生物表面結構陣列的製作方法

2023-09-11 15:41:05

專利名稱：生物表面結構陣列的製作方法
技術領域：
本發明涉及鑑定和分析生物相容材料和結構，特別是那些影響細胞 功能的材料和結構，所述細胞功能比如直接細胞生長、擴增、分化、去 分化、礦化、細胞內或細胞間結構化等。
背景技術：
用於高通量篩選的生理相關的細胞培養模型構成了許多人類疾病 治療改進的一個主要瓶頸。 一些生理和病理-生理狀態可用三維細胞或 組織培養物再現，但它們在高通量環境中定量讀取方面並非最理想的。
許多針對特化細胞類型的二維培養系統依賴於與飼養層細胞的共培養， 其主要缺陷是不方便和不可再現性。因此，對於許多生物技術分析，特 別是對於細胞置換以及候選藥物的篩選和驗證來說，非常希望在基底上 固定、分離、擴增、分化和培養活細胞。表面可附著細胞的微晶片有助 於同時高通量篩選很多候選藥物。候選藥物調節給定疾病狀態中所涉及 的生化或生理途徑的能力可用其上選擇性固定或附著細胞的微晶片進 行檢測。
美國專利申請US2004/0053334A1描述了一種基底，其包括含有加 熱器的第一層和以兩種狀態存在的第二溫度響應層，由此當溫度低於其 "較寸氐溫度溶液狀態(lower temperature solution state, LCTS )，，時其表 現出非細胞結合狀態，而在被加熱至超過其LCTS時其表現出細胞結合 狀態。
外科治療經常需要引入植入物，例如假體和可植入裝置，其中克服 機體自身排斥機制和支持組織再生的需要是難以完成的挑戰。因此植入
的臨床成功可依賴於植入物和宿主組織之間界面鄰近區域的細胞行為。
此領域進展的一個關鍵要素在於鑑定和使用用於加工這些裝置的生物
相容材料。
Chesmel and Black (1995) J Biomedical Materials Res. 29:1089-1099,描述了一種體外檢測系統，用於檢測細胞對聚苯乙烯組織培養表 面的化學和形態變化的反應。該系統提供9個在由澆鑄於微加工矽晶片 上的聚苯乙烯(具有不同的苯乙烯單體含量)形成的模型生物材料表面， 該表面具有不同深度的(無；0.5-，或0.5卞M)放射狀表面溝槽。Turner 等(1997 ) (/ , T^/i/io/ B15:2848-2854 )描述了玟理化(textured ) 矽表面對來自中樞神經系統的星形細胞附著的影響，其中應用了具有由 交替排列成行的矽草(silicon grass )和溼獨刻表面組成的兩種表面故理 的矽基底。
在對改進的生物相容材料和結構的持續探尋中，仍然需要一種高通 量篩選工具用於鑑定對特定類型的細胞或組織最優的結構和表面。

發明內容
為滿足上述的和其他的需求，本發明提供了一種包括生物表面結構 陣列(biosurface structure array, BSSA )的篩選工具，該陣列包含一定 數目的測試區域，由此每個區域具有表面拓樸納米和/或微米尺度特徵。
本發明基於如下認識，細胞功能如直接細胞生長、擴增、分化、去分 化、礦化、細胞內或細胞間結構化等都強烈地受細胞的微環境所影響。不 受理論的限制，特定細胞類型在體內和體外的增殖和分化被認為可能依賴 於提*適的可附著細胞的結構，如與自然界中可見結構不相似的完全人 造的結構，或具有才莫擬期望類型細胞或組織自然環境的表面特性的結構。 本發明尤其是認識到在細胞的微環境中，表面的二維和三維結構或拓樸是 決定細胞生長和分化的關鍵因素。不同細胞類型的體內增殖和分化的不同 微環境有極大的數量，因此確定促進任何特定細胞類型生長的特定微環境 是困難的和耗時的。
所以需要一種高通量篩選工具用於測試細胞培養的不同微環境，特 別是測試具有不同表面拓樸的結構。製造合適的結構如模擬自然中所見 表面構造的人造結構，需要能夠定義微米尺度或納米尺度之特徵的技 術。本發明利用在納米技術中開發的工具，其允許設計和建造具有小至 約5nm的側向特徵尺寸的表面構造的結構。特別是這些技術的應用允 許製造不同表面拓樸的巨大陣列，其中每種拓樸被精確地定義，由此任 何選定的拓樸都可精確地在以後的相關應用中再現。
本發明提供包括位於單個結構如晶片(wafer )上多個測試區域的生 物表面結構陣列。為了使晶片單位面積上測試區域的數目最大化，並由
此增加其作為篩選工具的效率，使每個測試區域的尺寸最小化將會比較 理想。基於如下認識，即體內的個體細胞在微米和納米結構水平看待其 周圍組織構造，本發明的實施方案提供一種應用於篩選目的的二維平臺 上對這種微米和納米結構的再現。鑑定非常適於獲得確定類型細胞之二 維層的表面結構或者最終地最好支持藥物攝入所述細胞的結構，將基於 在具有表面結構陣列(或梯度)的晶片上的高通量篩選。
