一種提高棉花生物學產量的分子育種方法

2023-09-19 13:42:45

專利名稱：一種提高棉花生物學產量的分子育種方法
技術領域：
本發明涉及一種提高棉花生物學產量的分子育種方法，屬於生物技術領域。更具體的說，本發明涉及攜帶棉花蔗糖合酶CDNA的轉化載體和轉化菌株，以及製備具有提高生物量和/或種子產量的轉基因植物的方法。背景技術：
蔗糖合酶普遍存在於微管植物中並且催化可逆反應蔗糖+ 二磷酸尿苷二磷酸尿苷葡萄糖+果糖。儘管反應是可逆的，但普遍認為蔗糖合酶的主要功能是分解蔗糖，為多糖的合成提供前體，如為細胞壁合成提供底物和合成澱粉(Mccollum等人，1988，Journal of the American Society for Horticultural Science 113，399 403)。由於蔗糖合酶具有分解和合成蔗糖的雙重屬性，因此在碳代謝中處於核心地位。其反應底物(蔗糖)和產物 (二磷酸尿苷葡萄糖)均涉及碳的分配與傳導。由於在蔗糖代謝中的核心作用，蔗糖合酶在植物中得到了廣泛的研究(Koch等人，1996，Journal of Experimental Botany 47，1179 1185)。它首先由 Leloir 禾口 Cardini 發現在小麥胚芽中催化一個可逆的蔗糖剪切反應(Leloir和Cardini，1953，Journal of the American Chemical Society 75，6084 6084)。然後 Turner 和 Turner 提出了蔗糖合酶可能為澱粉的生物合成提供底物(Turner和Turner，1957，Australian Journal of Biological Sciences 10，302 305)。Delmer承擔了第一個綠豆中蔗糖合酶的純化和定性工作，揭示了蔗糖合酶是一個同源四聚體，並且每個亞基約為94kD (Delmer, 1972, Journal of Biological Chemistry 247，3822 38 )。動力學數據顯示二磷酸尿苷是蔗糖合酶最好的底物。從那時起，來源於各種植物的蔗糖合酶基因被克隆、作圖以及測序；同時它們的蛋白被純化。Nolte利用免疫標記在玉米和柑橘中清楚的證明了蔗糖合酶存在於所有被檢測韌皮組織的伴胞內，與中脈組織中的一樣。這些細胞直接參與蔗糖的裝卸(Nolte等人，1993， Plant Physiology 101，899 905)。之後的研究工作也顯示了蔗糖合酶存在於粘附在篩管壁的細胞質薄膜層上(Wachter等人，2003，Plant Physiology 133，10 1037)。撇開蔗糖合酶已知的在呼吸作用中的功能，這些結果暗示了蔗糖合酶在蔗糖從外質體裝載時能量需求中起作用，還有澱粉儲存和胼胝質生物合成中起作用。前人在棉花中利用免疫定位的方法證明了蔗糖合酶蛋白高水平的存在於發育著的珠心組織中；鄰近珠被中；維管束中；還有快速伸長的外表皮毛，也就是開始發育的棉纖維中(Nolte等人，1995, Plant Physiology 109，1285 1四3)。在授粉前的表皮層中幾乎沒有免疫標記存在。而授粉當天，蔗糖合酶蛋白就以一個非常快的速度在新形成的表皮毛，珠心細胞以及維管束中被檢測到。授粉後一天，標記水平持續增加3飛倍。這一點清楚的證明了蔗糖合酶在棉花種子和表皮毛起始發育時的差異分布，從而得出這個酶可能在蔗糖輸入和細胞壁生物合成中均起著重要作用。此外，研究表明玉米i突變體中籽粒嚴重皺縮的表型是由於蔗糖合酶47嚴重影響胚乳發育所造成的(Chourey和Nelson，1979，Genetics 91，317 325)。馬鈴薯種蔗糖合酶的抑制則導致了塊莖中澱粉含量的減少以及整個塊莖幹重的下降(Zrermer等人，1995，Plant Journal 7，97 107)。水稻基因組至少含有3個基因編碼蔗糖合酶，3種同工酶的基因表達都與籽粒發育密切相關(Wang和Kao，1999，Plant Cell Physiology 40，800 807)。 在反義表達蔗糖合酶的胡蘿蔔植株中，不僅葉片和根出現顯著變小的表型，最低酶活甚至導致了最小株型的產生(Tang和Sturm，1999，Plant Cell 11，177 189)。