天山雪蓮sikDh2基因在培育抗寒植物中的應用的製作方法

2023-09-19 16:30:20

專利名稱：天山雪蓮sikDh2基因在培育抗寒植物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到sikDh2基因，構建組成型植物表達載體，轉化植物，並對抗寒效果進行評 價，增加植物的抗寒性能。
背景技術：
低溫是限制植物地理分布及生物產量的重要因素，也是危害農業生產的主要自然 災害之一。低溫往往造成植物細胞脫水，破壞膜脂雙分子層表面的水合保護體系，造成膜脂 雙分子層間距的減小，引起膜融合以及膜結構的嚴重破壞。脫水素(Dehydrins)羧基末端含有富含Lys基序的K-區段(consensus sequence :EKKGIMDKIKEKLPG)，許多脫水素包含由6個以上絲氨酸組成的S-區段 (S-segment),大部分也包含一個或多個 Y-區段(Y-segment) (consensus sequence {V/ T}DEYGNP)。在胺基酸終止區和K-區段之間也有一些保守序列，包括甘氨酸和蘇氨酸 序列，它們的特點都是高度親水，可以在極性胺基酸之間替代。K-區段形成α-螺旋， 它可以穩定大分子和亞細胞結構(Emergence of a biochemical roleof a family of plant dehydration proteins. Physiol Plant 97 795~80)、(Structural motifs in LEA proteins ofhigher plants. In :Close TJ and Bray EA(eds)Response of Plants to Cellular Dehydration DuringEnvironmental Stress. Rockville American Society of Plant Physiologists, pp 91-103)。S-區段可以作為磷酸化位點，與核定位信號肽相結 合參與運輸(The maize abscisic acid-responsive protein Rab 17 islocated in the nucleus and interacts with nuclear localization signals. Plant Cell 6:351—360)、 (Expression,tissue distribution and subcellular localization of dehydrin TAS14 in salt-stressed tomato plants. Plant MolBiol 26:1921-1934)。免疫定位表明脫水 素不僅存在於細胞核，而且在胞質中也存在(Nuclear mdcytoplasmic localisation of maize embryo and aleurone dehydrin. Protoplasma 177 :87_94)。Y-區段序列與分子 伴侶部分核酸結合序列同源(Identification Of nucleotide-binding regions in the chaperonin proteinsGroEL and GroES· Nature 366:279-282)。不同的脫水素其K-區段、Y-區段的數目，以及其它序列的特徵都是不一樣的。植物基因組中包含許多的脫水素序列，然而到目前為止，僅個別幾個物種中的被確定為冷調節脫水素，其它的脫水素都是在種子發育過程中受乾旱和鹽脅迫表達的。冷調 節脫水素在大小，保守區段的種類上是不同的，不是一種類型。Y-區段變化較大，有的有，有 的沒有。脫水素能與細胞的膜結構相互作用，包括細胞質膜和細胞內膜，表明脫水素應該具有穩定膜結構的作用(Close TJ. Dehydrins :a commonalty in the response of plants todehydration and low temperature[J]. Physl Plant，1997，100 :291_296)。脫 水素κ片段形成的α「螺旋能使脫水素與部分變性蛋白質的疏水位點相結合，起到了類似於分子伴侶的作用，阻止蛋白質的進一步變性；還可以替代水分子的位置，其分子內羥基 與磷脂分子中的極性鍵形成氫鍵，使膜脂的狀態仍類似於未脫水狀態；脫水素的α 「螺旋 能與低溫下細胞內形成的冰晶表面緊密結合，阻止冰晶的進一步擴大，防止由於水分凝固 而對細胞造成的傷害(Wisniewski M, Webb R, Balsamo R, Close T J, Yu X_M，Griffith Μ. Purification, immunolocalization, cryoprotective, and antifreeze activity of PCA60 :A dehydrinfrom peach(Prunuspersica L. )[J].Physl Plant,1999,105 600-608)。由於脫水素具有高度的水合能力，它與膜脂結合能夠阻止細胞內水分的過多流 失，維持膜結構的水合保護體系，防止膜脂雙分子層間距的減小，進而阻止膜融合以及生物 膜結構的破壞(Allagulova C R, Gimalov F R, Shakirova F M, Vakhitov V A. The plant dehydrins structure and putative functions[J] · Biochemistry，2003，68 :945_951)。低溫、乾旱等逆境會破壞植物細胞自由基代謝的平衡，增加活性氧自由基的產生， 進而引發或加劇膜脂的過氧化，造成細胞膜系統的損傷。