根據一個方面，測試區域所需最小尺寸的一個關鍵決定因素是為實 現統計學顯著的篩選檢驗所需的細胞數目，以及每個測試區域可容納的
細胞數目。已經證明，在以下條件下達到統計學顯著的篩選結果每個 測試區域的面積至少為0.0625 mm2，其中一個線性維度至少為250 nm， 相當於5個直徑50樣i米的細胞，由此避免在測試區域邊界的邊緣效應 具有統計學顯著的影響。具體來說，接近或位於測試區域周緣的細胞的
附著受這些細胞對該測試區域和鄰近測試區域各自拓樸結構的親和力 差異的影響。因此，細胞對任一鄰近區域的附著受細胞從一個測試區域 到另 一個測試區域遷移的影響。通過適當地選擇每個測試區域尺寸的低 限，可以防止這種邊緣效應對篩選結果產生統計學顯著的影響。細胞截 面尺寸與測試區域表面積的比優選應不小於1/25，以便允許測試區域容 納5x5個細胞的陣列，即有3x3個細胞位於內部而沿周緣有一行細胞。
根據另 一個方面，用於篩選細胞的生物表面結構陣列包含多個測試 區域，其中每個測試區域具有暴露於所述細胞的表面，其中所述表面具 有預定的周期性拓樸結構。當該拓樸結構沿一個或多個側向例如一個或 多個平行於該測試區域各邊緣的方向為周期性時，該結構在整個測試區 域內具有高度的均勻性，由此增加篩選結果的再現性。此外，周期性結 構可由少量參數加以定義/分類，由此可進行系統性比較和高度重現性。 在一些實施方案中，測試區域沿一個所述側向的截面可用一個周期函數 來描述。
BSSA化學組成的描述
生物表面結構陣列的實施方案包括基底層例如晶片形式，以及任選 地表面層。
當基底層為矽例如矽晶片形式時，可以利用現有的產生圖案化表面 結構的製造技術。其他適合於製備所述生物表面結構陣列的基礎材料包 括任何半導體(摻雜的或未摻雜的)、單種金屬、合金、陶瓷、聚合物、
共聚物、複合材料、藥物遞送系統例如具有生物活性分子的聚合物、其 他生物活性化合物或它們的任何組合。
在本發明的實施方案中，表面層包含支持來自待培養細胞的適當反 應的材料。更具體而言，所述材料需要合適程度的生物相容性。
表面層的實例包括金屬表面沉積物，例如鉭、鈦、Ti-Al-V合金、 金、鉻、金屬氧化物、半導體氧化物、金屬氮化物、半導體氮化物、聚 合物、生物聚合物、或其它合金。
在一些實施方案中，生物表面結構陣列包括另外的成分，如一種或 多種沉積於所述陣列的表面層上的生物活性化合物，例如包含多肽的聚 合物，吸附的生物活性聚合物或化合物等。例如，所述聚合物可以選自 抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、 RNA、多糖、脂質、有機化合物、 無機化合物。
BSSA的結構性質
晶片的表面被分為多個測試區域，即晶片全部表面區域的多個亞區 域(sub-areas )。每個測試區域的表面包括在測試區域表面平面內沿一 維或兩維的規則的納米或微米尺度結構。具有一維納米或微米尺度特徵 的結構的實例包括在縱向上延伸跨測試區域全長並且在側向具有納米 或微米尺度維度的特徵。二維結構的實例包括這樣的結構，其包括在測 試區域所限定平面內兩個方向上具有納米或微米尺度維度的特徵。
所述拓樸結構是規則的，即該結構包括按照預定的有序的、非隨機 圖案安排的特徵，由此確保篩選結果的重現性。另外一個優點是微米和 /或納米尺度的規則的拓樸結構可通過已知生產技術重複性製造，這些 已知才支術比如光刻(photolithography )、 電子束光刻(e-beam lithography )、 熱壓印(hot embossing )、 納米壓印光刻(nano imprint lithography )、孩吏接觸印刷(microcontact printing),聚焦粒子束蝕刻 (focussed ion beam etching)等。可涉及製造所述生物表面陣列的其他 製備步驟的實例包括化學蝕刻、雷射燒蝕(laser ablation )、等離子噴 塗、磨料噴射(abrasive blasting )、雕刻(engraving )、刻劃(scratching )、 微加工(micro machining )等。
當拓樸結構為沿著一個或多個側向(例如一個或多個平行於該測試 區域各邊緣的方向)的周期性結構時，該結構在整個測試區域內具有高度的均勻性，由此增加篩選結果的再現性。此外，周期性結構可由少量 的參數加以定義/分類，由此可進行系統性比較。在一些實施方案中， 測試區域沿一個所述側向的截面可用周期性函數描述。