對柑橘內蔗糖合酶基因的研究表明在果實發育過程中，CitSUSA的mRNA表達水平呈上升趨勢。從而證明CYi5Z/『S4可能在果實發育過程中起作用(Akira等人，2002，Journal of Experimental Botany 53，6廣71)。這些前人的研究結果均表明蔗糖合酶在果實發育和形成中發揮了一定功能，暗示了蔗糖合酶對產量形成的貢獻。近代轉基因技術研究發現菸草中上調表達棉花蔗糖合酶基因可以影響株高生長並且最終提高生物量(Coleman 等人，2006，Plant Biotechnology Journal 4，87 101)。 類似的結果還在楊樹中發現，高的轉基因蔗糖合酶活性與增加的纖維素含量緊密相關並且使得木質部次生壁細胞得到增厚(Coleman等人，2009，Proceedings of the National Academy of Sciences 106，13118 13123)。鷹嘴豆中的研究進一步表明種子產量與發育著的子葉中的蔗糖合酶活性直接相關(Turner等人，2009，Crop Science 49，62廣627)。這些結果更進一步表明了蔗糖合酶在植物產量形成中發揮了重要作用，通過轉基因技術獲得高產作物的目的是可以實現的。棉花是世界重要的經濟作物，棉纖維同時也是世界上最長的單細胞，為研究細胞發育及伸長提供了良好的模型。棉花棉花中至少存在三種完全不同的蔗糖合酶，Ruan構建了登陸號為U73588 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的蔗糖合酶基因的反義載體，並導入棉花，獲得了纖維和種子發育受到嚴重抑制的轉基因後代(Ruan等人，2003，Plant Cell 15，952、64)。隨後的研究表明種子發育受阻是由於胚乳中蔗糖合酶活性嚴重受到抑制造成的(Ruan等人，2008，Functional Plant Biology 35，382 393)。然而棉花中其他類別的蔗糖合酶還沒有深入的研究報導，對於過量表達產生的影響更是較少涉及。而棉花產量育種一直以來都是育種工作中的重點，同時長期以來也和品質育種難以兼顧。因此，需要利用分子生物學手段和反向遺傳手段進一步研究蔗糖合酶在植物體內的作用機制，以尋求提高作物品質和產量的技術措施。三、技術方案技術問題
本發明的目的是提供攜帶棉花蔗糖合酶cDNA的轉化載體。利用分子生物學手段和反向遺傳手段將蔗糖合酶導入植物體內以提高作物品質和產量，獲得包含攜有該蔗糖合酶 cDNA載體的高產轉基因植物。技術內容
本發明所述一種提高棉花生物學產量的分子育種方法，是將棉花蔗糖合酶基因必 SUSAl cDNA，其序為專利號ZL200710019341. 3中的SEQ ID NO. 1的編碼區和pBI121載體利用VmI和^amHl酶切後連接，構
建成具有啟動子和終止子，能夠成功在植物體內表達的轉化載體，獲得含有棉花蔗糖合酶基因偽SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA ；再將含有棉花蔗糖合酶基因偽SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA引入到植物中，獲得植株生物量和種子產量顯著提高的棉花新材料。
所述的含有棉花蔗糖合酶基因偽SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA是通過使用農桿菌介導或基因槍或花粉管通道方法引入到植物中的。含有棉花蔗糖合酶基因偽SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA使用農桿菌介導引入到植物中的方法，包括以下步驟
1)植物載體的農桿菌轉化採用凍融法，將1yg含有濃度200 ng / yL棉花蔗糖合酶基因偽SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA加入200 μ L感受態農桿菌菌株 LBA4404中，冰上放置30 min後在液氮中速凍1 min，立即置37°C水浴直至融化，加液體LB 培養數小時後，離心重懸，固體LB培養，挑取單克隆用於擴繁侵染；