有證據表明，脫水素能夠清除植物 iffllfi^ W^tifi S(Hara Μ, Fujinaga Μ, Kuboi Τ. Radical scavenging gactivity and oxidative modification of citrusDehydrin[J]. Plant Physiol Biochem,2004,42 657-662)(Hara M,Terashima S,Fukaya T,Kuboi T. Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco[J]. Planta，2003，217 :290_298.)。脫水素在植物體內表現為對生物膜和蛋白質結構的穩定作用，從而減小逆境和脫 7jcilfMX^tii^MM^J ^W (Close T J. Dehydrins =Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins.Physio Plant,1996,97 (4) :795_803)。作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)，又名天 山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長於海拔2400 4100m的高山草甸、高山冰磧 石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那裡氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫 3 5°C，最低月平均溫-19 -21 °C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。天山雪蓮經過長期的自然選擇，形成了穩定的特殊結構、功能和遺傳基因，產生了 適應極端環境條件下的生理和生化機制，這種與環境相適應的機制，與一般的耐冷、抗寒應 答性的適應機制不同，主要表現在其低溫條件下能夠正常的生長發育，而一般的抗寒性植 物在相應的低溫條件下，生長發育受到抑制。近年來植物抗寒基因工程得到迅速發展，並研究出了多種轉基因抗寒植物，為培 育抗寒植物開闢了新途徑。雪蓮生活在極端環境中，是一種極好的抗寒基因的資源，至今， 國內外對雪蓮脫水素的研究還未見文獻報導。利用這種具有特色稀有植物，從中篩選、克隆 出與抗寒直接相關的基因，揭示雪蓮適應性的機制，研究其遺傳基礎，充分發掘其潛在的基 因資源，並將其用於農作物品種改良，具有巨大的學術和經濟價值。

發明內容
本發明的一個目的是為植物抗寒育種提供有價值的冷誘導脫水素基因sikDh2，其 發明的目還在於構建植物表達載體pBin438-sikDh2，在轉基因植物中得到表達，提高轉基 因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲得抗 (耐)低溫能力明顯增強的植物。
本發明的目的是通過以下過程和方法實現的本發明所述的從天山雪蓮中克隆sikDh2基因，其序列為1。本發明的從天山雪蓮中克隆sikDh2基因的過程如下以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用DPl其序列為2和DP2其序列 為3為引物進行擴增，得到目的基因；sikDh2基因植物表達載體構建構建植物表達載體PBin438-sikDh2 ；
利用上述基因構建植物表達載體，通過農桿菌介導法遺傳轉化獲得抗寒轉基因植 物以未轉化菸草植株葉片為對照，轉基因株系在模擬抗寒脅迫8小時後，與未轉基 因株系相比，葉片相對電導率下降48. 6%。當溫度高於_2°C時，轉基因菸草和未轉基因植 株菸草葉片的電導率並沒有明顯差別，但是當溫度達到_4°C時，未轉基因菸草葉片的電導 率明顯高於轉基因菸草葉片，說明在-4°C時，未轉基因菸草葉片細胞已經不能耐受低溫，細 胞膜破裂，內容物溢出，導致電導率上升，而轉基因菸草葉片細胞能夠耐受低溫，電導率並 未出現大的變化。MDA是膜脂過氧化的產物之一，其含量可以表示脂質過氧化的程度。轉基因植株被 鑑定後，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養基上生根後。菸草經不同低溫溫度處理，MDA 的含量均有所提高。不同處理的菸草MDA含量上升幅度依次為21.9%、24.9% ；12.9%, 18.5%。從結果中分析得出，不管是0°C，_4 °C低溫處理8hr，野生型菸草比轉基因菸草的 MDA含量增加大，說明野生型植株膜質的過氧化程度相對較高。原因可能在於轉基因菸草降 低了脂質過氧化的程度。本發明不僅首次得到天山雪蓮抗寒相關冷誘導脫水素基因sikDh2，而且將其構建 成的植物表達載體，在轉基因植物中研究了該基因在提高植物耐低溫性能中的重要功能。 這對於揭示雪蓮的抗寒機理，豐富植物抗寒分子生物學理論，提高植物的耐低溫能力，具有 重要的意義。


圖 1 是天山雪蓮 sikDh2 基因 PCR 擴增圖 Figl :sikDh2gene PCR amplified圖 2 是 pUCm-sikDh2PCR 鑑定圖 Fig2 :PCR identification of pUCm_sikDh2圖 3 是 sikDh2 進化分析圖 Fig3 =Phylogenetic analysis sikDh2圖 4 是 pBin438-sikDh2PCR 鑑定 Fig4 :PCR identification ofpBin438-sikDh2圖 5 是 pBin438-sikDh2 酶切鑑定 Fig5 =Restriction enzyme digestion identification of pBin438_sikDh2 6 ^ 轉 it GV3101PCR 'M 定 Fig6 :PCR identification of pBin438-sikDh2-GV3101圖 7 是轉化菸草 PCR 檢測 Fig7 :PCR identification of transformed tobacco圖 8 是轉基因菸草 RT-PCR 分析 Fig8 :RT-PCR analysis on transgenic tobacco圖9是sikDh2基因轉化菸草葉片相對電導率的測定Fig9 =Relative conductivity of tobacco leaves圖10是不同溫度處理對菸草MDA含量的影響Fig. 