本文中的術語"納米尺度"意指在約1納米至約1000納米範圍內的 長度尺度，特別是在約1納米至約100納米範圍內的長度尺度。本文中 的術語"微米尺度"意指在約l微米至約1000微米範圍內的長度尺度。
在本發明的實施方案中，拓樸特徵在至少一個側向的側向尺度是在
1-105納米區間內，例如l-2納米、2-4納米、4-10納米、10-100納米、 100-1000納米、1-2微米、2-4微米、4-10微米、10-100微米。
在一些實施方案中，特徵的尺度在不同測試區域之間有變化，即一 些測試區域具有納米尺度(即1-1000納米之間)的特徵，而另一些測 試區域具有微米尺度(即1-1000孩￡米之間)的特徵。類似地，每個測
試區域可包含不同尺度的特徵，例如在一個方向上具有小周期而在另一
方向上具有較大周期(例如大IO、 100或1000倍)的結構。在一些實
施方案中，結構甚至可以在同一方向上具有不同尺度的特徵，例如小尺 度特徵疊加於大尺度特徵上。例如，具有本文所述的規則的納米或微米 尺度結構的測試區域的晶片可以隨後加工從而將不規則/隨機的結構置
於一些或全部測試區域的表面上，例如，如Turner等(1997)(同上) 描述的所謂的矽草(silicon grass )結構。
所述特徵的深度/高度，即它們在突出測試區域表面之外方向上的線 性尺度可以相似地是納米或微米尺度，即該結構的高度/深度可以在1 納米至1000微米範圍內。在一些實施方案中，該結構的高度/深度大於 0.6微米，優選地在1.2微米至1000.0微米之間，以及更優選地至少1.2 微米、2.0孩吏米、5.0樣吏米、IO微米、20孩i米、50^t米、IOO孩吏米或1000 微米。
在一些實施方案中，所述結構還可包含沿著突出於表面之外方向上 的圖案。例如，突出的表面可以通過化學或其他工藝(例如化學蝕刻工 藝)加以結構化。
在一些實施方案中，所述周期性結構的周期小於所述測試區域的線 性尺度，例如所述測試區域的線性尺度是所述結構周期的整數倍。
在本發明的一些實施方案中，所述表面結構包括具有預定的側向尺
度和高度/深度的個體特徵，如突出、柱子、隆起、溝槽(channel)、凹 陷、孔洞等。作為替代，所述拓樸結構的特徵可以定義為所述周期性結 構的周期。因此，周期性結構的特徵的側向尺度可以定義為該周期性形 狀/函數的周期，即該結構重複其形狀的最短區間的長度。
每個所述特徵的側向截面可以具有適當定義之邊界和/或幾何形狀 的任何形狀，如正方形、矩形、六角形、多邊形、圓形、環形等，或其 組合。所述特徵的頂部和/或側部表面可以基本上是平的、彎曲的和/或 結構化的，例如通過化學或其他工藝進行修飾。不同的特徵可以具有相 同或不同的形狀。
在本發明的一些實施方案中，所述結構的最小側向/豎向尺度小於或
至少相當於暴露於該表面的生物體/細胞的線性尺度，使得該生物體將 經歷與其自身尺寸相比較小或至少相當的結構。
測試區域位於其上的晶片可以具有任何適當的尺寸，如2、 4、 6、 8、 12、 14或16英寸晶片，或更小或更大的晶片，由此提供不同尺寸的生 物表面結構陣列並允許平行篩選小的和大的多種不同結構。
測試區域可以具有任"f可幾何形狀，例如圓形或多邊形，如六邊形。 然而，矩形的測試區域，特別是正方形的測試區域是方^t的並可有效利 用晶片面積。正方形的測試區域還提供相對於測試區域面積較小的邊 界，同時還有效地利用了晶片的面積。因此，提供了大的有效篩選面積， 同時限制測試區域邊緣的邊界效應。
測試區域可以在每個側向上具有相同或不同的尺寸。在本發明的一 些實施方案中，測試區域在每個方向上的尺寸是至少0.25mm，優選地 至少0.3mm,更優選地至少0.5mm，最優選地至少lmm,例如在0.25mm 至25mm區間內，優選地在0.3mm至20mm之間，更優選地在0.5mm 至10mm之間，最優選地在lmm至5mm之間，例如所述測試區域可 以是正方形，尺寸為約2mmx2mm、 5mmx5mm 、 10xlOmm 、 或 0.25x0.25mm等。
在一個實施方案中，每個測試區域的尺寸在約2mmx2mm至約 10mmxlOmm之間，在一個標準4英寸晶片上提供約60至約1500個測 試區域。使用每個測試區域可潛在地容納約1600個細胞的2mmx2mm 測試區域，其一個優點是在篩選具有約50nmx50jim尺寸的細胞時可以 有較高的統計顯著性。