2)農桿菌介導的植物遺傳轉化種子經過表面消毒後培養出無菌苗，將無菌苗的下胚軸切成小段用含有目的基因轉化載體的農桿菌菌液侵染，共培養兩天後進行愈傷誘導，待愈傷組織塊長到直徑20mm大小後轉入胚性愈傷誘導培養基中進行胚性愈傷的誘導，誘導出的胚性愈傷組織轉入分化培養基中進一步分化成胚狀體，將長出子葉和幼根的小苗插入相同的培養基中，進一步生根和長大成苗；
3)再生植株的嫁接胚性愈傷或者再生植株在無菌條件下取樣提取DNA進行PCR檢測，檢測結果為陽性的轉基因植株在溫室嫁接，採用海島棉(Mossypiwn barbadense)海 71M作為砧木，劈接法將轉基因再生植株嫁接到砧木苗上，保溼待成活後逐步進行適應性鍛鍊；
4)轉基因植株的檢測再生植株通過PCR檢測抗性基因/^i-U和啟動子-目的基因， 經過自交後獲得的轉基因後代通過卡那黴素篩選結合PCR檢測驗證陽性植株，同時對轉基因植株進行Southern雜交檢測，以驗證目的基因是否已經整合進基因組並且穩定遺傳，經過驗證的轉基因植株即為獲得的植株生物量和種子產量顯著提高的棉花新材料。有益效果本發明的優點表現在
(1)本發明所涉及的蔗糖合酶與棉纖維的分化和次生壁加厚密切相關(Amor等人， 1995, Proceedings of the National Academy of Sciences 92,9353^9357), ^WX^Tft 子發育也有著顯著的影響(Ruan等人，2008，Functional Plant Biology 35，382 393)。該酶在碳代謝循環中處於核心地位，控制著碳源的分配和庫強度變化(Haigler等人，2001， Plant Molecular Biology 47，四 51)。因此，過量表達該基因理論上可以加速代謝循環， 增加植物乾物質積累，從而提高生物量。(2)農桿菌介導的轉基因方法為轉基因研究奠定了堅實的基礎。(3)構建植物過表達載體對棉花進行轉化研究，已獲得生物量顯著高於對照的轉基因植株，對提高植物產量有一定幫助，同時有助於打破棉花品質產量負相關，有望同步改良產量和品質性狀。四

通過下面的詳細描述並結合附圖，將更清楚的理解本發明的上述和其他目的、特徵和其他優點，其中
圖1顯示過量表達必SUSAl載體35S-SA構建結構圖。示T-DNA插入區段。圖2顯示正義植物表達載體的構建與驗證電泳圖。M 分子量Marker，1 :pGEM_T Easy- Gh 5Z/『S47 克隆載體質粒，2 I 早酶切 pGEM-T Easy- Gh 5Z/『S47 克隆載體，3 I和雙酶切fesy- Gh 克隆載體，箭頭所示為回收的目的片段，4 歷/^III酶切重組轉化載體驗證。圖3顯示棉花轉35S-SA再生植株的⑶S染色和PCR檢測。M、P、C分別為分子量 Marker、質粒陽性對照和受體陰性對照；1_7為轉基因植株。圖4顯示轉基因植株後代種子的卡那黴素篩選。a為WO受體植株種子，b為陽性的Tl代轉基因植株種子，C為從轉基因Tl代中分離出的陰性植株種子。圖5顯示轉正義偽SUSAl基因Southern驗證圖。P代表質粒雜交陽性對照；C代表受體植株DNA雜交陰性對照；4，6，16，13，15，9，6-1，17，21，11，28，對，27，27-1代表轉基
因株系編號。圖6顯示篩選得到的五個棉花正義轉基因T3代純系植株的Gh SUSAl表達量情況。WO表示未轉基因的受體品種對照，必表示過量表達必基因的株系， Gh 表示抑制表達必基因的兩個株系，作為負對照。圖7顯示不同轉基因棉花株系在苗期和鈴期的整株生物量變化。其中苗期表示四片真葉時期，鈴期表示第一個花蕾出現的時期，轉基因株系編號同圖6中的株系。以上均為溫室可控條件下測量所得。圖8顯示過表達必SUSAl最高的株系9與對照相比的苗期生長表型差異。圖9顯示不同轉基因棉花株系幼苗中蔗糖合酶酶活含量變化。轉基因株系編號同圖6中的株系。圖10顯示不同轉基因棉花株系葉片中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量變化。轉基因株系編號同圖6中的株系。五具體實施例方式