10 =Effect of temperaturetreatment onthe content of MDA in tobacco 圖11是植物表達載體是pBin438-sikDh2的構建流程 1 中1 陰性對照；2 :sikDh2 ；M =Marker圖 2 中1 :pUCm-sikDh2 ；2 陰性對照；M =Marker圖 4 中1-4 :pBin438-sikDh2 ；5 陰性對照；M =Marker圖 5 中1,2 :pBin438-sikDh2 ；M =Marker圖6 中1 陰性對照；2-5 :pBin438-sikDh2-GV3101 ；M =Marker圖 7 中1 陰性對照；2-6 :sikDh2 轉化菸草；M =Marker圖 8 中1 陰性對照；2，3 :sikDh2 轉化菸草；M =Marker
具體實施例方式實驗所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為上海生工公司生產；LA PCRTM in vitro CloningKit 購自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 連接酶(T4-DNA ligase)、 Marker、TRNzol總RNA提取試劑購於TIANGEN公司；BamH I、Sal I等限制性內切酶為 Fermentas公司原裝；IPTG、X-gal及抗生素、植物激素購自上海Sangon公司；其他試劑及 配製MS培養基的各種試劑均為國產分析純。具體實驗操作依據[美]J.薩姆布魯克D. W.拉 塞爾的《分子克隆實驗指南》。實施例1 天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫單克隆保存的甘油管於IOmlLB液體培養基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振蕩培養過夜。蘸取菌液於LB固體培養基(Cm 50 μ g/ml)平板上劃線培 養，37°C暗培養12-16hr。挑取單克隆於20mlLB液體培養基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振蕩培養14hr，提取質粒，具體方法如下1)將菌液分裝於1. 5ml Ep管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400ml STE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；3)沉澱用150 μ L鹼裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配製的300 μ L鹼裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L鹼裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min ；離心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清於另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min ；離心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清於另一新Ep管，加入兩倍體積無水乙醇約為850 μ L，-20°C放置 IOmin ；離心(12000rpm, 5min)；
8)棄去上清，沉澱用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹乾後溶於40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C溫育 30min。實施例2 從天山雪蓮中克隆到sikDh2基因以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用DPl其序列為2和DP2其序列 為3為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照。
DP1 為25' GGATCC AAAATG GCACAACAC GGAT 3'BamHIDP2 為35' GTCGAC ATGAAATGATTA CTT CTGACC CC 3'SalIPCR 反應體系(20 μ 1)為IOXPCRBuffer2. 0 μ 1dNTPs (各 2. 5mM)0. 5 μ 1MgC12(25mM)Ι.ΟμΙ上遊引物(25μ Μ)0· 5 μ 1下遊引物(25μ Μ)0. 5μ 1模板DNA (ddH20)0. 5 μ 1Taq DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1) 0. 3 μ 1ddH2014. 7 μ 1Total20. 0μ 1PCR 反應程序為94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，57°C復性 30s，72°C延伸 45s， 30cycles ；72°C延伸 7min ；4°C保溫。