當表面面積至少是0.09 mmZ並且其中每個線性尺寸至少是300nm 時，至少約16個50nmx50nm尺寸的細胞可以容納在測試區域的內部 並被沿著測試區域邊緣的至少一排細胞環繞。因此，測試區域的大小足 夠為16個細胞提供統一的、沒有邊界效應的微環境。當表面面積至少 為0.1225 mn^並且其中每個線性尺寸至少為350 nm時，至少約9個 50fimx50nm尺寸的細胞可以容納在測試區域的內部並被沿著測試區域 邊緣的至少兩排細胞環繞，由此進一步地減少了邊緣效應的影響。或者， 當表面面積至少為0.1225 mm2並且其中每個線性尺寸至少為350nm 時，至少約25個50nmx50nm尺寸的細胞可以容納在測試區域的內部 並被沿著測試區域邊緣的至少一排細胞環繞，由此進一步地增加了可用 於分析的細胞的數量。
本發明的實施方案可通過不同方式實現，包括上述和隨後描述的生 物表面結構陣列、篩選生物相容表面結構的方法、進一步的產品手段、 及其一種或多種用途，每種方式都提供結合第一個所提及方面而描述的 利益和優點中的一種或多種，並且具有與結合第一個所提及方面而描述 和/或公開於從屬權利要求的實施方案相對應的一個或多個具體實施方 案。
具體來說，本發明還涉及包括本文所述生物表面結構陣列的試劑 盒。這樣的試劑盒可應用於以下一種或多種用途細胞附著測定、細胞 分化測定、細胞鋪展測定、細胞增殖測定。
適於細胞篩選的包含BSSA的試劑盒
適用於篩選晶片上表面結構的一種或多種細胞效應的包含BSSA的 試劑盒可以包括 一個或多個BSSA晶片，以及任選地可以包括標準細 胞培養基、無菌培養容器或其他標準培養用品、標準細胞、和/或螢光 染料標記的細胞等。優選地，通過選擇在一個或多個BSSA上測試區域 的大小使得每個測試區域可容納至少25個、優選地至少50個、更優選 地至少100個、最優選地至少1000個50nm尺寸的細胞或包含在試劑 盒中的細胞。
例如，這樣的試劑盒適合於測量兩種細胞類型的附著比率。因此， 在這個實例中，該試劑盒可包括或可用於篩選^J口螢光蛋白EYFP和 ECFP標記的細胞。所述螢光蛋白可在所述細胞中用標準的基因轉移技 術表達。另外，為便於監測兩種不同細胞類型的細胞數，所述螢光蛋白 可定位於核。
分析BSSA的設備
BSSA晶片篩選的結果可用包括通過顯微鏡進行光學檢查在內的多 種方法來分析。當顯微鏡位於能控制溼度、co2、溫度和/或其他參數的 培養箱中時，可提供一個受控環境以在BSSA上進行細胞培養。 一個適 於自動或至少半自動獲取篩選結果的設備的實施方案包括位於培養箱 中的顯微鏡、接受BSSA晶片的支持物、圖像記錄設備、和用於控制所 述晶片相對於光軸位置的控制單元。所述控制單元還適於控制顯微鏡以 獲取每個測試區域的一個或多個圖像。該控制單元還包括圖像處理單 元，其適合於接受和記錄圖像並對所接受圖像進行分析。例如，圖像分 析可以包括檢測不同螢光顏色的細胞和計算不同螢光顏色的細胞的數 量比。作為替代或除此之外，圖像分析處理可包括對被給定螢光顏色細 胞所覆蓋之測試區域的總面積的測量，或類似的圖像分析步驟。
包含BSSA的試劑盒在篩選測試中的應用
本發明還涉及一種篩選生物相容的表面結構的方法，其包括
(a)將本文所述的生物表面結構陣列與分離的細胞或生物在適合 所述細胞或生物維持和/或生長的條件下相組合。
使用這樣的BSSA技術能夠在一次單獨的實驗中通過單一或混合的 細胞培養物篩選大量的結構。本發明描述的生物表面結構陣列可以用於 測定位於BSSA晶片上一個個測試區域中的大量篩選參數，包括礦化、 細胞上分化標記、(增加的或減少的)細胞數、報告細胞中的基因誘導、 生物汙著(bio fouling )、特定細胞類型的附著和擴增等。
因此在一些實施方案中，所述方法還包括比較所述細胞或生物附著 至所述生物表面結構陣列之任一測試區域的頻率，由此確定所述不同測 試細胞的細胞對各自表面結構的附著的差異。在另一實施方案中，所述 方法還包括比較所述細胞或生物在所述生物表面結構陣列之任一測試 區域上的鋪展。在另一實施方案中，所述方法還包括比較附著在所述生 物表面結構陣列任一測試區域的細胞或生物的分化。
在一些實施方案中，所述方法還包括(a)在適合所述細胞或生物 維持和/或生長的條件下培養。
本發明描述的生物表面結構陣列可以用於檢測/測試培養大量細胞 或生物的不同微環境，所述細胞或生物包括細胞如動物細胞、植物細胞、 哺乳動物細胞、酵母細胞、真核或者原核細胞或生物等。
當測試區域的每個線性尺度大到足夠容納一行至少5個細胞，優選 地至少10個細胞，更優選地至少20個細胞時，該測試區域就大到足以 在內部區域中容納足夠大量的細胞，即與測試區域邊緣分開，以提供充 分統計相關的篩選參數結果。
本發明還涉及一種具有表面的生物相容材料，其中至少一部分所述 表面的特徵在於包含納米或微米尺度特徵的拓樸，該表面通過以上和隨