為了達到這些目的，本發明的發明人取得了以下結果根據克隆得到的棉花蔗糖合酶基因序列(見ZL200710019341.3)構建了適合植物轉化的攜帶有所述克隆的二元載體，和將該載體轉化入陸地棉，進一步篩選的轉基因棉花在生物量方面有了顯著提高。因此，在一個方面，本發明提供了用於轉化植物的攜帶有所述棉花力分仰如 )蔗糖合酶cDNA (.Gh SUSAl)的二元載體(圖1)。所述植物轉化載體是二元載體，其能夠在植物中穩定表達感興趣的外源基因。在pBI121載體中，本發明涉及的必序列定位在CAMV35S啟動子和NOS終止子之間。本領域技術人員應該理解，可以使用任何其他植物轉化載體來代替PBI121載體。根據另一個方面，本發明提供了在二元載體上攜帶有必SUSAl cDNA的轉基因陸地豐帛(Gossypium Airsu turn )。所述二元載體可以通過使用農桿菌介導或基因槍或花粉管通道等方法而引入到植物中。在本發明的實施方法中，農桿菌介導法用於轉化棉花。除了棉花外，還可以將本發明所涉及的蔗糖合酶基因引入到任何適合具有提高的生物量或種子產量的植物中。本發明針對棉花蔗糖合酶基因cDNA的轉化載體，如果使用該載體進行轉化則使得植物能夠提高生物量，因此，本發明能夠有效地用於高產植物的生產。通過以下實施例能夠更好的理解本發明，提供以下實施例是為了更好的說明本發明，而不能解釋為對本發明的限制。
實施例1 過量植物表達載體的構建
設計特異引物 Primer 1 (Forward 5' CACGGACCGATTGCCTCA 3' , Reverse 5' TCATCCTCGCAATCAACCAGA 3』)通過反轉錄PCR (RT-PCR)技術在陸地棉72；35 (見專利號 ZL200710019341. 3)中擴增得到 cDNA 全長(見專利 ZL200710019341. 3 中 SEQ ID NO. 1)，包含必5Z/『S47基因完整的開放閱讀框。設計弓丨物Primer 2 (Forward 5' GCTCTAGACGGACCGATTGCCTCA 3，，Reverse 5' CGGGATCCATCATCACTGGCCAAGGG 3』)，分別含有限制性內切酶X^ i Baffl/ 接頭，在陸地棉7235中擴增得到必SUSAl cDNA全長後將該擴增產物連接到pGEM_T fesy克隆載體 (Promega)上，形成pGEM-T Easy- Gh 5Z/5M7載體。將重組克隆載體分別用X/w I和酶切，回收小片段，獲得目的產物片段；同時將PBI121載體(一種傳統的植物雙元表達載體， 其啟動子為35S啟動子)也用X^ I和Bail進行雙酶切，回收大片段。將目的片段與回收的 PBI121酶切產物進行連接就將正義片段插入35S啟動子和Gtt？之間，構建成了含完整ORF 框的正義融合植物表達載體35S-SA(35S啟動子驅動的必5Z/『S47過量表達載體)。見圖1。 其中RB為T-DNA右邊界重複，P-M權為胭脂鹼合成酶基因啟動子，MTII為新黴素磷酸轉移酶基因，rX-NOS為胭脂鹼合成酶基因終止子，P-35S為CaMV 35S啟動子，GUS為⑶S報告基因，LB為T-DNA左邊界重複。圖2泳道3所示為I和feaH I酶切後的pGEM_T Easy-Gh 5Z/『S47克隆載體，箭頭所示較小的片段即為回收的目的片段，與相同酶切後的 ΡΒΙ121載體連接即構建成35S-SA正義表達載體，該基因插入35S啟動子與G依之間並且與GUS融合。泳道4為Hind III酶切構建好的35S-SA載體。mtHind III酶切後獲得包含 35S啟動子和654 bp部分偽5Z/『S47的片段，即為圖上介於100(T2000 bp的片段，證明載體構建成功。同時測序結果也表明該載體構建成功，再次驗證了必5Z/『S47正義片段已經正確插入植物表達載體中，可以用於棉花轉基因。實施例2 -.Gh SUSAl過量植物表達載體的棉花轉化
