具有降低的bmp拮抗劑敏感性的骨形成蛋白2(bmp2)變體的製作方法

2023-09-12 02:35:00 1

專利名稱：具有降低的bmp拮抗劑敏感性的骨形成蛋白2(bmp2)變體的製作方法
具有降低的BMP拮抗劑敏感性的骨形成蛋白2(BMP2)變體本發明的目的是取代骨形成蛋白2 (Bone Morphogenic Protein 2，BMP2)的中央殘基和結構域，其對於BMP2與其抑制劑的特異性相互作用最為重要，所述抑制劑例如頭蛋白(NOGGIN)。這些改變的目的是將該蛋白改變為具有增強的生物活性的拮抗劑抗性的變體。新蛋白可用於BMP相關的疾病或病症。骨形成蛋白(BMPs)和相關的生長與分化因子(Growth & Differentiation Factors,⑶Fs)是系統發生上保守的信號蛋白，其屬於轉化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF) β超家族。最初確定其功能為誘導骨，隨後顯示其參與身體形態形成(body patterning)禾口形態建成(morphogenesis)的多個方面(Kishigami S, Mishina YQ005)BMP 信號和早期胚胎圖式形成(BMP signaling and early embryonic patterning).細胞因子和生長因子的評論(Cytokine Growth Factor Rev) 16 :265-278.)。 迄今，已經識別了超過20種不同的BMP，其在胚胎發育和組織內穩態過程中具有不同的時空表達情況及不同的功能。儘管它們功能不同，但所有BMI^s具有相同的信號機制。它們被翻譯為由前結構域構成的前體蛋白，其在枯草桿菌蛋白酶樣前體蛋白轉化酶家族成員的特異切割後蛋白水解釋放。高度保守的成熟結構域以七個半胱氨酸(Cys)殘基為特徵，其中六個形成胞內Cys結(Cys knot)，而七個Cys中的第四個對於骨形成蛋白的二聚化是重要的。骨形成蛋白是分泌的肽，以同源或異源二聚體存在，與兩種主要類型的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體——I型和II型受體結合。骨形成蛋白與預先形成的異源聚體受體 (heteromeric receptor)複合物結合，導致SMAD和其他胞內途徑的活化。BMP信號由大量的拮抗劑精確調節，它們在細胞外、膜水平上以及細胞內起作用。越來越多與骨形成蛋白結合進而阻止受體活化的胞外拮抗劑得到鑑別。這些拮抗劑包括頭蛋白(Noggin，NOG)、腱蛋白(Chordin，CHRD)、CHRD 樣蛋白(CHRD-like proteins, CHRDL)和包括成神經細胞瘤中差異篩選的基因異常(Differential screening-selected gene Aberrant in Neuroblastoma, DAN)的 DAN 家族、賽伯樂 1 (Cerberus 1，CER1)、COCO、 與 DAN 和 CER 相關蛋白(Protein Related to DAN and CER，PRDC)、戈蘭林(Gremlin) (GREM)、子宮致敏相關基因(Uterine Sensitization-Associated Gene 1，USAG1)、硬化蛋白(Sclerostin, S0ST)、卵泡抑素(Follistatin, FST)、FST 樣蛋白(FST-like proteins, FSTL)、生長與分化因子相關血清蛋白 1 (Growth & differentiation factor-Associated Serum Protein 1，GASP1)和扭曲原腸形成(Twisted Gastrulation) (TffSG) (Yanagita M 000 BMP拮抗劑它們在發育和病理生理學相關方面的用途(BMP antagonists their roles in development and involvement in pathophysiology).細胞因子禾口生長因子的評論(Cytokine Growth Factor Rev) 16 :309-317.)。所述抑制劑表現出不同的表達模式， 因此很可能在體內有不同的生物學作用。此外，拮抗劑對各種骨形成蛋白以及其他因子具有不同的親和力。例如，NOG以高親和力與BMP2、BMP4、⑶F5及⑶F6結合，但對於BMP7卻只具有低親和力。另一方面，最初FST被認為是激活素(Activins)(ACVs)的拮抗劑，但也發現它結合骨形成蛋白。各種BMP拮抗劑可能與BMP分子中相似的結構域相互作用，已知 NOG 與 CER、GREM1 及 DAN 競爭結合 BMP2(Canalis Ε,Economides AN,Gazzerro E (2003)骨形成蛋白、它們的拮抗齊Ll禾口骨骼(Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton).內分泌物評價(Endocr Rev) 24 :218-235.)。還發現SOST具有多效作用 (pleiotrophic effects)，一方面作為BMP拮抗劑阻斷BMP活性，另一方面，也結合併中和 NOG 的活性，導致BMP 活性的激活(Winkler DG, Yu C, Geoghegan JC, Ojala Eff, Skonier JE, Shpektor D, Sutherland MK, Latham JA. 2004頭蛋白和硬化蛋白骨形成蛋白拮抗劑形成互助才￠$!1 複合物(Noggin and sclerostin bone morphogenetic protein antagonists form a mutually inhibitory complex).生物化學雜誌(J Biol Chem) 279 (35) :36四3_8)。因此，大量不同的骨形成蛋白與大致相同數量的胞外拮抗劑旗鼓相當，但是還不清楚其生物學重要性的詳盡知識。目前為止，已獲得至少兩個骨形成蛋白與拮抗劑形成的複合物中的三維結構(BMP7-N0G(PDB :1M4U)，以及BMP-2與Crossveinless_2的C型第一馮·威利布蘭德病結構域(PDB :3BK3) (The First Von Willebrand Domain Type C Of Crossveinless-2 (PDB :3BK3))。這些結構提供了物理上相互作用位點的重要信息，但沒有揭示在生物學上哪些胺基酸對相互作用是關鍵的。只有少數拮抗劑，如NOG、GREMU FST和 S0ST，得到了對它們在骨骼發育和再生中的功能的研究。通過Nog基因敲除小鼠的研究表明，NOG在軟骨內骨化中具有核心作用。這些小鼠顯示出所有軟骨原基(cartilaginous anlagen)和一定數量的其他神經管的大規模擴張，以及腦缺陷。通過指關節粘連和多個骨性癒合(多發性關節融合)症候群患者中NOG突變的鑑定，顯示出NOG對關節發育的重要性。以骨形成增加為特徵的兩種疾病——硬化性骨化病(sclerosteosis)和範布切姆病 (Van Buchem disease)的患者中SOST發生了突變(Kornak U, Mundlos S.骨骼的遺傳紊亂發育途徑(Genetic disorders of the skeleton -.a developmental approach).美國人類遺傳學雜誌(Am J Hum Genet.) 2003Sep ；73 (3) :447-74.)。自從他們發現了這些，就打算利用骨形成蛋白的骨誘導性質來促進骨折癒合過程中的骨生成或者切除術後的骨再生。然而，在體外和動物模型中骨形成蛋白在誘導骨中的高潛能只有部分能在人類患者中再現(Groeneveld，Ε. H. and Ε. H. Burger. 2000.在人骨再生中的骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration).內分泌學歐洲雜誌(Eur J Endocrinol) 142 :9-21. )。BMP效應可能由幾種因素調節，比如生物利用度、穩定性或組織中抑制骨形成蛋白的局部相互作用因子。本發明的目的是克服或減輕現有技術中的一個或多個問題。本發明的目的特別是提供了具有BMP2活性的抗頭蛋白(Noggin)的肽。根據第一個方面，本發明提供了分離的肽，其包含具有與具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列或者由具有與具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列組成，其特徵在於，所述的胺基酸序列包含至少兩個胺基酸取代，其中第一胺基酸取代發生在相應於SEQ ID No. 1的N59、S88、E94、 V99、KlOl和/或N102的位置。根據第二個方面，本發明提供了分離的核酸，其特徵在於，所述的核酸包含i)編碼本發明的分離的肽的核酸序列；或ii)在標準條件下與編碼本發明的分離的肽的核酸雜交的核酸序列。令人驚訝地發現，本發明的分離的肽顯示出BMP2活性，但實質上卻耐受BMP2的天然拮抗劑Noggin的抑制作用。本發明的分離的肽特徵在於，對通過Noggin的抑制作用的敏感性降低，在機體中，尤其是在人體中，比天然產生的BMP2更穩定，和/或具有改進或改變的生物活性。有趣的是，已經發現BMP2的C-端區域至少兩個胺基酸的取代導致分離的肽實質上耐受通過Noggin的抑制作用，同時基本上保持BMP2的生物活性。此處使用的術語「肽」包括包含由通過肽鍵連接自然和/或人工胺基酸形成的直鏈的任何分子。因此，「肽」的表述，包括寡肽、多肽和/或蛋白質片段，以及整個蛋白質，其中所述肽的一個或多個胺基酸可以被修飾。此處指代特定胺基酸是基於胺基酸單字母代碼。