後描述的方法得到/可得到。
本發明還涉及一種包含本文所述生物表面結構陣列的晶片，以及這 樣的晶片在體外細胞生物測試中的用途。本發明還涉及包含這樣晶片用 於體外細胞生物測試的試劑盒。


以下本發明將更充分地結合實施方案和附圖加以說明，其中
圖l顯示生物表面結構陣列晶片的實例的頂視圖。
圖2顯示圖1中晶片沿線A-B的截面圖。
圖3顯示生物表面結構陣列晶片的另一個實例的頂視圖。
圖4顯示包含交替的寬X (微米)的槽和寬Y (微米)的脊的拓樸 結構的頂視圖(圖4a)和截面圖(圖4b)。
圖5顯示包含方形孔和預定節距(pitch distance )的拓樸結構的頂 視圖(圖5a)和截面圖(圖5b)。
圖6顯示包含由寬X(微米)的脊分隔開的尺寸為X(微米)xY(微 米)的矩形孔的拓樸結構的頂視圖(圖6a)和截面圖(圖6b, c)。
圖7顯示包含預定尺寸和預定節距的柱的拓樸結構的頂視圖(圖7a ) 和截面圖(圖7b)。
圖8顯示包含交替的正方形孔和柱的拓樸結構的頂視圖。
圖9顯示容納25個細胞的測試區域。
圖10顯示容納49個細胞的測試區域。
圖ll顯示具有圓柱的拓樸結構的實例的頂視圖。
圖12顯示用全細胞標記法標記的細胞的實例。
圖13顯示用核定位焚光蛋白標記的細胞的實例。
圖14顯示用於記錄篩選生物相容表面結構之結果的設備的示意框圖。
圖15舉例說明基因誘導測試的實例。
圖16顯示在BSSA晶片之參考表面上培養的胚胎成纖維細胞。
圖17顯示在具有"D2/4"表面結構的測試區域上培養的胚胎成纖維 細胞。
圖18顯示在具有"D2/4"表面結構的測試區域上培養的胚胎成纖維 細胞。
圖19顯示在具有"D2/10"表面結構的測試區域上培養的胚胎成纖維 細胞。
圖20顯示在BSSA晶片之參考表面上和在玻璃上培養的MC3T3細胞。
圖21顯示在具有"D2/4，，表面結構的測試區域上培養的MC3T3細胞。
圖22顯示在具有"D2/10，，表面結構的測試區域上培養的MC3T3細胞。
具體實施例方式
圖l顯示生物表面結構陣列晶片的實例的頂視圖。
所述BSSA晶片100包含60個測試區域。 一定數目的測試區域2 留作"空白"，即它們沒有被加工成具有結構化的表面。因此，測試區域 2的表面基本上是平的。因此，在每個使用所述BSSA篩選工具的平行
篩選測試中都固有地包括對照試驗。餘下的標註為Sl、 S2......S54的測
試區域包含如上所述分別結構化的表面。這些測試區域是尺寸為10mmxl0mm的正方形。
圖2顯示圖1中晶片的截面圖。圖2a顯示該晶片沿A-B線的整個 寬度上的截面圖。圖2b顯示其中一個測試區域之表面一部分的放大圖。 晶片l具有層狀結構，其包括圖案化的基底層21例如矽層，以及表面 層23。晶片表面被圖案化，例如通過光刻工藝來圖案化，以在各測試區 域Sl、 S2, ...， S54的表面上分別提供不同的圖案。該結構的深度/高 度為H。在光刻過程中，高度H可通過蝕刻過程來控制。圖案化的表 面覆蓋有二氧化矽薄層22,和/或不同生物相容材料的表面層23，所述 生物相容材料例如鉭或任何其他金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、金屬 碳化物、金剛石、金剛石樣碳、半導體、半導體氧化物/氮化物、絕緣 體、聚合物、共聚物。測試區域之間有沒有結構的"空白"邊界區域，即 邊界區域沒有加工為具有結構化的表面。在此情況下，空白邊界區域的 厚度為0.3mm。然而，該厚度可以大於或小於0.3mm。在一些實施方 案中沒有邊界區域，即結構之間可以相互直接接觸。空白邊界線可以幫 助視覺調整和識別所述結構。
應當注意的是，圖2是示意圖而未按比例繪製。具體來說，為了改 善可讀性，豎向尺度可能被誇大。
製造BSSA的方法
技術領域：
本發明描述的生物表面結構陣列可通過多種生產技術來製造。 BSSA製造工藝的實例包括一種或多種以下本領域已知的技術
光刻方法光刻是一種已知的方法，其中幾何形狀/圖案從光掩膜轉移 至待結構化的表面，如晶片的表面。具有最小側向特徵尺寸在約1微米 至100納米以下範圍的光刻i殳備是已知的。例如下文中描述了光刻工 藝S.M.Sze: Semiconductor Devices, Physics and Technology, 2nd Edition, John Wiley & Sons 2002, Chapter 12: Lithography and Etching; 和 Plummer, Deal, Griffin: Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000, Chapter 5: Lithography 。
