一種聚乙烯醚磷酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術的製作方法

2023-09-19 20:54:05 1

一種聚乙烯醚磷酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術的製作方法
【專利摘要】一種聚乙烯醚磷酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，屬於生化分離工程【技術領域】。本發明步驟為：聚乙烯醚磷酸鹽的製備；兩相萃取藻藍蛋白；在濃縮和冷凍乾燥後獲得藻藍蛋白粉；蛋白回收率可達70～85％。該方法簡單，對螺旋藻破壁液直接使用聚乙烯醚磷酸鹽進行富集分離，簡化了純化過程的步驟，選擇性高，分離得到的藻藍蛋白的光譜純度達到A620/A280>2.5。原料可採用螺旋藻鮮藻或幹藻粉，從而提供了一種解決螺旋藻資源高值規模化利用的技術方法。
【專利說明】一種聚乙烯醚磷酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術

【技術領域】
[0001]本發明提供一種聚乙烯醚磷酸鹽的製備方法，用於從螺旋藻破壁液中萃取藻藍蛋白。屬於生化分離工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002]螺旋藻藻藍蛋白存在於螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍藻所特有的一種超分子捕光色素複合體。藻藍蛋白色澤呈明亮的藍色，顏色鮮豔，是食品、高級眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍蛋白還可以調節和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎症作用，調節人體免疫系統，增強免疫系統功能。高純度的藻藍蛋白帶有很強的螢光，製成的純天然螢光試劑，用於臨床醫學診斷，免疫化學及生物醫學工程等研究領域。
[0003]在我國，每年的螺旋藻全國總產量已達到7000噸。螺旋藻產量的三分之一用於直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當作保健品使用。螺旋藻的規模化開發和利用處於初級加工階段，還沒有深加工產品。螺旋藻中藻藍蛋白的提取還處於實驗室研究階段，沒有適合於工業化生產的好的工藝方法。目前，市場上銷售的高純度的藻藍蛋白商品都是從國外進口，價格昂貴，在應用上受到限制。
[0004]因此，開發簡便、快速的螺旋藻藻藍蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍蛋白產品純度是目前螺旋藻藻藍蛋白的規模化開發利用中亟待解決的關鍵問題。聚合物雙水相分離蛋白質具有生物相容性高，操作條件溫和，易於進行連續化操作等優點。已報導的有關製備藻類藻藍蛋白的雙水相萃取分離藻藍蛋白的專利技術，例如中國專利CN103880950A採用價格昂貴的離子液體組成聚合物-水相，增加生產成本，CN102993297A.CN101891809A等採用市售的PEG組成聚合物-水相，分離藻藍蛋白的選擇性差，需要與鹽析等其它提取手段聯合使用才能得到高純度產品，過程繁瑣。
[0005]本發明提供一種對藻藍蛋白具有特異性萃取能力的聚乙烯醚磷酸鹽，可通過兩相萃取方式從螺旋藻破壁液中直接分離純化藻藍蛋白，無需與鹽析等其它提取手段聯合使用，就能得到高純度藻藍蛋白。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種聚乙烯醚磷酸鹽的製備方法，用於雙水相萃取分離螺旋藻藻藍蛋白，獲得高純度的藻藍蛋白，應用於天然色素、保健食品和新藥的研究開發。
[0007]本發明所要解決的技術問題是提供一種聚乙烯醚磷酸鹽的製備方法，用於從螺旋藻破壁液中萃取分離藻藍蛋白。其方法簡單，快捷，成本低，分離藻藍蛋白具有較高的純度，原料既可採用新鮮螺旋藻也可採用螺旋藻乾粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍蛋白資源規模化利用的方法。
[0008]本發明的技術方案:一種聚乙烯醚磷酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，步驟為:
[0009](I)溴代聚乙烯醚的製備；(2)聚乙烯醚磷酸鹽的製備；(3)兩相萃取從螺旋藻破壁清液分離純化藻藍蛋白；(4)藻藍蛋白水溶液經濃縮和冷凍乾燥後獲得藻藍蛋白粉。
[0010]所述的方案，步驟I中，在圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇，恆壓漏鬥中裝入三溴化磷，三溴化磷與聚乙二醇的重量比為1:2?3，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時間為0.5小時，滴加完畢後，升溫至60?90°C反應5?8小時，在反應混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然後加入500?100ml 二氯甲烷，轉移至分液漏鬥中，用250ml的25%碳酸鈉水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷後得到溴代聚乙烯醚。
[0011]所述的方案，步驟2中，在上述溴代聚乙烯醚中，加入無水磷酸鹽和50%異丙醇水溶液，無水磷酸鈉與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:3?6，50%異丙醇水溶液與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:0.25?0.5，在90?120°C下反應15?24小時，加入20g活性炭攪拌2小時，過濾後將濾液在80?100°C下真空蒸餾I小時，然後在濾液中加入1000?2000ml絕對無水甲醇，過濾獲得聚乙烯醚磷酸鹽。
[0012]所述的方案，步驟3中，螺旋藻破壁清液的製備:採用水或磷酸緩衝液作提取劑，磷酸緩衝液的濃度為25?100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50?1:150，攪拌均勻後，置於-10°C?_20°C下冷凍一定時間後，37°C溶解，如此反覆凍融4-6次，融化後離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質濃度為1.0?5.6mg/ml，藻藍蛋白純度為0.5?0.72。
