水，不斷攪拌混勻；
98.步驟5：冰浴超聲波處理20min，即可製成小茴香精油納米乳劑。
99.實施例4：小茴香揮髮油傳統工藝製備乳劑和納米乳劑的gc-ms分析檢測
100.傳統工藝：藥劑包括溶劑和分散劑，溶劑為dmso，用量佔揮髮油總質量的2％，分散劑為吐溫80，吐溫的用量揮髮油總質量的0.1％。將揮髮油用2％dmso和0.1％吐溫80(2-dmso-t)混懸液進行溶解。
101.將傳統工藝製備的乳劑和實施例3小茴香揮髮油納米乳劑進行gc-ms分析，採用型號為agilengt technologies 7890b-5977b氣象色譜儀進行檢測。
102.色譜柱：hp-5ms 30m
×
250μm
×
0.25μm。ei源電離源溫度：230℃；四級杆溫度：150℃，掃描範圍：30～500m/z；進樣口溫度：285℃，分流比10:1；進樣量：1μl；電子能量：70ev；柱溫箱升溫程序：50℃保持4min，5℃/min升溫至120℃，1℃/min升溫至180℃，10℃/min升溫至280℃保持16min；其中ri值根據正構烷烴連續碳(c9-c25)的保留時間計算得到，將化合物的保留時間和質譜與nist 17.l資料庫進行數據比對，並結合有關文獻，確定最終化合物，鑑定結果如圖3所示。
103.從圖3中可以看出各組分相對百分含量的大小，小茴香精油中共鑑定出28個化合物，佔精油含量的90.01％，小茴香精油裡主要鑑定出為萜烯、醚、酮類和少量酚醛類。其主成分主要有草蒿腦(40.74％)、茴香腦(40.077％)、(-)-小茴香酮(8.941％)、d-檸檬烯(7.179％)。經分析，醚類化合物是小茴香揮髮油成分的主類群，其中以草蒿腦和茴香腦為主。小茴香納米乳劑中共鑑定出25個化合物，佔精油含量的91.11％，主成分主要有草蒿腦(41.444％)、茴香腦(39.933％)、(-)-小茴香酮(9.485％)、(r)-(+)-薴烯(6.105％)等。小茴香傳統乳劑的主要成分為茴香腦(53.306％)、1,3,3-三甲基-二環[2.2.1]庚-2-酮(5.614％)等，其共有成分見韋恩圖。
[0104]
實施例5：納米乳劑穩定性測試
[0105]
(1)鹽濃度對納米乳劑穩定性的影響：取5ml納米乳劑置於4支潔淨的試管中，以室溫下的小茴香納米乳劑為對照組，其餘三組分別向其中加入氯化鈉，使氯化鈉的質量分數分別為1％、3％、5％，振蕩試管使溶解，觀察納米乳劑的變化情況並測定吸光度。
[0106]
(2)ph對納米乳劑穩定性的影響：取5ml納米乳劑置於離心管中，以室溫下的小茴香納米乳劑為對照組，用精密ph計測量對照組的ph值，然後向離心管中逐漸滴加濃度為0.1mol/l的氯化氫溶液，採用精密ph計測量體系ph值為4、5、6時納米乳劑的變化情況，測定納米乳劑乳的吸光度並計算透光率。取5ml納米乳劑置於離心管中，以室溫下的小茴香納米乳劑為對照組，然後向離心管中逐漸滴加濃度為0.1mol/l的氫氧化鈉溶液，採用精密ph計測量體系ph值為8、9時納米乳劑的變化情況，測定納米乳劑乳的吸光度並計算透光率。
[0107]
(3)低溫試驗：將製備的小茴香精油納米乳劑液封裝如玻璃瓶中，密封后置於-20℃、4℃、常溫的環境中，放置12h取樣，恢復室溫，觀察其性狀，測定納米乳劑乳的吸光度並計算透光率。
[0108]
(4)熱穩定性：將製備好的小茴香精油納米乳劑分別在25℃、30℃、40℃下加熱30min，觀察微乳是否分層，若無分層，測定加熱後的納米乳劑的吸光度，計算透光率。
[0109]
由圖4可知，小茴香納米乳劑在鹽濃度分別為1％、3％、5％時的透光率與對照組無顯著性差異，說明在此條件下小茴香納米乳劑穩定性良好；小茴香納米乳劑對照組ph為7.26，在ph為4、5、6時透光率與對照組相比顯著降低，在ph為8、9時與對照組相比無顯著差
異。說明小茴香納米乳劑在過酸條件下較不穩定，在偏鹼性條件下較穩定；在溫度分別為4℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下透光率與對照組透光率相比無顯著性差異，但是在-20℃有顯著性差異，說明小茴香精油納米乳劑在過低溫條件下不穩定，在4℃至40℃之間穩定性較好。將其處理組和對照組放置5d、10d、15d後仍澄清透明，未出現分層或藥物沉澱析出的現象，經10000r/min離心10min後仍保持澄清、透明，說明製備的小茴香納米乳劑穩定性良好。
[0110]
實施例6：小茴香精油納米乳劑與傳統小茴香精油乳劑形態觀察和粒徑分析
[0111]