「分離的」肽實質上是區別於其他肽分子的肽，其他肽分子存在於分離的肽的天然來源中(例如，天然來源的蛋白質組的其他多肽)。例如，重組表達的肽被認為是分離的。 通過人為幹預而改變，或者通過並非其天然來源的生物表達的肽也被認為是分離的。此外， 「分離的」肽，可以從與它天然相關聯的一些其他細胞物質，或重組技術生產時的培養基，或化學合成時的化學前體或其他化學物中分離出來。從「分離的肽」的定義中明確排除的是 自然產生的、未純化的肽混合物或組合物、天然產生來源的全細胞製品(包括機械剪切或酶消化的全細胞製品)。本發明也涉及分離的核酸。本發明的核酸可以包括DNA、RNA、它們的混合物和/或它們的功能取代物，特別是 cDNA、基因組DNA和/或RNA，可全部或部分合成。本發明的核酸包含單鏈和/或全部或部分雙鏈多核苷酸序列。術語「分離的」包含了所有這些可能性。對於本發明的目的，DNA序列是特定的，例如參照特定的SEQ ID No.，除非另有所指，相應的RNA(RNA equivalent)也包含在其中，其出現時用U替換T。本發明的核酸可以通過任何方法產生，包括基因組製備、 cDNA製備、體外合成、PCR、RT-PCR和/或在體外或體內轉錄。「分離的」核酸實質上是與存在於所述核酸天然來源中的其他核酸分子相區別的核酸(例如，編碼其他多肽的序列)。優選地，「分離的」核酸去除了在其天然複製子中天然位於所述核酸兩翼(例如，位於所述核酸的5'和3'末端的序列)的一些序列。例如，克隆的核酸被認為是分離的。在不同的實施方式中，本發明的分離的核酸可以含有少於約51Λ、 4kb,3kb,2kbUkb,0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，該序列天然位於所述核酸所來源的細胞的基因組DNA中核酸分子的兩側。如果已經被人為幹預改變，或放置在非其天然位點的基因座或位置，或者其被導入細胞，核酸也被認為是分離的。此外，「分離的」核酸，如cDNA分子，可以從與其天然相關聯的一些其他細胞物質，或重組技術生產時的培養基，或化學合成時的前體化學物或其他化學物中分離出來。明確從「分離的核酸」的定義中排除的是天然產生的染色體(如染色體分散(chromosome spreads))、基因組文庫、以及天然產生來源的全細胞基因組DNA或全細胞RNA製品(包括機械剪切或消化酶的全細胞製品)。技術人員熟知遺傳密碼的簡併性，允許一些不同的核酸序列編碼相同的胺基酸序列，且對於確定給定的核酸序列是否編碼本發明的分離的肽沒有困難。本發明的分離的肽和/或核酸可以以分離的形式提供，例如，從它們的天然環境中純化，優選基本上純的和/或同質的形式和/或除了目的序列外去除或基本上去除所來源物種的肽、核酸和/或基因。本發明的分離的肽包含具有與具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90% 胺基酸同一性的胺基酸序列或由具有與具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列組成，優選地所述胺基酸同一性至少是93%，更加優選地至少 95 %，進一步更優選地至少98 %，最優選地至少99 %。優選的實施方式中，本發明的分離的肽包含具有與具有SEQ ID No. 11的全長人BMP2至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列或由具有與具有SEQ ID No. 11的全長人BMP2至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列組成，優選地所述胺基酸同一性至少是93 %，更加優選地至少95 %，進一步更優選地至少98 %，最優選地至少99%。所述同一性分別基於SEQ ID No. 1或SED ID No. 11的全長，通過忽略(排除)本發明的分離的肽中存在的至少兩個胺基酸取代計算。登錄號為NP_001 191且序列為SEQ ID No. 11的全長人BMP2蛋白(hBMP2)由396 個胺基酸組成。N-端胺基酸1至觀2，其序列為SEQ ID No. 10的所謂前結構域，為了實現完全的加工，其在全長肽的加工過程中被切除，有活性的hBMP2，此處也稱其為成熟hBMP2， 其序列為SEQ ID No. 1。因此，成熟hBMP2的胺基酸序列起始於全長hBMP2的第283位胺基酸(即胺基酸Q)，包含隨後的113個胺基酸。本文中成熟hBMP2是指SEQ ID No. 1的胺基酸序列，其由完全加工的胺基酸序列組成，有活性的hBMP2全長為114個胺基酸。SEQ ID No. 1的第1個胺基酸即SEQ ID No. 11的第觀3個胺基酸，第114個胺基酸即SEQ ID No. 11 的第396個胺基酸。下文中，特定的胺基酸或胺基酸位置通過首先以單字母代碼指出hBMP2的相應的胺基酸，隨後是以SEQ ID No. IN-端開始讀向C-端方向的胺基酸序列中的位置編號的方式來指明。例如，SEQ ID No. IN-端的第1個胺基酸表示為Ql (與SEQ ID No. 11的Q283 — 致)，而SEQ ID No. IC-端最後1個胺基酸表示為Rl 14 (與SEQ ID No. 11的R396 —致)。由於歷史原因，在本申請的實驗部分，特定的胺基酸位置通過全長人BMP2的胺基酸序列SEQ ID No. 11從N-端開始讀向C-端方向的位置編號來標明。通過簡單地將全長BMP2(SEQ ID No. 11)的特定胺基酸或胺基酸位置數字減去觀2，可以容易地轉換成相對於成熟BMP2(SEQ ID No. 1)的胺基酸位置。例如SEQ ID No. 11的N341與SEQ ID No. 1的N59 —致。兩個胺基酸序列之間的同一性或同源性理解為意味著各情形中在全序列長度範圍內相應序列的同一性(本文中術語同一性和同源性互換使用)。為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸的同一性百分數，序列以最優比較目標進行比對(例如為了與第二胺基酸或核酸序列進行最優比對，缺口(gap)可以被引入第一胺基酸或核酸序列)。兩個序列間的同一性百分數是序列享有一致位置的數量的函數(例如，同源性％ =—致位置的#/位置的總計#X100)。可以使用數學算法來實現兩個序列間同源性百分數的確定。優選地，用於比較兩個序列的數學算法的非限制性例子是Karlin和Altschul算法(1990)美國科學院院刊(Proc. Natl. Acad. ScL USA) 87 :2洸4_68，修訂形式如 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 :5873_77。這種算法併入了 Altschul，等人(1990)分子生物學雜誌 (J. MoI. Biol.) 215 :403-10 的 NBLAST 和 XBLAST 程序。BLAST 核酸搜索可以通過 NBLAST 程序執行，分值=100，字長=12。BLAST蛋白搜索可以通過XBLAST程序執行，分值=50，字長=3。為了得到比較目的的缺口 (gapped)的比對，可以用如Altschul et al，(1997)核酸研究(Nucleic Acids Research) 25 (17) :3389-3402 描述的缺口 BLAST (gapped BLAST)。 當使用BLAST和缺口 BLAST程序時，可以採用相應程序(如XBLAST和NBLAST)的默認參數。 可替代地，同一性或同源性的測定也可以通過使用軟體包Bioedit(可獲自http://VWW. mbio. ncsu. edu/BioEdit/bioedit. html)中默認設置的 ClustalW_Bioedit 算法(ThompsonJD et al. (1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680)來進行比較。優選地，本發明的分離的肽顯示BMP2活性。本發明的分離的肽如果保留了至少 25%的野生型BMP2的活性，則歸類該分離的肽顯示了 BMP2活性，即，所述野生型BMP2的活性為加工後的活性，有活性的SEQ ID No. 1的BMP2。優選地，本發明的分離的肽具有至少 50%的野生型BMP2的活性；更優選地，至少75%;進一步優選地，至少85%;最優選地，至少 95%。BMP2活性可以通過很多不同的方法測定。只要在一個及同樣測試(same test)中測定本發明的分離的肽的BMP2活性以及對照(有活性的人BMP2)的活性即可，BMP2活性測試的確切性質較不重要。技術人員熟知適合於測定BMP2活性的多種不同的測試。優選地通過使用雞微團培養系統(chMM)測試來測定BMP2的活性。雞微團培養系統(chMM)是軟骨分化的體外模型(DeLise AM, Stringa Ε, Woodward WA, MeIIo MA, Tuan RS 2000 胚胎肢間充質微團培養作為軟骨形成和軟骨成熟的體外模型(Embryonic limb mesenchyme micromass culture as an in vitro model for chondrogenesis and cartilage maturation). 生物學方法(Methods Mol Biol.) 137 :359-75.) (Seemann P, Schwappacher R, Kjaer Kff, Krakow D,Lehmann K, Dawson K, Strieker S, Pohl J, Pl omicronger F, Staub E, NickelJ, Sebald W, Knaus P，Mundlos S. 2005在GDF5的受體相互作用位點激活和滅活突變引起 A2 型指關節豐佔連或失fif旨(Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2).