PCR反應結束後，產物經濃度為1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，使用上海生工 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為 sikDh2。如圖1、2所示。實施例3 構建sikDh2基因植物表達載體構建植物表達載體PBin438-sikDh2。用BamHI/Sall分別雙酶切植物表達載體 pBin438，獲得載體片段。回收目的基因片段和載體片段。將目的基因片段與載體片段進行 體外連接，經鑑定正確的重組質粒分別命名為pBin438-sikDh2。在本實施方案中，我們選用 菸草作為轉基因植物材料，也可選用其它植物作為轉基因材料。如圖4、5所示。在本實施方案中，sikDh2基因和pBin438構成一個植物表達載體，用於植物的轉 化。根據本發明的這一實施方案，構建所選用的植物表達載體除了 pBin438之外，還可以選 用其他植物表達載體。實施例4 農桿菌的轉化4. 1農桿菌感受態的製備1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個單菌落於LB液體培養基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，於 28°C、200rpm 振蕩培養 48hr ；2)取 200ul 菌液於 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen (50ug/ml)的 LB 液體培養基中活化培養至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分裝菌液於1. 5ml離心管，於4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農桿菌細 胞；4)將沉澱的農桿菌用750ul預冷的0. 05mol/LCaCl2重懸，4 °C，8000rpm離心 5min ；5)棄上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細胞，保存於_70°C。4. 2植物表達載體轉化根癌農桿菌GV3101 (凍融法)1)吸取10 μ 1上述重組載體質粒(約0. 5 μ /g μ 1)，與75 μ 1 GV3101感受態細胞 輕輕混勻，冰浴30min，然後液氮凍存5min ；2)迅速置於37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液體 LB 培養基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振蕩培養 5hr ；4)將上述培養液於6000rpm離心5min，收集農桿菌細胞，棄去500 μ 1液體培養 基，剩餘100 μ 1重懸細胞；5)將菌液塗布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固體 LB 培 養基平板上，28°C培養24-48hr。4. 3陽性克隆篩選挑取若干單菌落，進行菌落PCR，將篩選出的陽性克隆命名為 pBin438-sikDh2-GV3101。在本實施方案中，植物表達載體導入農桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領域技 術人員非常熟悉的技術操作，不是本發明的關鍵。通過PCR檢測陽性的農桿菌菌株，用於轉 化植物。如圖6所示。實施例5 菸草遺傳轉化及再生本發明中對於靶植物的轉化方法不是關鍵，可以使用本領域技術人員所熟悉的各 種不同的轉化技術將重組DNA序列導入待轉化的靶植物細胞。這些方法包括但不僅限於農 桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉澱法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用於將轉化細胞再生成植株的方法，可以使用適合於其他靶植物。最好 使被轉化的序列穩定的整合到靶植物細胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟 失。另外，用於轉化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環形或其它重組載體的形式如人工染 色體的形式存在。5. 1農桿菌浸染液的製備1)從-70°c保存的含有PBin438-sikDh2-GV3101的GV3101農桿菌甘油管中挑取 菌塊，接種於5ml附加有Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml, Gen 50 μ g/ml的LB液體培養基中， 28 0C，200rpm 振蕩培養約 30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液體培養基(Kan 50 μ g/ml，Ri f 50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀釋，28°C，200rpm 振蕩培養約 4hr ；3)活化的菌液培養至OD6tltl = 0. 4-0. 6時，即為轉化用的浸染液。5. 2 浸染1)超淨工作檯上將浸染液倒入無菌培養皿中，將無菌菸草葉片剪成Icm2大小的方塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；2)取出菸草葉片，用濾紙吸乾淨葉盤上附著的菌液；3)在共培養基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一張無菌濾紙，將浸染過的葉 盤均勻地擺放在濾紙上；在26°C暗培養條件下共培養2-3天。5. 3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導將共培養過的菸草葉盤轉移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的菸草誘導選擇培養基上，葉盤傷口充分接觸培養基。每15-20天轉接一次，轉接