透射電鏡(jem-1011，jeol，co.ltd.，tokyo，japan)下觀察乳劑粒徑形態和雷射粒度分析儀測定粒徑大小。
[0112]
按實施例2和3篩選配方製備的乳液為澄清透明的淡黃色液體，離心後外觀仍澄清透明，無絮狀沉澱和分層現象，並可用水無限稀釋，表明所製備的樣品為納米乳劑。傳統小茴香精油溶劑為渾濁的乳白色液體。
[0113]
在透射電鏡下，小茴香精油納米乳劑呈規則的球形，納米乳劑液滴分布非常均勻，沒有粘連和團聚，與用傳統小茴香精油溶劑相比顆粒較小(見圖5)。
[0114]
雷射粒度分析儀的結果顯示傳統小茴香精油溶劑平均粒徑為486.737
±
147.136nm，小茴香精油納米乳平均粒徑為28.730
±
1.372nm(見圖6)。
[0115]
實施例7：傳統工藝製備的乳劑和納米乳劑對鐮刀菌最低抑菌濃度(mic)測定
[0116]
步驟1：用1/4pdb液體培養基衝洗菌落，八層紗布過濾菌絲，用血球計數板在顯微鏡下計數，最終配置濃度為1
×
104個/毫升的孢子懸浮液。
[0117]
步驟2：將傳統工藝製備的乳劑和納米乳劑分別通過0.22μm的有機濾頭進行過濾，得到無菌濾液。
[0118]
步驟3：將傳統工藝製備的乳劑和納米乳劑分別採用二倍稀釋法進行稀釋，初始濃度為15mg/ml，通過二倍稀釋法稀釋得到一系列濃度為15～0.0146mg/ml。在96-孔板中，每個孔加入已過濾的揮髮油溶液(50μl)和真菌懸浮液(150μl)。其中，以200μl的1/4pdb溶液作為空白對照，200μl真菌懸浮液作為陽性對照。96-孔板在28℃微生物培養箱中恆溫培養36h。採用酶標儀(thermo.model:1510)在吸光度為595nm處測定每個孔的吸光度，當樣品孔吸光度與空白對照孔吸光度差值為0時視為不出現真菌生長，此時對應的揮髮油濃度值為mic值。每個處理設置8個復孔。
[0119]
表1傳統工藝製備的乳劑和納米乳劑對3種鐮刀菌最低抑菌濃度(mic)測定
[0120][0121]
註：mic是最小抑菌濃度。數據進行了8次重複，每個值代表8個數據用平均值
±
標準差進行了分析。差異用anova(方差分析)檢驗顯著性，顯著性水平為p《0.05。同一列不同字母字母表示具有顯著性差異。
[0122]
由表1結果表明，小茴香揮髮油製備成納米乳劑之後，明顯提高了抑菌效果，對尖
孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和層出鐮刀菌的抑菌效果都高於其傳統乳劑。
[0123]
實施例8：納米乳劑對盆栽三七根腐病防控作用測定
[0124]
步驟1：選取長勢一致的一年生三七幼苗(株高為10cm左右)，植株莖基部周圍土壤用注射器注入10ml孢子濃度為2*106個/ml混合的菌懸液(尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌2種菌體積比1:1)，每個處理40株；
[0125]
步驟2：製備濃度為111.11mg/ml的納米乳劑，用無菌水稀釋222倍，每棵植株莖基部澆灌10ml，空白對照為澆灌10ml無菌水；每5d澆一次；
[0126]
步驟3：三七植株放於24℃的溫室中12h光照/12h黑暗培養間中培養，觀察發病狀況並記錄數據。
[0127]
發病率(di)＝發病株數目/總株數目
×
100％；
[0128]
病情分級如下：
[0129]
0級：植株健康；
[0130]
1級：植株葉片出現病斑；
[0131]
2級：植株萎蔫；
[0132]
3級：植株死亡；
[0133]
病情指數(di)＝
×
100。
[0134]
其中，dn表示同一病情等級的植株數目，dg表示相應的病情等級，tn表示總植株數目，mg表示最高病情等級。
[0135]
步驟4：在採集三七葉片，用蒸餾水清洗掉表面汙濁，並擦乾表面水分，剪成碎片後混合，然後從中隨機稱取0.1g置於試管中，加95％乙醇丙酮(v:v＝1:1)混合溶液25ml，將試管用封口膜密封陰暗處放置24h以上，待葉片完全發白後再用酶標儀測量其光密度(在波長663、645nm處的光密度)，然後計算各樣品的葉綠素含量。
[0136]
表2揮髮油對三七接種鐮刀菌防控效果
[0137][0138]
註：每個值代表20個數據用平均值
±
標準差進行了分析。差異用anova(方差分析)檢驗顯著性，顯著性水平為p《0.05。同一列不同字母字母表示具有顯著性差異。
[0139]
以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。