臨床石if 究雜誌(J Clin Invest. )2005 Sep ； 115 (9) :2373-81.)。此處，從雞肢芽中製備的原代間充質細胞分化為軟骨細胞。細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)的生成作為早期軟骨細胞產生的標誌，且可以通過3至7天孵育後進行阿爾辛藍(Alcian blue)染色得到定量。 為了測試該系統中的特定基因，可以用摻入了感興趣基因的複製型禽肉瘤(implication competent adenovirus, RCAS)病毒感染所述細胞。已知chMM中hBMP2的過表達會引起細胞增殖以及軟骨基質顯著產生(Duprez DM,Coltey Μ,Amthor H,Brickell PM,Tickle C. 1996 骨形成蛋白-2(BMPD在雞肢芽培養中抑制肌發育並促進軟骨發育(Bone morphogenetic protein-2(BMP-2)inhibits muscle development and promotes cartilage formation in chick limb bud cultures).發育生物學(Dev Biol. )Mar 15 ；174(2) :448-52.)。相比之下，Noggin和hBMP2的共表達則引起所述分化效應的完全抑制。除了與SEQ ID No. 1和/或SEQ ID No. 11比較的序列同一性外，本發明的分離的肽進一步的特徵在於所述的胺基酸序列包含至少兩個胺基酸取代，其中第一胺基酸取代發生在相應於SEQ ID No. 1的N59、S88、E94、V99、KlOl和/或附02的位置。此處所述的術語胺基酸取代是指給定位置特定胺基酸的缺失和/或替換。特別優選的方式，術語胺基酸取代可以理解為僅僅是指給定位置特定胺基酸的替換。為了表達具體，每個取代至少以被取代的胺基酸類型來描述，優選地以單字母代碼描述，並且給出所述的胺基酸基於SEQ ID No. 1的精確位置。特定取代可進一步通過指出用於替換被取代胺基酸的胺基酸命名來明確描述。任何情況下，特定取代只有名稱在位置數字之前的所述指定的胺基酸被取代。取代可能導致所述胺基酸從所述序列中缺失，正好一個其他的胺基酸替換所述胺基酸，和/或多於一個的其他胺基酸替換所述胺基酸，優選地，不超過三個其他胺基酸，更優選地，兩個其他胺基酸替換所述胺基酸。優選地，本發明的分離的肽的特徵在於所述的第一胺基酸取代選自N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、KlOlI、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YH。更優選地，本發明的分離的肽包含在N59、E94、K101和/或附02位置的至少一個取代，最優選地在N59或m02位置。在另一更加優選的實施方式中，本發明的分離的肽的特徵在於所述的第一胺基酸取代選自 N59K、N59T、N59V、N59E、E94P、K101I、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YHo在另一優選的實施方式中，本發明的分離的肽其特徵在於所述分離的肽包含第二胺基酸取代，其中所述第二胺基酸取代不同於第一胺基酸取代，並發生在相應於SEQ ID No. 1 的 D22、S24、V26、N29、D30、V33、A34、P36、G37、H39、F41、H44、P48、A52、D53、L55、N59、 S88、E94、V99、KlOl和/或附02的位置。更優選地，本發明的分離的肽的特徵在於所述的第二胺基酸取代選自 D22R、D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、S24Q、V26L、N29T、N29Q、D30A、 D30T、V33I、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、P36S、G37T、H39A、F41N、H44D、P48S、A52N、D53A、 D53Y、L55M、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、 N102W 和 / 或 m02YH。在另一優選的實施方式中，本發明的分離的肽的特徵在於所述第二胺基酸取代發生在相應於 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、 KlOl和/或附02的位置。更優選地，本發明的分離的肽的特徵在於所述的第二胺基酸取代選自 D22R、D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、 P36S、G37T、D53Y、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、 N102V、N102W 和 / 或 N102YHo在另一優選的實施方式中，本發明的分離的肽的特徵在於所述分離的肽包含第三胺基酸取代，其中所述的第三胺基酸取代不同於第一和第二胺基酸取代，且發生在相應於 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、K101 和 / 或 N102的位置。更優選地，本發明的分離的肽的特徵在於所述的第三胺基酸取代選自D22R、 D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、P36S、G37T、D53Y、 N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102V、N102YH、N102S 和 / 或 N102W。在另一優選的實施方式中，本發明的分離的肽的特徵在於所述分離的肽包含第四胺基酸取代，其中所述的第四胺基酸取代不同於第一、第二和第三胺基酸取代，且發生在相應於 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、K101 和/或附02的位置。更優選地，本發明的分離的肽的特徵在於所述的第四胺基酸取代選自 D22R、D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D, P36K、P36R、P36S、G37T、 D53Y、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、KlOlI、K101L、N102V、N102YH、N102S 和/或m02W。本發明分離的肽可以包含下面的胺基酸序列或者由下面的胺基酸序列組成SEQ ID No. 2，其基於 SEQ ID No. 1 並且 N59K 和 V99T 取代；SEQ ID No. 3，其基於 SEQ ID No. 1 並且 N59K 和 m02YH 取代；SEQ ID No. 4，其基於 SEQ ID No. 1 並且 N59T 和 V99T 取代；SEQ ID No. 5，其基於 SEQ ID No. 1 並且 N59T 和 m02YH 取代；SEQ ID No. 6，其基於 SEQ ID No. 1 並且 V99T 和 m02YH 取代。
SEQIDNo.7，其基於SEQ ID No. 1並且N59T和S24E取代；
SEQIDNo.8，其基於SEQ ID No. 1並且N59K和P36K取代；
SEQIDNo.9，其基於 SEQ ID No.]_ 並且 N59K、N102YH 和 S24E 取代；
SEQIDNo.12，其基於SEQIDNo.11並且N59K和V99T取代；
SEQIDNo.13，其基於SEQIDNo.11並且N59K和N102YH取代；
SEQIDNo.14，其基於SEQIDNo.11並且N59T和V99T取代；
SEQIDNo.15，其基於SEQIDNo.11並且N59T和m02YH取代；
SEQIDNo.16，其基於SEQIDNo.11並且V99T和m02YH取代。
SEQIDNo.17，其基於SEQIDNo.11並且N59T和S24E取代；
SEQIDNo.18，其基於SEQIDNo.11並且N59K和P36K取代；和/或