1-2次以後，葉盤邊緣逐漸產生淡綠色、緻密的愈傷組織，繼續培養直至誘導出叢生芽。5. 4轉化植株的生根培養和移栽待叢生芽長至2-3cm左右時，將其切下轉接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的菸草生根選擇培養基上進行生根培養。轉基因菸草15天左右開始有根生成，待根系發達時，將根系生長良好的轉化植 株，去除封口膜，室溫環境中進行煉苗7天左右，然後用水洗淨培養基，將苗轉入基質(蛭 石腐質土 =2 1)中，26°C，16hr 40 μ mol · πΓ2 · s—1光照，70%相對溼度條件下培養，前
2-3天需遮陰、避光、保溼。實施例6 轉基因菸草的分子檢測6. 1轉基因菸草的PCR鑑定6. 1. 1 菸草 DNA 的提取(SDS 法)1)取0. Ig新鮮葉片，用玻棒在1. 5ml離心管內充分研磨；2)加入400 μ 1提取緩衝液，充分混勻，12000rpm離心5min ；3)小心吸取300 μ 1上清液，加入300 μ 1異丙醇，室溫沉澱20min, 12000rpm離心 lOmin，收集沉澱；4)將沉澱充分風乾，加400 μ 1 TE溶解沉澱；5)加入400 μ 1氯仿/異戊醇(24/1)，充分混勻，靜置20min，12000rpm離心 IOmin ；6)小心吸取上清，加入40μ 1 3Μ NaAC(pH5. 2)，800 μ 1無水乙醇，-20°C沉澱過 夜；7)4°C，12000rpm 離心 15min，棄上清；8) 70%酒精洗滌兩次，吹乾後用30 μ 1 ddH20溶解。6. 1.2轉基因菸草的PCR鑑定以提取的轉化基因的菸草DNA為模板，用DPl其序列為2和DP2其序列為 3為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照，擴增體系如實施 例2。如圖7所示。6. 2轉基因菸草的RT-PCR檢測6. 2. 1待檢測植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑑定的轉基因菸草和未轉化的菸草 總 RNA 1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其餘所使用的槍頭、離心管均 使用0. 1 %的DEPC處理，高壓滅菌；
2)取植物幼嫩葉片約0. Ig於研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混勻，室溫放置3-5min。4) 10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩 混勻；5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管後，加入600 μ 1預冷 的異丙醇，於_20°C沉澱30min ；6) IOOOOrpm,4°C離心IOmin後，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉澱，即為 總 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉澱2次後，吸乾液體，吹乾後加入30 μ 1 ddH20 (DEPC處理)溶解，保存於_20°C備用。6. 2. 2cDNA 第一鏈的合成在DEPC 處理的 0. 2ml 離心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1μ l,ddH20 5μ 1後，在70°C水浴5min後迅速置於冰上lmin。然後在離心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反轉錄酶 0. 5 μ 1，42°C lhr,95°C 5min 後，冷卻至 4°C。7. 2. 3cDNA第二鏈的合成及擴增在PCR反應管中加入cDNA第一鏈反應產物1μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下遊引物(25ymol)各 0.5 μ 1，ddH20 補足至 20 μ 1，反應條件同實施例2。如圖8所示。實施例7轉基因植株的模擬寒害處理及葉片質膜透性測定轉基因植株被鑑定後，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養基上生根後。植株成 活後選取生長一致的苗(5-7葉期)，進行模擬寒害處理。分別用打孔器從葉片中打取小圓 片測定葉片質膜透性。如圖9所示。實施例8 轉基因植株的模擬寒害處理葉片的MDA含量測定轉基因植株被鑑定後，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養基上生根後。MDA是膜 脂過氧化的產物之一，其含量可以表示脂質過氧化的程度。菸草經不同低溫溫度處理，MDA 的含量均有所提高。不同處理的菸草MDA含量上升幅度依次為21.9%、24.9% ；12.9%, 18.5%。從結果中分析得出，不管是0°C，_4 °C低溫處理8hr，野生型菸草比轉基因菸草的 MDA含量增加大，說明野生型植株膜質的過氧化程度相對較高。原因可能在於轉基因菸草降 低了脂質過氧化的程度。如圖10所示。序列表石河子大學天山雪蓮sikDh2基因在培育抗寒植物中的應用31360DNA 天山雪蓮(Saurrea. involucrata Kar. et Kir.)
