用於雞蛋溯源的微衛星引物、其試劑盒及應用的製作方法
2023-09-11 16:26:55
專利名稱：用於雞蛋溯源的微衛星引物、其試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及用於雞蛋溯源的微衛星引物、其試劑盒及應用。
背景技術：
雞蛋因其價格便宜、蛋白質含量高、品質好等特點，是人們日常生活中必不可少的食物之一。尤其是我國這樣的人口大國，雞蛋消費量非常高，但如何保障雞蛋的安全就成了一個棘手的問題，近年來三聚氰胺蛋、假雞蛋等事件更是給雞蛋安全帶來問題，在這種情形下，雞蛋產品的溯源勢在必行。目前雞蛋的普遍溯源流程由雞場、加工包裝廠和銷售物流3個可追溯環節組成，可追溯信息包括蛋雞孵化信息、蛋雞養殖過程中與安全和品質相關的信息、蛋雞產蛋信息、雞蛋產後粗加工處理控制信息及雞蛋物流銷售信息等。適合雞蛋標識的主要為條形碼技 術。在眾多條型碼中，EAN-128碼應用比較廣泛，EAN-128碼是根據EAN/UCC-128碼標準將信息表示為條碼符號，具有唯一性、通用性、完整性、緊密性及高可靠度等特性。由於其字符集大，密度高，所表示的信息可包含生產過程中的一些可變信息，如生產日期、批號等，實現了信息的快速、準確獲取與傳輸。消費者能夠獲知產蛋日期、養殖者、養殖基地、產品等級、檢測指標等屬性，但其信息的可靠性卻無從驗證。微衛星DNA，又被稱作短串連重複或簡單重複序列，每單元長度在I 6bp之間，是首尾相連組成的串聯重複序列。微衛星多態性分析在畜禽遺傳多樣性評估，品種資源的分類、保存和利用方面發揮著重要作用。此外，還可以利用微衛星多態性進行親子鑑定，即以多個微衛星座位在群體中的等位基因的頻率為基礎，計算排除概率得出。目前隨著生物信息學技術的發展和應用使得基於DNA的可追溯成為可能，尤其是畜禽個體本身「遺傳條形碼」的優越性不可改變，是畜禽產品溯源的終極解決方案。目前，應用微衛星DNA技術對雞蛋進行分子溯源的方法還未有報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於雞蛋溯源的微衛星引物。本發明另一目的是提供一種含有上述引物的檢測試劑盒。本發明再一目的是提供一種雞蛋溯源的檢測方法。本發明又一目的是提供上述微衛星引物或試劑盒在判斷雞蛋或蛋雞遺傳關係中的應用。本發明提供用於雞蛋溯源的微衛星引物，其包括為Seq No ID I和2、Seq No ID3 和 4、Seq No ID 5 和 6、Seq No ID 7 和 8、Seq No ID 9 和 10、Seq No ID 11 和 12、SeqNo ID 13 和 14、Seq No ID 15 和 16、SeqNo ID 17 和 18、Seq No ID 19 和 20 所示的核苷酸序列中的一對或幾對。進一步，本發明還提供含有上述引物的試劑盒。該試劑盒還包括以下試劑中的一種或幾種PCR緩衝液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本發明利用雞蛋和蛋雞樣品的微衛星多態分析，分析它們的遺傳關係。具體包括以下步驟I)分別提取蛋雞DNA和雞蛋DNA ；2)利用上述微衛星引物，分別以步驟I)中的蛋雞DNA和雞蛋DNA為模板進行PCR擴增；3)將PCR產物進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，讀取膠圖判定基因型之後，使用Dispan軟體計算奈氏遺傳距離(Ds),判斷其遺傳關係。其中，所述雞蛋DNA從雞蛋卵黃膜中提取得到，所述蛋雞DNA為從蛋雞血液中提取得到。 所述PCR擴增的反應條件為95°C預變性5min ;95°C變性30s，62_65°C退火30s，72°C延伸 30s，30-35 個循環;72°C延伸 7min。本發明的有益效果I)本發明的檢測方法操作簡單、快捷、費用低廉、準確度高，並可實現自動化的直接檢測。2)本發明方法開發檢測試劑盒的檢測結果可靠、穩定、準確，為突發雞蛋安全事件的相關責任認定提供判斷依據。3)本發明從卵黃膜提取基因組DNA，基因組DNA含量達到74. 91±24. OOng/μ 1，將分子生物學方法用於鑑別真假雞蛋，並且實現從雞蛋到蛋雞的生物學追溯，可有效監控市售雞蛋的質量安全。