電子束光刻原則上，電子束光刻可以按光刻中^f吏用光的完全相同的方 式進行光刻膠的膝光。電子束光刻具有高達約5納米的特別高的分辨 率。
(master stamp )在聚合物基底上壓印微米或 納米尺度的結構。該方法允許使用廣泛的聚合物材料，利用原模生產許 多完全圖案化的基底。熱壓印技術提供了一種低成本、高多樣性的製造 方法，可很好地適用於從研發應用到大恥漠生產中所用BSSA的製造。 極高度均勻的高深寬比可以在大尺寸晶片(如8英寸或12英寸晶片) 上的微米和納米尺度結構中實現。尺寸在20納米以下的特徵是可能的。 原模可以通過如電子束光刻等4支術製造。
其他涉及生物表面陣列生產的生產步驟或工藝的實例包括納米壓印光 刻、雷射燒蝕、化學蝕刻、等離子噴塗、磨料噴射、雕刻、刻劃、或微 加工等。
此外，BSSA的製造還可以包括修飾工藝，用於修飾測試區域的表 面結構，由此可篩選更大範圍的微環境。這種技術的實例包括但不限於 直接可適用於三維的拓樸修飾，比如各種噴射處理技術(blasting techniques )，如噴砂處理(sandblasting )、孩i噴射處理(microblasting ) 和噴玻璃珠處理(glassblasting )。這種修飾方法另外的實例包括化學修 飾，例如通過如蛋白質吸附、肽吸附、化學沉積、化學蝕刻、和/或電 化學沉積，在晶片的一個或多個方向上產生一種或多種梯度的方法。例 如，化學梯度可通過逐漸地把晶片浸沒在合適的溶液中產生。因此，在 單個晶片上可以篩選很多不同的結構，並且如果具有同樣結構的測試區 域沿化學梯度重複，則在變化的化學條件下篩選每種結構。從而有助於 高度平行地篩選不同的微環境。
實施例1
包含60個測試區域的4英寸BSSA晶片的製造和測試——篩選與骨細胞 相容的微結構
A. BSSA晶片的製造
厚度為525士25微米的單面拋光的矽晶片(4英寸)為生物相容材料 的製造提供了基層。該晶片是一種電阻率為1-20歐姆釐米的n-型晶片。 根據以下方案，通過標準的光刻技術和在SF6/02中放電的活性離子蝕 刻，將微米尺寸的圖案印在矽晶片的拋光面上。
1、所述晶片用緩沖的氫氟酸(BHF: BHF是一種溶液，其中濃HF( 49% )、 水、和緩衝鹽NH4F的比例約為1:6:4 )預蝕刻30秒，然後在N2氣流
下乾燥，以及
2、 然後在該晶片上旋塗一層1.5微米厚的光刻膠AZ5214, Hoechst Cdanese Corporation, NJ, US (其化學組成可參見由Hoechst Cdanese Corporation提供的材料安全數據表(MSDS))，並在約卯。C下預烘 焙120秒，以及
3、 塗覆有光刻膠的晶片在AL6-2型EVC光刻機中通過合適的掩膜用紫 外光(UV)膝光5秒，顯影50-60秒，然後在120°C下後烘焙1分鐘， 以及
4、 然後塗覆有光刻膠的晶片用BHF短暫地蝕刻約30秒而被圖案化，接 著在約0.30微米/分鐘的速率下接受活性離子蝕刻處理(RIE)，用丙 酮剝離光刻膠，隨後RCA清洗。該RCA清洗過程有三個依次應用的 主要步驟用5:1:1的H20:H202:NH4OH溶液(SCI)去除不溶性有 機汙染物；用稀釋的50:1的H20:HF溶液去除二氧化矽薄層，在該薄 層中可能積累了作為(I)之結果的金屬汙染物；以及用6:1:1的 H20:H202:HC1溶液(SC2 )去除離子或重金屬原子汙染物。
5、 圖案化的晶片然後通過幹法氧化具有20納米Si02層而鈍化，其在 1000°C下熱生長15分4中。
6、 通過'減射沉積在圖案化晶片上沉積250納米的鉭層。
圖3顯示如上製備的一個晶片的頂視圖。晶片1包括60個尺寸為 10mmxl0mm的測試區域，其中每個區域具有根據實施例1製備的特定 側向拓樸。每個晶片包括4個具有平坦表面的對照測試區域2，以及14 種不同側向拓樸中每一種的4個複本。根據這些定義的參數製備了一系 列晶片，其中側向拓樸的深度分別限定為0.07微米、0.25微米、0.60 微米、1.20微米、1.60微米。
每種特定的側向結構重複4次。圖3中，每個測試區域都被標記以 指示其拓樸表面結構，其中所述標記指示如下結構
"BL，，無結構，即基本上平坦的表面。
"AX/Y":圖4所示的線結構。該結構包括寬度為X (微米)的槽41 和寬度為Y (微米)的脊42。因此，圖4的線結構具有僅一維的微米 尺度特徵。在實施例1中，區域A2/2包括具有寬度2微米的槽和寬度