SEQIDNo.19，其基於SEQIDNo.11 並且 N59K、N102YH 和 S24E 取代本發明的分離的肽除上面定義的至少兩個胺基酸取代之外還可以包含其他的胺基酸取代。本發明的分離的肽可以含有進一步的修飾，例如改變蛋白質另外性質的突變。 這些性質可以包括BMP2活性、對Noggin和/或其他抑制劑或BMP2拮抗劑的抗性，以及諸如穩定性或者免疫原性，或者賦予或阻止翻譯後修飾如聚乙二醇(PEGylation)化或糖基化的性質。本發明的分離的肽可以被共翻譯或翻譯後修飾，包括但不限於一個或更多個側鏈或末端的合成衍生、糖基化、PEG化、循環排列(circular permutation)、環化 (cyclization)、融合蛋白質或蛋白質結構域，以及添加肽標記(tag)或標籤(label)。本發明的分離的肽可以根據已知的方法製備。這些方法包括這些分離的肽的從頭合成和/或由編碼分離的肽的核酸表達本發明的分離的肽。在特別優選的方式中，通過表達本發明的分離的核酸來製備本發明的分離的肽。本發明也涉及分離的核酸，其包含編碼本發明的分離的肽的核酸序列或由編碼本發明的分離的肽的核酸序列組成，或者包含在標準條件下與編碼本發明的分離的肽的核酸序列雜交的核酸序列或由在標準條件下與編碼本發明的分離的肽的核酸序列雜交的核酸序列組成。術語標準雜交條件應該被廣義地理解，意思是嚴格和/或略低嚴格雜交條件。該雜交條件在 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T 等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual (分子克隆-A 實驗室手冊)，aid edition (第 2 版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社)，1989，第9. 31-9. 57頁，或者現代分子生物學實驗技術(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons,紐約 (N. Y.) (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中特別描述。例如，洗滌步驟中的條件可以選自那些低嚴格性限制(大約2XSSC，50°C )和高嚴格性限制(大約0.2父55(，501，優選65°0(20\55(: 0.3M檸檬酸鈉、3M NaCl, pH 7.0)的條件範圍內。此外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫、大約22°C的低嚴格性條件，到大約65°C的更嚴格條件。鹽濃度和溫度兩個參數可以同時變化，或者可以所述兩個參數中的一個保持恆定，僅另一個變化。在雜交中可以使用變性劑， 例如甲醯胺或十二烷基硫酸鈉(SDS)。在50%甲醯胺存在下的雜交優選地在42°C進行。雜交和洗滌步驟的一些示例性的條件如下(1)雜交條件例如a) 4 X SSC, 65"C ；或
b)6XSSC，0. 5% SDS,100y g/ml 變性的片段化的鮭魚精 DNA，65°C ；或c)4XSSC，50% 甲醯胺，42°C ；或d)2X或4XSSC，50°C (低嚴格性條件)；或e)2X或4XSSC，30-40%甲醯胺，42°C (低嚴格性條件)，或f)6XSSC，45°C ；或，g) 0. 05M 磷酸鈉緩衝液 pH 7. 0, 2mM EDTA, 1% BSA ^P 7% SDS。(2)洗滌步驟例如a)0. 1XSSC，65°C ；或b)0. 1XSSC，0. 5% SDS，68°C ；或c) 0. 1XSSC，0. 5% SDS，50% 甲醯胺，42°C ；或d)0. 2XSSC，0. 1% SDS，42°C ；或e)2XSSC,65°C (低嚴格性條件)，或f) 40mM 磷酸鈉緩衝液 pH 7. 0,1% SDS, 2mM EDTA。本發明的分離的核酸可以根據本領域中已知的方法製備。優選的方式，本發明的分離的核酸，可以通過全部基因合成，或通過定點突變編碼野生型或修飾的BMP的核酸來製備。可以利用的方法包括模板引導的連接(template-directed ligation)、遞歸 PCR(recursive PCR)、盒式誘變(cassette mutagenesis)、定點突變或其他本領域熟知的技術(參見例如Mhzhov等人.美國科學院院刊(PNAS) 93 :15012-15017(1996) ,Prodromou 和 Perl，蛋白質工程(Prot. Eng.) 5 :827-829(1992)、Jayaraman 和 Puccini，生物技術 (Biotechniques) 12 :392-398 (1992)，以及 Chalmers 等人·生物技術(Biotechniques) 30 249-252(2001))ο本發明的分離的核酸可以進一步包括向本發明的分離的核酸添加了另外的功能的另外的核酸序列。例如，這些另外的核酸序列可以包含允許本發明的分離的肽適當表達的核酸序列，且可以包含啟動子序列、調節序列、終止信號、複製起點及諸如此類的序列。技術人員熟知這些功能的核酸序列，以及為了獲得具有期望性質的核酸分子如何來排列它們。本發明也涉及表達本發明的分離的肽的轉基因生物或細胞。優選地所述轉基因生物或細胞的特徵在於所述生物或細胞包含本發明的分離的核酸。因而，本發明涉及瞬時或穩定地轉化或轉染了至少一個分離的核酸或至少一個轉基因表達盒或至少一個編碼本發明的分離的肽的載體的轉基因生物或細胞，或這些轉基因生物或細胞的後代。此外，本發明涉及細胞、細胞培養物、組織和/或本發明的轉基因生物的部分。為了本發明的目的，術語轉基因生物應該理解為不僅包括瞬時或穩定地引入了本發明所述核酸的生物，也涉及這些生物的後代，而不考慮代的距離(generation distance)，例如，只要這些生物仍然包含本發明的核酸和/或表達本發明的分離的肽，第1代的後代和第X代的後代一樣。優選地，轉基因生物或細胞是原核或真核來源的，優選地，轉基因生物是微生物。 優選的微生物是細菌、酵母、藻類或真菌。轉化的生物或轉化的細胞的製備需要向合適的宿主生物或細胞導入合適的 DNA。許多方法可用於此轉化過程(也參見Keown等人.1990酶學方法(Methods in Enzymology) 185 :527-537)。因此，例如，所述DNA可以通過微注射或轟擊DNA包被的微粒或納米粒子而直接導入。所述細胞也可以通過化學方法滲透，例如用聚乙二醇，使得DNA可以通過擴散進入細胞。DNA還可以通過與其他含有DNA的單位例如小細胞(minicell)、細胞、溶酶體或脂質體的原生質體融合來進行。其他導入DNA的合適的方法是電穿孔，其中細胞通過電脈衝可逆地滲透。本發明也涉及本發明的分離的肽和/或本發明的分離的核酸在治療疾病或病症中的應用，例如，治療BMP-相關的疾病或病症，其中這些疾病或病症包括-骨、軟骨、非礦化的骨骼或結締組織的形成；-代謝性疾病，例如治療代謝性骨疾病中骨量(bonemass)損失和/或增加的治療 (US 5，674，844)；在諸如破裂、骨折和/或撕裂的損傷部位處的骨和/或軟骨更換或修復(US 5，733，878)，例如脊柱或椎骨修復；牙周組織再生(US5，733，878)；肝再生(US5，849，686)；慢性腎功能衰竭(US 6，861，404)；促進中樞神經系統缺血或外傷後功能恢復(US 6，407，060)；樹枝狀生長(US6，949，505)；神經細胞粘連(neuralcell adhesion) (US 6，800，603)；帕金森症(US6，506，729)。此處所使用的術語「治療」，是指扭轉、減輕或抑制了疾病、紊亂或病症的進程，或一個或更多個該疾病、紊亂或病症的症狀。本文所用「治療」，也可以指與未被治療的對照群體相比，或與相同的哺乳動物的治療前相比，降低了哺乳動物中疾病、紊亂或病症發生的可能性或機率。例如，如本文所述，「治療」可以是指預防疾病、紊亂或病症，且可以包括推遲或預防疾病、紊亂或病症的發作，或推遲或預防與這些疾病、紊亂或病症相關的症狀。如本文所述，「治療」還可以是指在哺乳動物遭受疾病、紊亂或病症的折磨之前，減輕疾病、紊亂或病症或與這些疾病、紊亂或病症相關的症狀的嚴重性。所述在折磨之前預防或減輕疾病、 紊亂或病症的嚴重性，與向不在用藥時間的、承受疾病、紊亂或病症的折磨的患者給藥如本文所述的本發明的組合物有關。此處使用的「治療」，也可以指預防疾病、紊亂或病症，或者一個或更多個與所述疾病、紊亂或病症相關的那些症狀的復發。本文使用的術語「治療」和 「治療地」，是指如上面所定義的「治療」的行為。本發明的肽和/或分離的核酸可以用於製備藥物，優選地製備治療BMP相關的疾病或病症的藥物，其中這些疾病或病症包括骨、軟骨、非礦化的骨骼或結締組織的形成； 代謝性疾病；在諸如破裂、骨折和/或撕裂的損傷部位處的骨和/或軟骨更換或修復；牙周組織再生；肝再生；慢性腎功能衰竭；促進中樞神經系統缺血或外傷後功能恢復；樹枝狀生長；神經細胞粘連；帕金森症。本發明還涉及包含本發明的肽和/或分離的核酸以及可選地一種或更多種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。當用於人類治療時，本發明的分離的肽或核酸和/或其藥學上可接受鹽類通常以與一種或更多種藥學上可接受的賦形劑相結合的製劑的形式給藥。術語「賦形劑」此處用來描述除了本發明的化合物之外的任何成分。賦形劑的選擇將很大程度上依賴於所給藥的特定方式。
本發明的化合物可以口服給藥。口服給藥可以包括吞咽，以便化合物進入消化道， 或者採用口腔或舌下給藥，由此化合物直接從口進入血流。適於口服給藥的製劑包括諸如片劑的固體製劑；含有微粒、液體或粉末的膠囊；錠劑(包括充液的)；以及咀嚼物；多微粒及納米微粒；凝膠；固體溶液(solid solutions)；脂質體；膜、胚珠(ovule)、噴霧劑和液體製劑。液體製劑包括懸液、溶液、糖漿和酏劑。這些製劑可以作為軟膠囊或硬膠囊的填充劑，且通常包含載體，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素、或合適的油，以及一種或更多種乳化劑和/或懸浮劑。液體製劑也可以通過固體重建來製備，例如從囊劑 (sachet)0本發明的化合物也可以以諸如本領域中所描述的那些快速溶解、快速崩解劑型使用。對於片劑劑型，根據劑量，所述藥物可以佔到劑型的1重量％至80重量％，更通常地，佔到劑型的5重量％至60重量％。除了藥物，片劑通常含有崩解劑。崩解劑的例子包括羥基乙酸澱粉鈉(sodium starch glycolate)、羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose)、羧甲基纖維素 丐(calcium carboxymethyl cellulose)、交聯羧甲基纖維素鈉(croscarmellose Sodium)、交聯聚維酮(crospovidone)、聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinylpyrrolidone)、甲基纖維素、微晶纖維素、低烷基_取代羥丙基纖維素、澱粉、預膠化澱粉(pregelatinised-starch)和海藻酸鈉。