圖I為四組樣品的因子相關分析圖，A代表來自中國農業大學實驗雞場的白來航未受精雞蛋代表中國農業大學實驗雞場的白來航蛋雞血樣；C代表北京某祖代雞場的白來航蛋雞血樣；D代表北京某祖代雞場的洛島紅蛋雞血樣。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。隨機選取以下待測樣品A 40枚白來航未受精雞蛋，來自中國農業大學實驗雞場；B 30份白來航蛋雞血樣，來自中國農業大學實驗雞場；C 30份白來航蛋雞血樣，北京某祖代雞場；D 30份洛島紅蛋雞血樣，北京某祖代雞場。實施例II、卵黃膜的分離從雞蛋的鈍端將雞蛋磕開，用蛋清蛋黃分離器分離出蛋黃，用O. 9%的生理鹽水衝洗卵黃，將卵黃放入培養皿，劃開卵黃膜，再用O. 9%的生理鹽水衝洗，分離出卵黃膜，之後放入一個新的培養皿中，再用O. 9%的生理鹽水清洗，如此再重複，直至把蛋黃清洗乾淨，只剩下純白色的卵黃膜。將處理後的卵黃膜放入2ml離心管中並在_20°C保存。2、蛋雞血液樣品的米集每隻雞翅下靜脈採血1ml，置於盛有O. 3ml左右A⑶抗凝劑(I. 72%檸檬酸鈉、I. 47%葡萄糖、O. 48%檸檬酸)的離心管中，混勻放入_20°C保存。3、DNA 的提取I)在裝有卵黃膜或20 μ I A⑶抗凝血的離心管中加入700 μ I抗凝血裂解液(IOOmM Tris · Hcl (ΡΗ8. O), IOOmM EDTA (ΡΗ8. 0)，1%SDS)及 20 μ I 10% 蛋白酶 K，55。C水浴消化4小時。2)加入等體積的Tris飽和酚，緩慢搖勻15分鐘，12000rpm離心12分鐘，用槍頭 吸取上清液至乾淨的離心管中。3)重複2)的步驟4)加入等體積的酚仿，緩慢搖勻15分鐘，12000rpm離心12分鐘，用槍頭吸取上清
液至乾淨的離心管中。5)加入等體積的三氯甲烷，緩慢搖勻15分鐘，12000rpm離心12分鐘，用槍頭吸取
上清液至乾淨的離心管中。6)加入1000 μ I無水乙醇，輕搖離心管，靜置一段時間。7 )8000rpm離心5分鐘，可見離心管底部有白色沉澱，棄上清，加600 μ I 70%乙醇，
繼續離心5分鐘，棄上清。8)真空乾燥2分鐘,加20 μ I去離子水,待室溫溶解後放入_20°C保存。檢測DNA濃度 60ng/ μ I ο4、PCR反應擴增10個微衛星座位分布於雞的不同染色體上，多態性特異性強且相互之間不存在連鎖關係。微衛星引物由上海生工合成。引物的序列及反應條件見表1、2。表I微衛星信息
權利要求
1.用於雞蛋溯源的微衛星引物，其包括SeqNo ID I和2、Seq No ID 3和4、Seq NoID 5和 6、Seq No ID 7和 8、Seq No ID 9和 10、Seq No ID 11和 12、Seq No ID 13和 14、Seq No ID 15和16、Seq No ID 17和18、Seq No ID 19和20所示的核苷酸序列中的一對或幾對。
2.含有權利要求I所述引物的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，還包括以下試劑中的一種或幾種PCR緩衝液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。
4.一種雞蛋溯源的檢測方法，包括以下步驟 1)分別提取蛋雞DNA和雞蛋DNA； 2)利用權利要求I所述微衛星引物，分別以步驟I)中的蛋雞DNA和雞蛋DNA為模板進行PCR擴增； 3)將PCR產物進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，分析基因型，判斷雞蛋與蛋雞的遺傳關係O
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述雞蛋DNA從雞蛋卵黃膜中提取得到。
6.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述蛋雞DNA從蛋雞血液中提取得到。
7.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述PCR擴增的反應條件為95°C變性 30s，62-65°C退火 30s，72。。延伸 30s，30-35 個循環。
8.權利要求I所述微衛星引物、權利要求2或3所述試劑盒在判斷雞蛋和蛋雞遺傳關係中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種用於雞蛋溯源的微衛星引物、其試劑盒及應用。本發明的雞蛋溯源的微衛星引物為Seq No ID 1-20所示的核苷酸序列。本發明的檢測方法操作簡單、快捷、費用低廉、準確度高，並可實現自動化的直接檢測。本發明方法開發檢測試劑盒的檢測結果可靠、穩定、準確，為突發雞蛋安全事件的相關責任認定提供判斷依據。本發明從卵黃膜提取基因組DNA，將分子生物學方法用於鑑別真假雞蛋，並且實現從雞蛋到蛋雞的生物學追溯，可有效監控市售雞蛋的質量安全。
文檔編號C12Q1/68GK102864225SQ20121035090
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者楊寧, 鄭江霞 申請人:中國農業大學