2微米的脊的線結構，區域A4/4包括具有寬度4微米的槽和寬度4微 米的脊的線結構，區域A10/10包括具有寬度10微米的槽和寬度10微 米的脊的線結構，區域A4/2包括具有寬度4微米的槽和寬度2微米的 脊的線結構，以及區域A10/2包括具有寬度10微米的槽和寬度2微米 的脊的線結構。
"BX/Y":圖5所示的方形孔結構。該結構包括尺寸為X (微米)xx
(微米)的方形孔/凹陷51,且節距為X+Y,即脊52的網的寬度為Y。 因此，圖5的結構在測試區域的表面平面中的兩個維度上都具有微米 尺度特徵。在實施例1中，區域B4/4包括尺寸為4微米x4微米和8 微米節距的方形孔，區域B10/4包括尺寸為10微米xlO微米和14微 米節距的方形孔，以及區域B15/4包括尺寸為15微米xl5微米和19 微米節距的方形孔。
"KX/Y":圖6所示的包含被脊分隔開的矩形孔/凹陷的結構。該結構 包括被寬度為X (微米)的脊62分隔開的尺寸為X (微米)xY (微 米)的矩形孔61。因此，區域K10/110包括被寬度為10微米的脊分 隔開的尺寸為10微米xllO微米的矩形孔。
"DX/Y":圖7所示的包含突^/柱的結構。該結構包括具有尺寸為X
(微米)xx (微米)的方形橫截面和節距X+Y的突^/柱71。因此， 區域D2/4包括具有柱尺寸為2微米x2微米的方形柱結構且節距為6 微米，以及區域D2/10包括具有柱尺寸為2微米x2微米的方形柱結構 且節距為12微米。
"CX":圖8所示的方形孔/柱結構。該結構外觀J象棋盤，具有孔81和 突^/柱82,並且二者均是尺寸為X (微米)xx (微米)的方形形狀。 因此，區域CIO包括方形的孑U柱結構，且孔和柱的尺寸均為10微米xl0 微米；區域C40包括方形的孑U柱結構，且孔和柱的尺寸均為40微米x40 微米；以及區域C90包括方形的孔/柱結構，且孔和柱的尺寸均為卯 孩吏米x卯微米。
應當理解，上述製備方法也可以用於具有其他形式和尺寸的測試區 域以及其他結構類型的晶片上。同樣的生產方法可用於各種不同的晶 片，其中測試區域的布局和具體表面結構可通過晶片曝光時所用的掩膜 來確定。
B.篩選BSSA晶片以鑑定用於骨細胞(成骨細胞)附著的生物相容材料
每個晶片都置於P15皿中(NUNC, Biotech line)並先後用70%乙 醇和PBS ( 6.8g NaCl, 0.43g KH2P04， 0.978g Na2HP04*2H20溶於1 升雙蒸水中， PH7.4)清洗。MC3T3-E1鼠成骨細胞系(Sudo， H et al. 1983， J Cell Biol 96(l):191-98 )的細胞以濃度20000細胞/cm2接種於所 述晶片。細胞在常規培養基(a-最小基本培養基[(i-MEM，10%胎牛血 清[FCS]， 100U/ml青黴素，和100微克/毫升鏈黴素(Gibco， Invitrogen 提供))中培養4天。細胞在增溼的培養箱中維持(5%<:02/95%空氣氣 氛，37。C)，隨後在生長培養基中加入50ng/ml抗壞血酸(Wako Chemicals, DE )和10mM (5-甘油磷酸(Sigma-Aldrich, DK)。每周兩 次更換培養基，培養細胞3周。
鼠成骨細胞在晶片測試區域上的生長
(a) 體外礦化培養3周後，通過用PBS清洗晶片和用70。/。乙醇在-20。C 固定晶片上的細胞l小時來測試每個培一中晶片上的礦化程度。然 後細胞用雙蒸水漂洗，接著用pH調節至4.2的40mM茜素紅S
(Sigma-Aldrich, DK)室溫(約20畫25。C )染色10分鐘。晶片用H20 進行後漂洗並在PBS中孵育15分鐘以減少非特異性染色。
(b) 可與鈣結合的茜素紅微弱地染色了所有的測試區域，但強烈地染色了 具有微結構D2/4的測試區域，這已被幾個獨立實驗中晶片上的細胞生 長所確認。D2/4具有二維的周期性結構，具有尺寸為2微米x2微米和 6微米節距的方形柱(如圖7所示)。
(c) 通過比較具有不同側向拓樸深度的晶片上的礦化，揭示出細胞培養中 礦化過程具有顯著的豎向尺寸依賴性。與其他測試區域相比，在測試
檢測到。在具有豎向尺寸為1.2微米和1.6微米的測試區域顯示了礦化。
揭示材料生物相容特性的方法的實例包括上述的細胞附著測試、細 胞鋪展測試、細胞運動性測試、差異細胞附著測試、細胞增殖測試、基 因誘導測試等。
例如，在細胞增殖測試中，細胞可用螢光蛋白標記，並在持續長達 數天的期間內數次掃描BSSA晶片以確定細胞增殖。當晶片被置於包括 培養箱中顯微鏡的自動分析設備中時，掃描可以自動地由該設備執行。