植物載體的農桿菌轉化採用凍融法，將1 Pg含有濃度200 ng / PL棉花蔗糖合酶基因Gh SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體!35S-SA加入200 μ L感受態農桿菌菌株LBA4404 中，冰上放置30 min後在液氮中速凍1 min，立即置37°C水浴直至融化，加液體LB培養數小時後，離心重懸，固體LB培養，挑取單克隆用於擴繁侵染。農桿菌介導的植物遺傳轉化種子經過表面消毒後培養出無菌苗，將無菌苗的下胚軸切成小段用含有目的基因轉化載體的農桿菌菌液侵染，共培養兩天後進行愈傷誘導， 待愈傷組織塊長到直徑20mm大小後轉入胚性愈傷誘導培養基中進行胚性愈傷的誘導，誘導出的胚性愈傷組織轉入分化培養基中進一步分化成胚狀體，將長出子葉和幼根的小苗插入相同的培養基中，進一步生根和長大成苗。對獲得的轉基因愈傷進行GUS染色，陽性愈傷繼續培養獲得轉基因再生植株。對獲得的大量轉基因再生植株分別用似/J特異引物I^rimer 3 (Forward 5' GAGGCTATTCGGCTATGACTG 3， ， Reverse 5' TAGAAGGCGATGCGCTGCGA 3，)和啟動子 目的基因特異引物 Primer 4 (Forward 5' CACAATCCCACTATCCTTCG 3，，Reverse 5' CCACCAGTGTCGGGCAAA 3')進行PCR檢測，結合抗性愈傷的⑶S染色結果，三者檢測均為陽性 (圖3)的轉基因TO代幼苗嫁接到砧木海島棉海 YIAiGossypium力ar如ife/^eX從中國農科院棉花研究所國家種質中期庫購買引進，中期庫庫號210054;國家庫統一編號ZM70074) 上，獲得了轉正義蔗糖合酶必5Z/『S47的TO轉基因植株並收到種子。將TO代種子在大田種成Tl代株行，分單株提取葉片DNA進行NPT-II和啟動子目的基因的PCR檢測，兩者都為陽性的植株我們認為是轉基因植株，按單株自交收種獲得T2代，部分種子送海南加代，獲得T3代種子。利用含500 mg Γ1卡那黴素的苗培養基對T2和T3代轉基因種子進行卡那檢測，每個單株檢測30粒種子，全部表現為卡那抗性的初步判定為轉基因純系，否則為雜合， 如圖4所示。實施例3 ,Gh SUSAl過量植物表達載體的轉基因植株Southern檢測
將擴增回收好的MT-//片段(500 ng以上)稀釋到16 μ L，用parafilm膜封口後在沸水中加熱10 min，迅速置於碎冰中2 min以上。4°C短暫離心後，置碎冰中加入DIG-High Prime (試劑盒第1管)4 μ L0用吸頭反覆吹吸混勻，37°C溫浴至少16 h。反應結束後加入2 μ L 0. 2 M EDTA (pH 8. 0)以終止反應。標好的探針用QIAGEN (德國)的QIA quick Nucleotide Removal Kit進行純化。轉基因植株拷貝數分析採用Southern雜交分析常規方法(Sambrook and Russell，2001)。具體操作步驟及試劑參見《分子克隆》(第二版)。採用外源MT-IT基因為探針，DNA總量加大到70 yg，雜交溫度調整為37°C。雜交結果如圖 5所示，證明GhSUSAl基因已整合進棉花基因組，拷貝數最多的株系含有6個拷貝。實施例4 ,Gh SUSAl過量表達T3株系表達量檢測
RNA提取採用改進的CTAB酸酚法(蔣建雄和張天真，2003，棉花學報15，166 167)，為去除RNA中殘留的DNA，用無RNase的Dnase I (TaKaRa,大連)對所提取的RNA進行消化。 總RNA質量檢測採用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳和0擬60/0擬80、0D260/0D230比值的測定。吸光值的測定使用核酸蛋白分析儀(Nucleic Acid and Protein Analyzer, DU640, Beckman Coulter，USA)。cDNA 第一鏈的合成。設計 6 5Z/『S47 特異引物 Primer 5 (Forward 5， TGAGTGATCGGTCAAAGCC 3，，Reverse 5' CGGTCTGGTCAGGGTGGTA 3，)，進行 6 SUSAl 轉錄產物的Q-PCR定量檢測，檢測儀器為Bio-RAD iCycIer iQ5 (BIO-RAD，USA)，PCR產物檢測採用 SYBR Green I fluorescence dye (Invitrogen，USA)。為校正用於 RT-PCR 反應的模板量，以一對專一擴增棉花組成型表達基因權7 a (Acc. No. AJ223969)的引物進行平行PCR 反應作為內對照。