5，UTP(1). . . (9)CDS(10)…(339)3，UTP(340). . . (360)1Translation of DNAMAN2(10-360)Universal codeTotal amino acid number : 110，MW = 12162Max ORF starts at M pos 3 (nay be DNA pos 10) for 110M(330bases)，MW = 116921 ggatccaaa atg gca caa cac gga tea gga gag cag tac gtg aag gag ggt cac cac ggt1MET Ala Gln His Gly Ser Gly Glu Gln Tyr Val Lys Glu Gly His His Gly70 80 90100 110 12061 aca gac aag tat gtc cgc aat cca ttt cag ate acc cca gta ggt caa gac gtc gga ggt21 Hir Asp Lys Tyr Val Arg Asn Rro Phe Gln lie Hir Pro Val Gly Gln Asp Val Gly Gly130 140 150 160 170 180121 acc gga acc acc gtt caa acg gga gcc get ggt act cac ggc cat gaa gga get ggg aaa41 Hir Gly Hir Hir Val Gln Ihr Gly Ala Ala Gly Hir His Gly His Glu Gly Ala Gly Lys190 200 210 220 230 240181 ggt gtg gtg gag cag ate aag gag aag tta cct ggt ggt gat aat ggt gtc gcc gat gac61 Gly Val Val Glu Gln lie Lys Glu Lys Leu Rro Gly Gly Asp Asn Gly Val Ala Asp Asp250 260 270 280 290 300241 cac aag get gca acc acc acc ggt gat cat ggt gtc gcc gat gga cat aag aag aag gga81 His Lys Ala Ala Ihr Hir Ihr Gly Asp His Gly Val Ala Asp Gly His Lys Lys Lys Gly310 320 330 340 350 360301 gtg atg gag aag ata aag gag aag ttg cca ggg ggt cag aag taa tea ttt cat gtc gac101 Val MET Glu Lys MET Lys Glu Lys Leu Rro Gly Gly Gln Lys * * *225DNA人工序列2ggatccaaaatggcacaacacggat329DNA
人工序列3gtcgacatgaaatgattacttctgacccc.
權利要求
一種從天山雪蓮中克隆sikDh2基因，其特徵在於該基因編碼區全長336bp，其序列為1，編碼111個胺基酸，5』非編碼區3bp，3』非編碼區9bp。利用DNAMAN軟體對其進行分析，發現其不含有信號肽及跨膜區。
2.一種利用上述基因sikDh2基因構建的植物表達載體。
3.一種從天山雪蓮中克隆序列為1的sikDh2基因的用途，其特徵在於利用上述 基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗寒轉基因植物。
全文摘要
本發明涉及一種天山雪蓮sikDh2基因在培育抗寒植物中的應用，本發明從天山雪蓮中克隆sikDh2基因，利用上述基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗寒轉基因植物。本發明從天山雪蓮中克隆sikDh2基因，並在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲得抗低溫能力明顯增強的植物。從天山雪蓮中篩選、克隆出與抗寒直接相關的基因，揭示雪蓮低溫適應性的機制，研究其遺傳基礎，充分發掘其潛在的基因資源，並將其用於農作物品種改良，具有重要的學術和經濟價值。
文檔編號C12N15/84GK101818155SQ20091011359
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者劉紅玲, 張煜星, 王愛英, 祝建波 申請人:石河子大學