一般來說，崩解劑佔劑型的1重量％至 25重量％，優選5重量％至20重量％。粘合劑通常用於將粘結物(cohesive qualities)製成片劑。合適的粘合劑包括微晶纖維素、明膠、糖、聚乙二醇、天然和合成膠、聚乙烯吡咯烷酮、預膠化澱粉、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。片劑中還可以包含稀釋劑，例如乳糖(一水合乳糖，噴霧乾燥的一水合乳糖，無水乳糖等等)、甘露醇、木糖醇、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、山梨醇、微晶纖維素、澱粉和磷酸氫鈣二水合物(dibasic calcium phosphate dihydrate)。片劑也可以可選地包括表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉和聚山梨醇酯80，以及諸如二氧化矽和滑石等的助流劑。目前，表面活性劑可以佔片劑的0. 2重量％至5重量％， 且助流劑可以佔片劑的0. 2重量％至1重量％。片劑中還可能含有潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂醯延胡索酸鈉 (sodium stearyl fumarate)、以及硬脂酸鎂與十二烷基硫酸鈉的混合物。潤滑劑一般佔片劑的0. 25重量％至10重量％，優選佔片劑的0. 5重量％至3重量％。其他可能的成分，包括抗氧化劑、色素、調味劑、防腐劑和味道掩蓋劑。示例性的片劑含有高達約80%的藥物，約10重量％至約90重量％的粘合劑，約0 重量％至約85重量％的稀釋劑，約2重量％至約10重量％的崩解劑，以及約0. 25重量％ 至約10重量％的潤滑劑。片劑混合物可以被直接壓制或者藉助輥輪壓制形成片劑。片劑混合物或片劑混合物的部分在製成片劑前可以是溼的、幹的或熔化顆粒狀的、融化凝結的或擠出的。最終的製劑可以包含一層或更多層，且可以被包衣或未被包衣；其甚至可以是裝入膠囊的。片劑的配製在本領域是標準的。人類使用的一次性的口腔膜(consumable oral film)通常是柔韌的水溶性或水膨脹性的薄膜劑型，其可迅速溶解或黏膜粘附，並且通常包含分離的肽或核酸、成膜聚合物、粘合劑、溶劑、保溼劑、增塑劑、穩定劑或乳化劑、粘度改性劑和溶劑。製劑的一些組分可以發揮不止一個功能。本發明分離的肽或核酸可以是水溶性的或者不溶性的。水溶性化合物通常包含1 重量％至80重量％，更通常地包含20重量％至50重量的所述溶質。低溶解性的化合物可以包含較高比例的所述成分(composition)，通常可包含高達88重量％的所述溶質。可選地，本發明分離的肽或核酸可以是多微粒小珠(bead)形式。成膜聚合物，可以選自天然多糖、蛋白質或人工合成的水膠體(hydrocolloid)，通常存在的範圍是0. 01重量％至99重量％，更典型地，範圍是30重量％至80重量％。其他可能的成分包括抗氧化劑、著色劑、調味劑和增味劑、防腐劑、唾液刺激劑、 冷卻劑、共助溶劑(co-solvents)(包括油)、軟化劑、膨化劑(bulking agent)、防沫劑、表面活性劑和味道掩蓋劑。根據本發明的薄膜通常可以通過蒸發乾燥塗覆在可剝離的背後支持物或紙張上的薄的含水膜來製備。這可在烘箱或管道中完成，通常是複合式塗布乾燥機(coater dryer)，或冷凍乾燥或真空。用於口服給藥的固體製劑可以配製成即時和/或改性控制釋放(modified release)。改性控制釋放製劑包括延遲、持續、脈衝、控制、靶向和程序化釋放。對本發明目的合適的改性控制釋放製劑描述於US 6，106，864。其他合適的釋放技術的細節，如高能量分散和滲透以及包覆顆粒能在本領域找到。WO 00/35298中描述了利用口香糖實現改性控制釋放。本發明的化合物也可以被直接給藥入血流、肌肉，或內部器官。腸胃外給藥的合適方式包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌內和皮下。腸胃外給藥的合適設備包括針(包括微針)注射器、無針注射器和輸液技術。腸胃外製劑通常是水性溶液，其可以含有賦形劑，如鹽、碳水化合物和緩衝劑(優選地PH值從3到9)，但對於某些應用，它們可能更適合配製成無菌的非水溶液或以乾燥的形式，用來與合適的賦形物(vehicle)，如無菌的無熱原水，一起使用。腸胃外製劑通過藉助本領域技術人員所熟知的標準製藥技術，在無菌條件下，例如藉助冷凍真空乾燥法，可以容易地製備。可以通過使用合適的配製技術，例如加入溶解性增強劑，來提高用於製備腸胃外溶液的本發明的分離的肽或核酸的溶解性。腸胃外給藥的製劑，可以配製成即時和/或改性控制釋放。改性控釋製劑製劑包括延遲、持續、脈衝、控制、靶向和程序化釋放。因此本發明的化合物可以配製成固體、半固體或者觸變液體，以作為植入的庫(Cbpot)給藥，該庫提供活性化合物的控制釋放。這種製劑的實例包括藥物塗層支架和PGLA聚(dl-乳酸-乙醇酸)酸(PGLA) (PGLApoly (dl-lactic-coglycolic) acid, PGLA)微球。本發明的化合物，也可以局部地施用於皮膚或黏膜，也就是皮膚地或經皮地給藥。 用於該目的的典型製劑包括凝膠、水凝膠、乳液、溶液、霜、軟膏(Ointment)、噴粉(dusting powder)、敷料、泡沫、薄膜、皮膚貼片(skin patch)、晶片(wafer)、植入物、海綿、纖維，繃帶和微乳液。也可以用脂質體。典型的載體包括酒精(alcohol)、水、礦物油、液體凡士林、白凡士林、甘油、聚乙二醇和丙二醇。也可以包括滲透促進劑。局部給藥的其他方式包括通過電穿孔遞送、離子導入、超聲透入 (phonophoresis)、超聲促滲(sonophoresis)和微針或無針(如 Powderject(TM)， Bioject(TM)等)注射。局部給藥的製劑，可以配製成即時和/或改性控制釋放。改性控制釋放製劑包括延遲、持續、脈衝、控制、靶向和程序化釋放。本發明的化合物也可以鼻內或吸入給藥，在使用或不使用合適的推進劑，如1，1， 1,2-四氟乙烷(1,1,1, 2-tetrafluoroethane)或 1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(1,1,1,2,3, 3, 3-heptaf luoropropane)的情況下，通常以來自乾粉吸入器的乾粉的形式(單獨或作為混合物，例如，與乳糖的乾燥混合物，或作為混合的組分顆粒，例如，與諸如磷酸卵磷脂的磷脂混合)，或者作為來自於加壓容器、泵、噴霧、霧化器(優選使用電液壓動力產生細水霧的霧化器)或噴霧器的氣溶膠噴射的形式給藥。對於鼻腔內使用，粉末可以包含生物黏附劑， 例如，殼聚糖或環糊精。裝有本發明分離的肽或核酸的溶液或懸液的壓力容器、泵、噴霧、霧化器或噴霧器包含例如，乙醇、含水乙醇或合適的用於分散、增溶或延長活性釋放的替代劑，作為溶劑的推進劑和可選的表面活性劑，諸如山梨醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸。吸入/鼻內給藥製劑可以藉助於例如聚乙交酯-丙交酯(PGLA)，配製成即時和/ 或改性控制釋放。改性控制釋放包括延遲、持續、脈衝、控制、靶向和程序化釋放。為了提高其溶解度、溶出速率、味道掩蓋性、生物利用度和/或使用的穩定性，在上面提到的任何方式的給藥中，本發明的化合物可以結合水溶性高分子實體，例如環糊精及其合適的衍生物或包含聚乙二醇的聚合物。已經發現，例如藥物-環糊精複合體通常對於大部分的劑型和給藥途徑是有用的，包埋以及非包埋複合體均可以使用。作為與藥物直接絡合的備選物，環糊精可以用作為輔助添加劑，即作為載體、稀釋劑或增溶劑。最常用於這些目的的是α-、β-和Υ-環糊精，其實例可以在國際專利公開號為WO 91/11172、WO 94/02518和WO 98/55148的專利中找到。施用給人類患者，本發明的化合物的每日總劑量通常在0. OOlmg至5000mg的範圍內，當然，這根據給藥的方式而定。例如，靜脈注射每日劑量可能只需要0. OOlmg至40mg，每日總劑量可以以單次或分次的劑量進行，並且該劑量可以根據醫生的考慮，落在此處給出的通常範圍以外。這些劑量基於體重為約65kg至70kg的一般人類患者。醫生將能夠容易地確定體重落入該範圍外的患者，例如嬰兒和老年人的劑量。另一方面，本發明提供了治療BMP相關的疾病或病症的方法，其中這些疾病或病症包括骨、軟骨、非礦化的骨骼或結締組織的形成，代謝性疾病，在諸如破裂、骨折和/或撕裂的損傷部位處的骨和/或軟骨更換或修復，牙周組織再生，肝再生，慢性腎功能衰竭， 促進中樞神經系統缺血或外傷後功能恢復，樹枝狀生長，神經細胞粘連，帕金森症，其特徵在於對需要上述治療的受試者給藥有效劑量的本發明的分離的肽和/或本發明的分離的核酸，可選地與一種或更多種藥學上可接受的賦形劑同時給藥。根據本發明，分離的肽、分離的核酸和/或包含它們作為活性成分的藥物，優選地以有效劑量給藥。「有效劑量」是給藥至患者活性成分，得到對目的疾病可測量的治療效果的劑量。在本發明中，有效劑量是給藥至患有上述一種或多種特定疾病或病症的患者所述分離的肽或核酸，得到上述的特定疾病或病症的治療效果的劑量。優選地，每次治療或給藥，所述的分離的肽或核酸以不超過5mg/kg體重的劑量施用。特別地，本發明所述的分離的肽或核酸，以每次治療或給藥lng/kg體重至lg/kg體重的劑量施用，優選地，以每次治療或給藥0. 01 μ g/kg體重至5000 μ g/kg體重施用。為了防止出現急性副作用，建議所述分離的肽或核酸以每日累積劑量最大不超過10mg/kg體重給藥。在下面的實例部分，將藉助於附圖和實施例更詳細地解釋本發明。貫穿實驗部分和附圖，特定的胺基酸和胺基酸位置是相對於SEQ ID No. 11提及的。這些胺基酸和胺基酸位置可以簡單地通過從位置數字中減去觀2，容易地轉換成相對於 SEQ ID No. 1的胺基酸和胺基酸位置。附圖