其引物序列為 Primer 6 (Forward 5，AGACCACCAAGTACTACTGCAC 3，， Reverse 5' CCACCAATCTTGTACACATCC 3，)。反應體系為 25 μ L。Q-PCR 程序為95°C 10 min,95°C 10 sec,56°C 20 sec，72°C 30 sec，40個循環，72°C 10 min，最後運行熔解程序。 Q-PCR反應結束後，與定量PCR儀相連的計算機會自動收集每個樣品孔的螢光信號，並根據我們人為設定螢光域值計算出的每個樣品孔的Ct值。然後根據目的基因和內參基因標準品的拷貝數與其相對應的Ct值來分別繪製目的基因和內參基因a的標準曲線，並考察標準曲線的線性關係和斜率。每個樣品均重複3管。對於每一個待測樣品，根據其Ct值我們可以分別計算出其相對表達量(Livak and Schmittgen, 2001,Methods 25，402 408)。計算公式如下
目的基因的相對表達量=rf、而ACt = Q-; 結果
顯示相比於對照和表達量顯著下降的兩個反義轉基因株系，所得的五個正義蔗糖合酶轉基因株系表達量均明顯高於對照表達量(圖6)。證明該轉化載體至少在這五個轉基因株系中是有效地提高了 Gh SUSAl表達水平的。實施例5 轉基因植株生物量檢測
對表達量升高的五個正義轉基因株系與對照進行苗期和鈴期生物量測定。苗期在四片真葉時期取樣，鈴期在第一個花蕾出現時取樣，將植株烘乾至恆重，測定其乾物質重。結果顯示五個過表達株系的植株乾物質重在苗期和鈴期均有所增加(圖7)，其中以株系9表型最為明顯(圖8)。實施例6 蔗糖合酶酶活水平測定
參考前人方法(Ruan等人，2003，Plant Cell 15，952 964)稍作改進測定蔗糖合酶酶活，將樣品液氮研磨成粉狀，取大約0.5 g到2 mL管中，加1.5 mL冰預冷的提取液(50 mM Na2HPO4 pH 8. 0,1 mM EDTA，25 mM抗壞血酸，5 mM DTT, 20 mM β-me，10%甘油，1% PEG6000, 0.1 mM PMSF, 1 μ g/mL E64)(3:l v/w)，勻漿，冰上靜置，12，000 g離心5 min，上清即為粗酶液。過4 mL Sephadex G_25 column柱(Pharmacia)去鹽，用不含PEG的提取液進行預平衡。取100 μ L去鹽後酶液用Bradford法定量(Bradford，1976)，BSA做標線。取一定量酶液在Pipes-KOH緩衝液中與蔗糖和UDP反應。不加UDP的反應物設為對照，反應條件為 25°C反應30 min，反應結束後加等體積TTC溶液混勻，40°C反應8 min，離心後取0. 2 mL上清在酶標儀495 nm處測定OD值。作梯度果糖與TTC溶液反應標線，定量終產物。發現五個過表達轉基因株系蔗糖合酶酶活水平均有所升高，其中以株系9酶活增加量最大(圖9)。實施例7 可溶性糖含量測定
稱取0.2 g樣品，放置於研缽中，加液氮研磨成粉狀，轉移至10 mL管，加4 mL 80%乙醇，80°C水浴5-10 min，離心取上清；沉澱用2 mL 50%乙醇以相同方法處理，離心取上清； 最後沉澱加2 mL超純水沸水浴10 min，離心，合併三次上清；加等體積氯仿抽提，離心分離上清。然後用旋轉蒸發儀進行濃縮乾燥，旋幹後用50%乙腈重新定容，於4°C保存備用。 採用高效液相色譜(HPLC)示差折光檢測法測定樣品中的低聚糖含量(Xiang等人，2008， Food Chemistry 11，215 219)。上樣前樣品過0.45 μ m的微孔濾膜。色譜條件色譜柱為 Sugar-D colunnft (4. 6 mmX 250 mm, 5 Mm, Nacalai Tesque Inc. , Japan);流動相為 75% 乙腈(乙腈水=75 25) (v/v);流速1.0 mL/min ；柱溫40°C;進樣量40 μ 。經HPLC分析， 根據各種糖標樣的標準曲線，計算出樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。結果發現必5^幼7 過表達株系葉片中果糖，葡萄糖和蔗糖均有不同程度的增加(圖10)，因而總糖含量有所增加，暗示了 Gh SUSAl過量表達增加了植物體內的碳代謝，從而有利於多糖物質的合成。