[0013]所述的方案，步驟3中，在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚磷酸鹽和無機鹽，聚乙烯醚磷酸鹽:無機鹽:破壁清液的重量比為0.05?0.25:0.2?0.35:1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集於上相；將含藻藍蛋白的上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚磷酸鹽和無機鹽，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.5?3.2，蛋白濃度為 3.15 ?5.6mg/ml。
[0014]所述的方案，步驟4中，將藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍乾燥後得到藻藍蛋白粉末。
[0015]本發明的有益效果:本發明與現有技術相比，主要具有以下優點:1.聚乙烯醚磷酸鹽對藻藍蛋白的萃取選擇性高，適合不同規模和場地的工業化生產要求；2.聚乙烯醚磷酸鹽可直接從螺旋藻破壁清液中萃取獲得高純度的藻藍蛋白，無需其它提取手段配合，生產成本低；3.製備藻藍蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者幹藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。

【具體實施方式】
[0016]實施實例I
[0017](I)螺旋藻破壁清液的製備
[0018]取產於江蘇東臺市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻乾粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:50，置於-20°c下冷凍4小時後，37°C融解，如此反覆凍融4次，融化後的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質濃度為1.0mg/ml，藻藍蛋白純度A620ZA280為0.72mg/ml。
[0019](2)溴代聚乙烯醚的製備
[0020]在500ml的圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇PEG-1000 (購自海安石油化工廠)，PEG-1000的平均分子量為100g每摩爾，恆壓漏鬥中裝入30g三溴化磷(購自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時間為0.5小時，滴加完畢後，升溫至60°C反應5小時，在反應混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，加入500ml 二氯甲烷(購自淄博市臨淄天德精細化工研究所)，將反應混合物轉移至分液漏鬥中，用250ml的25%碳酸鈉(購自協成化工原料)水溶液洗滌三次，收集下層液體蒸餾去除二氯甲烷，獲得溴代聚乙烯醚。
[0021](3)聚乙烯醚磷酸鹽的製備
[0022]在1500ml三角燒瓶中放入10g溴代聚乙烯醚，加入30g無水磷酸鈉(購自重慶川東化工有限公司)和400ml的50%異丙醇(購自崑山市誠信化輕材料有限公司)水溶液，在90°C下反應15小時，加入20g活性炭(購自泉州市興邦活性炭有限公司)攪拌2小時，過濾後將濾液在80°C下真空蒸餾I小時，然後在濾液中加入100ml絕對無水甲醇，用布氏漏鬥抽濾獲得聚乙烯醚磷酸鹽。
[0023](4)兩相萃取
[0024]在1g螺旋藻破壁清液中加入0.5g聚乙烯醚磷酸鹽和0.2g無水硫酸鈉(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集於上相，上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚磷酸鹽和硫酸鈉，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.5，蛋白濃度為3.15mg/ml。
[0025](5)冷凍乾燥獲得藻藍蛋白粉
[0026]將前述步驟(4)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍乾燥後得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A62tlA28tl為2.5，蛋白回收率為80%。
[0027]實施例2
[0028](I)螺旋藻破壁液的製備
[0029]取產於江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用50mmol/L磷酸緩衝液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置於-101:下冷凍4小時後，371:融解，如此反覆凍融5次。融化後的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質濃度為3.lmg/ml，藻藍蛋白純度A62(l/A28(l為0.5。
[0030](2)溴代聚乙烯醚的製備
[0031]在100ml的圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇PEG-3000 (購自海安石油化工廠)，PEG-3000的平均分子量為3000g每摩爾，恆壓漏鬥中裝入50g三溴化磷(購自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時間為0.5小時，滴加完畢後，升溫至80°C反應7小時，在反應混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然後在反應混合物中加入800ml 二氯甲烷(購自淄博市臨淄天德精細化工研究所)，轉移至分液漏鬥中，用250ml的25%碳酸鈉(購自協成化工原料)水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷後得到溴代聚乙烯醚。
[0032](3)聚乙烯醚磷酸鹽的製備
[0033]在2000ml三角燒瓶中，加入10g溴代聚乙烯醚、20g無水磷酸鉀(購自重慶川東化工有限公司)、250ml的50%異丙醇(購自崑山市誠信化輕材料有限公司)水溶液，在110°c下反應20小時，然後在反應物中加入20g活性炭(購自泉州市興邦活性炭有限公司)攪拌2小時，過濾後將濾液在90°C下真空蒸餾I小時，然後在濾液中加入1500ml絕對無水甲醇，用布氏漏鬥抽濾獲得聚乙烯醚磷酸鹽。
[0034](4)兩相萃取
[0035]在1g螺旋藻破壁清液中加入1.5g聚乙烯醚磷酸鹽和3g無水硫酸銨(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集於上相，將上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚磷酸鹽和硫酸銨，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.1，蛋白濃度為4.8mg/ml。