圖1表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有Ν384 1取代的BMP2 對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質； (B)顯示量化結果。圖2表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有S306E+N341T取代的BMP2對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質；(B)顯示量化結果。圖3表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有P318K+N341K取代的BMP2對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質；(B)顯示量化結果。圖4表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有N341T+N384YH取代的BMP2對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質；(B)顯示量化結果。圖5表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有N341K+N384YH取代的BMP2對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質；(B)顯示量化結果。圖6表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有 S306E+N341T+N384ra取代的BMP2對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質；(B)顯示量化結果。圖7表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有S306E取代的BMP2 對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質； (B)顯示量化結果。圖8表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有P318K取代的BMP2 對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質； (B)顯示量化結果。圖9表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有N341T取代的BMP2 對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質； (B)顯示量化結果。圖10表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有N34IK取代的BMP2對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質； (B)顯示量化結果。圖11表示chMM實驗中，在存在或不存在Noggin的情況下，具有V38IT取代的BMP2 對軟骨形成的影響；(A)表示在雞微團中阿爾辛藍染色的間質前體細胞的軟骨胞外基質； (B)顯示量化結果。圖 12 表示具有單取代的 BMP2 變體(S306E、P318K、N341T、N341K、V381T 和 N384YH) 與具有兩個或更多個取代的BMP2變體(S306E+N341T、P318K+N341K、N341T+N384YH, N341K+N384YH、S306E+N341K+N384YH)的效果的定量比較。
實施例材料和方法通過比對蛋白資料庫(Protein Data Bank，PDB)中的人BMP2序列和N0G:BMP7結構(PDB 入口 1 M4U(PDB entry 1M4U))中的 BMP7 二聚體的同等物(coordinates)，模擬了 BMP2-N0G複合體的結構，其通過X射線晶體學來獲得(Groppe J，GreenwaldJ, Wiater E， Rodriguez-Leon J, Economides AN, Kwiatkowski W, Affolter Μ, Vale WW, Belmonte JC, Choe S.，2002，通過胱氨酸結蛋白頭蛋白抑制BMP信號的結構基礎(Structural basis of BMP signaling inhibition by the cystine knot protein Noggin).自然(Nature) 12 ； 420(6916) :636-42)。BMP2-BMPR1A-ACVR2 複合體也已獲得(PDB entry 2goo) (Allendorph GP, Vale WW, Choe S. 2006, TGF-β超家族成員三元信號複合體的結構(Structure of the ternary signaling complex of a TGF-beta superfamily member).美國禾鬥學院院幹丨J (Proc Natl Acad Sci U S A) 16 ； 103 (20) :7643-8)。分子結構圖由舊金山加利福尼亞大學嵌合體軟體包(UCSF Chimera package) (http://www. cgl. ucsf. edu/chimera/)產生。 Nog與I型和Il型受體結合位點已經使用PP_SITE(Gao Y, Lai U2004)用於分析蛋白-蛋白界面的基於結構的方法(Structure-based method for analyzing protein-protein interfaces).分子模型雜誌(J MoI Model) 10 :44-54)確定。我們使用雞微團培養系統來獲得BMP2變體的功能特徵。微團培養系統是軟骨形成的體外模型，允許在存在或不存在BMP抑制劑Noggin的條件下，篩選具有生物活性的 BMP2 或 BMP2 變體(Duprez DM, Coltey Μ, Amthor H, Brickell PM, Tickle C，1996，骨形成蛋白-2(BMPD在雞肢芽培養中抑制肌發育並促進軟骨發育(Bone morphogenetic protein-2(BMP-2)inhibits muscle development and promotes cartilage formation in chick limb bud cultures).發育生物學(Dev Biol). 15 ； 174(2) :448-52)。人BMP2的編碼序列(cds)使用5'-相容的Ncol-懸突和BamHI位點克隆進穿梭載體pSLAX-13 (Morgan ΒΑ, Fekete DM.，1996，用可複製逆轉錄病毒操縱基因表達 (Manipulating gene expression with replication-competent retroviruses).細胞生物學方法(Methods Cell Biol.) 1996 ；51 :185-218)。通過使用下列的誘變引物對，體外誘變人BMP2 pSLAX13載體生產BMP2的變體V381T_fwd ctgtaccttgacgagaatgaaaaggttacgttaaagaactatcaggacatggttgtg (S EQ ID NO. 20)V381T_rev cacaaccatgtcctgatagttctttaacgtaaccttttcattctcgtcaaggtacag (SEQ ID NO. 21)S306E_fwd ccctttgtacgtggacttcgaggacgtggggtggaatgact(SEQ ID NO. 22)S306E_fw agtcattccaccccacgtcctcgaagtccacgtacaaaggg(SEQ ID NO. 23)P318K_fwd ctggattgtggctcccaaggggtatcacgccttt(SEQ ID NO. 24)P318K_rev aaaggcgtgataccccttgggagccacaatccag(SEQ ID NO. 25)N341K_fwd gctgatcatctgaactccactaagcatgccattgttca(SEQ ID NO. 26)N341K_rev tgaacaatggcatgcttagtggagttcagatgatcagc(SEQ ID NO. 27)N341T_fwd gatcatctgaactccactcatgccattgttcag(SEQ ID NO. 28)N341T_rev gtctgaacaatggcatgagtagtggagttcagatga(SEQ ID NO. 29)N384YH_fwd gaatgaaaaggttgtattaaagtaccactatcaggacatggttgtggagg (SEQ ID NO. 30)N384YH_rev cctccacaaccatgtcctgatagtggtactttaatacaaccttttcattc(SEQ ID NO. 31)獲得的含突變的人BMP2的載體轉化入化學感受態E. coli ToplO細胞中，通過測序挑選陽性克隆。