權利要求
1.一種提高棉花生物學產量的分子育種方法，是將棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA, 其序為專利號ZL200710019;341. 3中的SEQ ID NO. 1的編碼區和pBI121載體利用XbaI和BamH酶切後連接，構建成具有啟動子和終止子，能夠成功在植物體內表達的轉化載體，即獲得含有棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA ；將含有棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA引入到植物中，獲得植株生物量和種子產量顯著提高的棉花新材料。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，權利要求1所述的含有棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA是通過使用農桿菌介導或基因槍或花粉管通道方法引入到植物中的。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中含有棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA使用農桿菌介導引入到植物中的方法，包括以下步驟1)植物載體的農桿菌轉化採用凍融法，將1μ g含有濃度200 ng / μ L的權利要求 1所述棉花蔗糖合酶基因Gh SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體35S-SA加入200 μ L感受態農桿菌菌株LBA4404中，冰上放置30 min後在液氮中速凍1 min，立即置37°C水浴直至融化，加液體LB培養數小時後，離心重懸，固體LB培養，挑取單克隆用於擴繁侵染；2)農桿菌介導的植物遺傳轉化種子經過表面消毒後培養出無菌苗，將無菌苗的下胚軸切成小段用含有目的基因轉化載體的農桿菌菌液侵染，共培養兩天後進行愈傷誘導，待愈傷組織塊長到直徑20mm大小後轉入胚性愈傷誘導培養基中進行胚性愈傷的誘導，誘導出的胚性愈傷組織轉入分化培養基中進一步分化成胚狀體，將長出子葉和幼根的小苗插入相同的培養基中，進一步生根和長大成苗；3)再生植株的嫁接胚性愈傷或者再生植株在無菌條件下取樣提取DNA進行PCR檢測，檢測結果為陽性的轉基因植株在溫室嫁接，採用海島棉(Gossypium barbadense)海 7124作為砧木，劈接法將轉基因再生植株嫁接到砧木苗上，保溼待成活後逐步進行適應性鍛鍊；4)轉基因植株的檢測再生植株通過PCR檢測抗性基因npt-if和啟動子-目的基因， 經過自交後獲得的轉基因後代通過卡那黴素篩選結合PCR檢測驗證陽性植株，同時對轉基因植株進行Southern雜交檢測，以驗證目的基因是否已經整合進基因組並且穩定遺傳，經過驗證的轉基因植株即為獲得的植株生物量和種子產量顯著提高的棉花新材料。
4.權利要求1所述含有棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA的重組雙元正義表達載體 35S-SA。
5.權利要求1所述含有棉花蔗糖合酶基因( SUSAl cDNA重組雙元正義表達載體 35S-SA的應用。
全文摘要
本發明涉及一種提高棉花生物學產量的分子育種方法，屬於生物技術領域。利用棉花蔗糖合酶基因GhSUSA1的cDNA序列構建了植物過量表達載體，並且轉化棉花獲得了轉基因後代。本發明公開了攜帶有該蔗糖合酶cDNA的植物轉化載體以及包含該載體的轉基因植物。使用該載體製備的轉基因陸地棉生長速度超過野生型受體品種，大大提高了植株的生物量和種子產量。因此，使用該轉基因材料，可進一步用於生產選育高生物量和種子產量的棉花新品種。
文檔編號C12N15/52GK102206672SQ201110081698
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者張天真, 蔣彥婕, 郭旺珍 申請人:南京農業大學