[0036](5)冷凍乾燥獲得藻藍蛋白粉
[0037]將前述步驟(4)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍乾燥後得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A62tlA28tlS 3.1，蛋白回收率65%。
[0038]實施例3
[0039](I)螺旋藻破壁液的製備
[0040]取產於雲南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用lOOmmol/L磷酸緩衝液作提取齊U，螺旋藻與去離子水的固液比為1:150，置於-201:下冷凍4小時後，371:融解，如此反覆凍融6次。融化後的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍蛋白純度A62Q/A28Q為0.72，破壁液蛋白質濃度為5.6mg/ml mg/ml。
[0041](2)溴代聚乙烯醚的製備
[0042]在2000ml的圓底燒瓶中，放入10g聚乙二醇PEG-4000 (購自海安石油化工廠)，PEG-4000的平均分子量為4000g每摩爾，恆壓漏鬥中裝入30g三溴化磷(購自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時間為0.5小時，滴加完畢後，升溫至90°C反應8小時，在反應混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然後在反應混合物中加入100ml 二氯甲烷(購自淄博市臨淄天德精細化工研究所)，轉移至分液漏鬥中，用250ml的25 %碳酸鈉水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷後得到溴代聚乙烯醚。
[0043](3)聚乙烯醚磷酸鹽的製備
[0044]在3000ml三角燒瓶中，加入10g溴代聚乙烯醚、15g無水磷酸鉀(購自重慶川東化工有限公司)、200ml的50%異丙醇(購自崑山市誠信化輕材料有限公司)水溶液，在120°C下反應24小時，然後在反應物中加入20g活性炭(購自泉州市興邦活性炭有限公司)攪拌2小時，過濾後將濾液在100°C下真空蒸餾I小時，然後在濾液中加入2000ml絕對無水甲醇，用布氏漏鬥抽濾獲得聚乙烯醚磷酸鹽。
[0045](4)兩相萃取
[0046]在1g螺旋藻破壁清液中加入2.5g聚乙烯醚磷酸鹽和3.5g無水硫酸鎂(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集於上相，將上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚磷酸鹽和硫酸鎂，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.2，蛋白濃度為5.6mg/ml。
[0047](5)冷凍乾燥獲得藻藍蛋白粉
[0048]將前述步驟(4)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍乾燥後得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A62tlA28tlS 2.8，蛋白回收率75%。
【權利要求】
1.一種聚乙烯醚磷酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，其特徵在於步驟為:聚乙烯醚磷酸鹽的製備；兩相萃取藻藍蛋白；經濃縮和冷凍乾燥後獲得藻藍蛋白粉。 (1)聚乙烯醚磷酸鹽的製備:在圓底燒瓶中放入1008聚乙二醇，恆壓漏鬥中裝入三溴化磷，三溴化磷與聚乙二醇的重量比為1:2?3，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時間為0.5小時，滴加完畢後，升溫至60?90 V反應5?8小時，在反應混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然後在反應混合物中加入500?100001二氯甲烷，轉移至分液漏鬥中，用250「的25%碳酸鈉水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷後得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入無水磷酸鹽和50%異丙醇水溶液，無水磷酸鹽與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:3?6，50%異丙醇水溶液與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:0.25?0.5，在90?1201下反應15?24小時，然後在反應物中加入208活性炭攪拌2小時，過濾後將濾液在80?1001下真空蒸餾1小時，然後在濾液中加入1000?200001絕對無水甲醇，過濾獲得聚乙烯醚磷酸鹽。 (2)兩相萃取:在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚磷酸鹽和無機鹽，聚乙烯醚磷酸鹽:無機鹽:破壁清液的重量比為0.05?0.25:0.2?0.35: 1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集於上相。 (3)將上述含藻藍蛋白的上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚磷酸鹽和無機鹽，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.5?3.2，蛋白濃度為3.15?5.611^/1111。 (4)將藻藍蛋白水溶液在601下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍乾燥後得到藻藍蛋白粉末。
2.根據權利要求1所述的聚乙烯醚磷酸鹽的製備方法，其特徵在於採用的聚乙二醇的平均分子量可以為500、1000、2000、3000、4000。
3.根據權利要求1所述的聚乙烯醚磷酸鹽的製備方法，其特徵在於採用的無水磷酸鹽可以為無水磷酸鈉、無水磷酸鉀。
4.根據權利要求1所述的兩相萃取方法，其特徵在於，用於成相的無機鹽可以為無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸銨、無水氯化鈉、無水磷酸鉀。
【文檔編號】C08G65/00GK104387469SQ201410683691
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月24日 優先權日:2014年11月24日
【發明者】宋佳玉, 張杜炎, 田雪, 陳燕, 原亞敏, 王峰 申請人:江南大學