插入物通過CIaI亞克隆到禽特異逆轉錄病毒載體RCASBP-A(Morgan ΒΑ, Fekete DM. ,1996, Manipulating gene expression with replication-competent retroviruses. Methods Cell Biol. 1996 ;51 :185—218)。雞 Noggin 的 cds 通過 Ncol-相容的5'懸突和BamHI先克隆到穿梭載體pSLAX_13，並藉助CIaI亞克隆到RCASBP-B，使得 BMP2和Noggin在相同細胞中共感染。為了生產病毒，雞成纖維細胞系DF-I在37°C生長至覆蓋(confluence) 70%時，根據製造商的說明，用3yg RCAS構建體和ΙΟμΙ ExGene 500 (Fermentas)轉染。細胞使用 DF-I標準培養基(lg/L葡萄糖、不含(w/o) L-Gln的DMEM ；10%胎牛血清(FCS) ；2% CS ；2mM L-Gln，青黴素/鏈黴素)傳代多次，直到Φ 15cm的6孔細胞培養板100%覆蓋。隨後，培養基換成DF-I飢餓培養基(lg/L葡萄糖、不含(w/o)L-Gln的DMEM ；1%FCS ；0. 2% CS ；2mM L-Gln,青黴素/鏈黴素)，使得病毒顆粒在培養基中累積。連續3天，收穫含有病毒顆粒的上清，在液氮中冷凍，並在-80°C保存，直至進一步處理。冷凍的上清在37 V解凍，並在冰上用0. 45 μ m Durapore濾器(密理博 (Millipore))過濾。隨後，通過在 4°C 以 22000rpm(Rotor Sff-32, Beckman)超速離心 3 小時，病毒顆粒成球狀沉澱(pellet)。棄去上清，並通過在冰上搖動1小時重新懸浮剩餘培養基中的小球。最後，病毒在液氮中冷凍，並在_80°C保存。通過以7. 6xl04細胞/孔的密度在M孔培養皿板上接種DF-I細胞，並且培養至 70-80%覆蓋，來測定病毒的滴度。將濃縮的病毒上清從1χ10_3至1χ10_6稀釋，所述稀釋液以1 μ 1/孔和10 μ 1/孔分別感染DF-I細胞。被RCAS病毒感染的細胞用單克隆抗體3C2 和Vectastain ABC試劑盒(Vector Laboratories he.)標記，並確定各病毒的感染單位數目。在存在或不存在Noggin的條件下，病毒用來與BMP2或BMP2變體共感染雞微團培養物。受精的雞蛋獲自Tierzucht Lohmann(德國Cuxhafen)，在加溼雞蛋孵化器中37. 5°C 孵化4. 5天。分離漢堡/漢密爾頓階段M (Hamburger/Hamilton stage 24)的肢芽(limb bud)，並通過在HBSS中與分散酶(dispase) (3mg/ml)孵育來去除外胚層。通過用0. 1% Ia型膠原酶和0. 胰蛋白酶消化，接著通過40 μ m濾器(BD Falcon)過濾細胞懸液，將細胞從所述肢芽中分離出來。微團培養物以每10 μ 1 2X IO5細胞的接種密度滴於M孔組織培養板的中心。在細胞鋪板前加入濃縮的複製型禽肉瘤(RCAQ病毒上清含有野生型人ΒΜΡ2 或ΒΜΡ2變體cds的RCASBP-A以及含有野生型雞Nog cds的RCASBP-B直接進行感染。細胞允許在37°C，5% CO2，加溼的環境中貼附濁，隨後補充培養基(DMEM-F12、10%FBS、0. 2% 雞血清、4mM L-Gln、青黴素/鏈黴素)。每2天更換一次培養基。5天後，在用凱氏固定液 (Kahles fixative) (28. 9% (ν/ν)乙醇、0. 37% 甲醛、3. 9% (ν/ν)乙酸)固定，且用 IN HCl 中0. 05%的阿爾辛藍染色後，通過將阿爾辛藍摻入胞外基質，其產生反應富含蛋白聚糖的軟骨基質，微團培養物被染色。染色的量化通過在室溫下用6Μ鹽酸胍過夜提取實現。在 OD 595nm下通過分光光度計測定染色濃度。對了比較不同實驗的結果，在每個數據集中， 未與Noggin共轉染的野生型hBMP2的值標準化為1。在存在或不存在Noggin的條件下， 不同變體和對照的測定數據與該值相關聯。對於每個條件平行進行了 4個重複(Seemarm P, Schwappacher R, Kjaer Kff, Krakow D, Lehmann K, Dawson K, Strieker S, Pohl J, Pl omicronger F, Staub Ε, Nickel J, Sebald W, Knaus P, Mundlos S. 2005，在 GDF5 的受體相互作用位點激活和滅活突變引起A2型指關節粘連或短指(Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2.)，臨床研究雜誌(J Clin Invest.) 115(9) :2373-81)。結果對預測的BMP2-N0G複合體的分析表明，BMP2中的下列胺基酸位置對於NOG抑制 BMP2 是必需的D304、S306、N311、D312、V315、A316、P318、G319、D335、N341、S370、E376、 V381、K383、N384。我們使用 FoldX 算法(Guerois R, Nielsen JE, Serrano L(2002)蛋白質和蛋白質複合物的穩定性中的預測變化超過1000突變的研究(Predicting changes in the stability of proteins and protein complexes -.a study of more than lOOOmutations.)分子生物學雜誌(J MoI Biol) 320 :369-387)進行矽片上的誘變(in silico mutagenesis)，來識別降低了 BMP2與Nog的結合親和力，而同時僅僅微弱影響BMP2 與其受體結合的BMP2胺基酸取代。我們發現了以下在上文提及位置的胺基酸取代D304(SEQ ID No. 1 的 D22)D304是NOG中的R210可能的相互作用對象。這些胺基酸取代可能阻止側鏈的結合。BMP7在同源位置具有絲氨酸，且由於NOG能夠與BMP7結合，認為D304S對於BMP2-N0G 複合體僅有微小的影響。理論分析預測的BMP2-N0G複合體給了該方向的暗示胺基酸取代為精氨酸或組氨酸，與D304S相比，更加降低複合物的穩定性。因此，優選的取代是D304R/ D304S/D304H。S306 (SEQ ID No. 1 的 S24)S306在BMP2-N0G模型中匹配且朝向D304和N311。所述三個側鏈均能與R210相互作用。另外，環307-311通過所述側鏈的匹配(coordinate)而穩定。該環，尤其是W210， 對於BMP2-BMPRla的相互作用是重要的。因此，該環的改變將幹擾1型受體結合。在BMP7 中的同源位置是精氨酸，其與BMP7:N0G複合體中的Q318形成氫鍵。該相互作用似乎對 BMP-NOG接觸位點是重要的。由於BMP2在318位置具有脯氨酸，BMP2-N0G複合體中相似的相互作用是不可能的。所有提出的胺基酸取代都可能阻止BMP2變體與NOG在該位置的任何相互作用。因此，優選的取代是S306G/S306H/S306E。N311 (SEQ ID No. 1 的 N29)N311，與D304和S306相似，靠近R210。其突變為蘇氨酸應阻止與Nog的相互作用，但是將保持W310的必要的定向，這對於BMP2和BMPRlA的相互作用是重要的，原因在於結合於S306的氫鍵。因此，優選的取代是N311T。D312(SEQ ID No. 1 的 D30)D312可能與NOG的Q208相互作用，取代為丙氨酸或蘇氨酸可能阻止該相互作用。 因此，優選的取代是D312A/D312T。V315(SEQ ID No. 1 的 V33)V315連同L372和A316形成了對NOG和ACVR2的疏水接觸面。突變為精氨酸應允許結合2型受體，但是阻止了 NOG的結合。精氨酸將與ACVR2的T63相互作用，但是NOG的 R204將導致位阻。因此，優選的取代是V315R。A316(SEQ ID No. 1 的 A34)A316 連同 L372、V315、P317、P318 和 L382 形成了對 NOG 的 L46 和 ACVR2 的 W79 的疏水接觸位點。A316胺基酸取代為酪氨酸或天冬氨酸應對BMP2與NOG或ACVR2的相互作用產生負面影響，但是A316Y不如A316D突變顯著。因此，優選的取代是A316Y/A316D。P318(SEQ ID No. 1 的 P36)P318以及P317是主肽鏈的重要殘基，尤其對於向ACVR2和NOG接觸位點的彎曲。 這個位點的每個胺基酸取代應對NOG和2型受體的結合產生負面的影響。取代為賴氨酸、 精氨酸或絲氨酸將能具有最強的負面影響。因此，優選的取代是P318K/P318R/P318S。G319(SEQ ID No. 1 的 G37)G319對於主鏈向其曲面的接觸位點的彎曲是重要的。突變為蘇氨酸將幹擾主鏈的彎曲，從而以負面的方式間接影響BMP2與2型受體或NOG的相互作用。直接影響是不可能的，因為側鏈指向受體的相反方向。因此，優選的取代是G319T。D335(SEQ ID No. 1 的 D53)D335側鏈通過NOG N-端的M27和Y30與NOG的主鏈直接接觸。D355建立了結合 BMPRlA的T78的氫鍵。胺基酸取代為酪氨酸應對與NOG的相互作用的影響將大於與BMPRlA 的相互作用。因此，優選的取代是D335Y。N341 (SEQ ID No. 1 的 N59)N341對於BMP2 二聚體的穩定性以及BMPRlA的接觸位點是重要的。N341通過朝向主鏈的雙氫鍵指向NOG的N-末端穴。該相互作用被胺基酸取代為賴氨酸或蘇氨酸所阻止。所述穩定性降低效應對與NOG的結合的影響將大於與BMPRlA的結合。因此，優選的取代是 N341K/N341T/N341V/N341E。S370 (SEQ ID No. 1 的 S88)S370構建了結合ACVR2主鏈的L80或NOG的V44的氫鍵。此外，它匹配S370N384 的側鏈，並且參與NOG的N-端臂的排列。胺基酸取代為丙氨酸不影響ACVR2的相互作用， 因為符合疏水相互作用。另一方面，丙氨酸取代將能影響NOG N-端臂的排列(alignment)， 且因此幹擾BMP2-N0G結合。因此，優選的取代是S370A。E376 (SEQ ID No. 1 的 E94)
E376可能構建了與NOG的R34和Q28結合的氫鍵，其穩定了 NOG的N末端臂。 E376可能也構建了與BMPRlA的Kill和R126結合的氫鍵(其未見於BMP2-RI/RII模型)。 因此，提出胺基酸取代為脯氨酸對於BMPRlA相互作用僅有微小的效果，但是同時幹擾主鏈 (374-377)的環，從而降低NOG的N-端臂的穩定性。因此，優選的取代是E376P。V381 (SEQ ID No. 1 的 V99)V381側鏈僅在BMP2單體內相互作用。但是其主鏈處於對NOG與β - β主鏈相互作用而言最優的位置。因此，提出胺基酸取代為蘇氨酸或酪氨酸應能干擾主鏈的幾何形狀， 減弱NOG和ΒΜΡ2的相互作用。因此，優選的取代是V381T/V381Y。Κ383 (SEQ ID No. 1 的 Κ101)Κ383能間接影響Ν341(ΒΜΡ2)和E104(R1)的定向與結合。K383具有與D39相互作用的側鏈，且因此影響NOG的N-端臂。突變為異亮氨酸或亮氨酸應能阻止這種相互作用， 而不影響BMPRlA相互作用。因此，優選的取代是K383I/K383L。N384 (SEQ ID No. 1 的 N102)NOG的N-端臂覆蓋N384。BMP9在此具有額外的胺基酸，以便NOG N-端臂的剪切失去作用。這被認為是BMP9不被NOG抑制的主要原因之一。因此，我們將所述BMP9序列中的酪氨酸和組氨酸類似物引入BMP2。胺基酸取代為絲氨酸、纈氨酸或色氨酸，阻止了結合NOG的氫鍵，因此也幹擾BMP2-N0G的結合。因此，優選的取代是N384YH/N384S/N384V/ N384W。NOG在BMPs中具有大的接觸位點，因為其為了抑制BMP活性，需要阻止兩對受體結合位點。我們認為單胺基酸取代的影響僅僅是微小的(marginal)，需要同時結合兩個或更多個胺基酸取代，以獲得具有完全的Noggin不敏感性的BMP2變體。使用雞肢芽微團系統在體外系統定義的孔中分析hBMP2變體誘導軟骨產生的功能能力，獲得了概念的證據(圖1-12)。通過在胞外基質中加入阿爾辛藍，測定了富含蛋白聚糖的軟骨基質的產生。因此，在雞微團中的間質前體細胞的軟骨細胞分化能夠可視化和量化。因而hBMP2變體誘導軟骨細胞的潛力得到有效地測試。用表達hBMP2的病毒逆轉錄感染微團培養物，來表達野生型蛋白或其變體。當進行變體對拮抗劑的敏感性測試時，同時，Noggin在細胞中共表達。經過5天的培養後，雞微團培養物用阿爾辛藍染色。如預期的那樣，與非感染對照細胞相比，野生型hBMP2感染雞微團細胞導致大量誘導產生軟骨。然而，當Noggin共表達時，野生型則完全被阻止。像野生型一樣，在沒有Noggin的情況下，所有變體都能夠有效誘導軟骨形成。唯一的例外是含有N384YH取代的變體，其與對照相比沒有誘導軟骨形成。此外，除具有P318K 的變體之外，沒有一個單突變能夠誘導出Noggin抗性。該點突變導致對拮抗劑的一些抗性。然而，兩個或三個單突變的組合則導致了 Noggin抗性的顯著增強。這尤其可以在變體Ν341Τ+Ν384ΥΗ、Ν341Κ+Ν384 1和Ρ318Κ+Ν341Κ中觀察到。當它們與Noggin共表達，且其成軟骨能力是不存在拮抗劑的情況下，野生型活性的50% -75%。含有S306E+N341T和 S306E+N341K+N384YH取代的變體與單突變Ρ318Κ的Noggin抗性相當。它們顯示出與觀察到的野生型單轉染相比大約三分之一的活性。
總之，本申請表明兩個或三個特定的點突變的組合顯著地增強了 hBMP2的Noggin 抗性，引起了甚至在其主要的拮抗劑存在下的成軟骨效應。
權利要求
1.分離的肽，其包含具有與具有SEQID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列或由具有與具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列組成，其特徵在於，所述的胺基酸序列包含至少兩個胺基酸取代，其中第一胺基酸取代發生在相應於SEQ ID No. 1的N59、S88、E94、V99、KlOl和/或附02的位置。
2.根據權利要求1所述的分離的肽，其特徵在於，所述的第一胺基酸取代選自N59K、 N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YH。
3.根據權利要求1或2所述的分離的肽，其特徵在於，所述分離的肽包含第二胺基酸取代，其中所述的第二胺基酸取代不同於所述的第一胺基酸取代，並發生在相應於SEQ ID No.1 的 D22、S24、V26、N29、D30、V33、A34、P36、G37、H39、F41、H44、P48、A52、D53、L55、N59、 S88、E94、V99、KlOl 和 / 或 N102 的位置。
4.根據權利要求3所述的分離的肽，其特徵在於，所述的第二胺基酸取代選自D22R、 D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、S24Q、V26L、N29T、N29Q、D30A、D30T、V33I、V33R、A34Y、A34D、 P36K、P36R、P36S、G37T、H39A、F41N、H44D、P48S、A52N、D53A、D53Y、L55M、N59K、N59T、N59V、 N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YH。
5.根據權利要求3所述的分離的肽，其特徵在於，所述第二胺基酸取代發生在相應於 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、KlOl 和 / 或附02的位置。
6.根據權利要求3或5所述的分離的肽，其特徵在於，所述的第二胺基酸取代選自 D22R、D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、P36S、 G37T、D53Y、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、 N102W 和 / 或 m02YH。
7.根據權利要求5所述的分離的肽，其特徵在於，所述的胺基酸序列包含其他的胺基酸取代，優選地所述胺基酸序列包含3或4個胺基酸取代。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的分離的肽，其特徵在於，所述的分離的肽包含具有與具有SEQ ID No. 11的全長人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列或者由具有與具有SEQ ID No. 11的全長人BMP2相比至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列組成。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的分離的肽，其特徵在於，所述的分離的肽顯示 BMP2活性。
10.分離的核酸，其特徵在於，所述的分離的核酸包含i)編碼權利要求1-9中任一項所述的肽的核酸序列；或 )在標準條件下與編碼權利要求1-9中任一項所述的肽的核酸雜交的核酸序列。
11.表達權利要求1-9中任一項所述的分離的肽的轉基因生物或細胞，其特徵在於，所述的生物或細胞包含權利要求10所述的分離的核酸。
12.權利要求1-9中任一項所述的分離的肽和/或權利要求10所述的分離的核酸用於治療BMP相關的疾病或病症，其中所述疾病或病症包含骨、軟骨、非礦化骨骼或結締組織的形成，代謝性疾病，在諸如破裂、骨折和/或撕裂的損傷部位處的骨和/或軟骨更換或修復，牙周組織再生，肝再生，慢性腎功能衰竭，促進中樞神經系統缺血或外傷後功能恢復，樹枝狀生長，神經細胞粘連，帕金森症。
13.包含權利要求1-9中任一項所述的肽和/或權利要求10所述的分離的核酸以及至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。
14.權利要求1-9中任一項所述的肽和/或權利要求10所述的分離的核酸在藥物製備中的應用。
15.根據權利要求14所述的應用，其特徵在於，所述藥物用於治療BMP相關的疾病或病症，其中所述疾病或病症包含骨、軟骨、非礦化骨骼或結締組織的形成，代謝性疾病，在諸如破裂、骨折和/或撕裂的損傷部位處的骨和/或軟骨的更換或修復，牙周組織再生，肝再生， 慢性腎功能衰竭，促進中樞神經系統缺血或外傷後功能恢復，樹枝狀生長，神經細胞粘連， 帕金森症。
全文摘要
本發明涉及包含具有與具有SEQ ID No.1的成熟人BMP2相比至少90％胺基酸同一性的胺基酸序列或由具有與具有SEQ ID No.1的成熟人BMP2相比至少90％胺基酸同一性的胺基酸序列組成的分離的肽以及其應用，其特徵在於，所述的胺基酸序列包含至少兩個胺基酸取代，其中第一胺基酸取代發生在相應於SEQ ID No.1的N59、S88、E94、V99、K101和/或N102的位置。
文檔編號C07K14/51GK102369212SQ201080011605
公開日2012年3月7日 申請日期2010年3月11日 優先權日2009年3月12日
發明者卡斯滕·賴斯納, 尤利婭·齊默爾, 彼得拉·澤曼, 斯特凡·蒙德洛斯, 格奧爾格·杜達 申請人:生物技術拉比特有限公司