圖9顯示容納了 25個細胞的測試區域。所述方形測試區域91大到 足以容納5x5=25個細胞。在分析篩選實驗(例如細胞附著實驗，細胞 增殖實驗等)期間，在測試區域內部的細胞被分析(如計數)，而沿著 測試區域91邊界的細胞在分析中不予考慮，它們僅作為使內部區域的 細胞與相鄰測試區域微環境(未明確顯示)絕緣。在圖9中，內部區域 由虛線方形92舉例表示，並且大到足以容納3x3=9個細胞。因此，在 方形92內的細胞用於分析，而在環繞分析方形92的邊界區域93內的 細胞則提供對抗邊界效應的屏蔽。
圖IO顯示容納了 49個細胞的測試區域。方形測試區域101大到足 以容納7x7=49個細胞。如上所述，在分析時，在測試區域內部(由虛 線方形102所示)的細胞被分析，而在環繞分析方形102的邊界區域103 內的細胞則提供對抗邊界效應的屏蔽。在圖IO的實施例中，9個細胞用 於分析，而沿每個邊緣的兩排屏蔽細胞則不予考慮。或者，中心25個 細胞可以用於分析，而每邊僅一排屏蔽/絕緣細胞。
因此，可以實現統計學相關的結果，同時降低由於梯度效應造成的 錯誤源，所述梯度效應是由於接近測試區域邊緣的細胞受到測試區域結 構和周邊結構(例如相鄰測試區域的結構)的雙重影響。更大的測試區 域可容納更多的細胞，由此可提供更多的細胞用於分析，例如5x5、 10x10、 20x20個細胞、40x40個細胞、或更多細胞，從而提供改善的統 計結果。此外，大測試區域允許排除2、 3、 4或更多排的細胞，由此降 低邊界效應的影響。
圖11顯示具有圓形截面的凸起/柱的拓樸結構的兩個實例的頂視 圖。圓柱的直徑為x,節距為y,如圖lla和圖lib所示。
圖12和13舉例說明使用焚光蛋白的差異細胞附著測試的實例。
如上所述，本文所述的BSSA可用於任意兩種或多種不同細胞類型 的差異附著的篩選測試。在一個這種差異細胞測試(DCA)的實例中， 一個細胞系經遺傳修飾而穩定表達增強的黃色螢光蛋白(EYFP)基因， 而其他細胞要麼表達增強的青色螢光蛋白(ECFP)要麼根本不表達任 何螢光蛋白。兩種細胞系以不同比例接種在BSSA晶片上。在一至七天 細胞培養後，通過螢光顯微分析來計算兩種細胞類型在細胞培養物中的 比例。通過與參考測試區域比較，當更高百分比的相關細胞類型附著在 所述表面時，可以檢測所述結構在附著、增殖等方面的優點。例如，使
用4英寸的BSSA晶片，有可能篩選大約1500個尺寸為0.2mmx0.2mm 的方形，每個方形包含不同的表面結構。這樣的方形能容納數千個細胞， 使得DCA效應的定量在統計學上高度相關。
圖12是差異細胞附著測試的一個實例，其中用全細胞標誌標記細 胞。圖12a-c顯示在圖7所示的具有結構D2/4的測試區域上，細胞種植 到晶片上分別l天(圖12a)、 2天(圖12b)和7天(圖12c)後的帶 有血清的成纖維細胞(NIH)。圖12d-f顯示在圖7所示的具有結構D2/4 的測試區域上，細胞種植到晶片上分別1天(圖12d)、 2天(圖12e) 和7天(圖12f)後帶有血清的成骨細胞(MC3T3 )。
圖13顯示用核定位螢光蛋白標記的細胞的一個實例。特別地，圖 13a顯示通過青光濾光器觀察到的用核定位ECFP (青)瞬時轉染的 BOSC23細胞。在另一個實例中，細胞可用穩定地表達不同螢光蛋白的 逆轉錄病毒載體來轉導；或通過分離穩定維持在細胞內的載體(例如在 載體整合後)來產生穩定表達螢光蛋白的細胞克隆。使用黃色濾光器(圖 13b)不能檢測到螢光背景，顯示用這些濾光器組合有可能完全地區分 增強的黃色螢光蛋白(EYFP)和ECFP。此外，可以看到，有可能對 表達核定位EYFP和ECFP的細胞進行計數。
圖14顯示用於記錄生物相容表面結構篩選結果的設備的示意框圖。 該設備包括位於培養箱1402中的顯微鏡1401，該培養箱具有能控制溼 度、C02、溫度和/或其他培養箱內參數的培養箱控制單元1403。該"i史 備還包括用於保持BSSA晶片1405的樣品保持器1404，以便晶片可用 顯微鏡1401檢查。該系統還包括控制單元1406，用於控制顯微鏡以及 晶片相對於顯微鏡光軸的位置。例如，樣品保持器可安裝成可移動的以 1更其可以在控制單元1406的控制下在一個或多個方向上移動，由此允 許顯微鏡自動地或半自動地獲取不同個體測試區域的圖像。作為替代或 除此之外，顯微鏡1401可安裝成能在一個或多個方向上相對樣品保持 器1404移動。顯孩史鏡1401包括數位照相機1407用以記錄晶片上測試 區域的圖像，並且控制單元進一步改造為控制照相機和顯微鏡，即控制 其功能，比如調整焦距、快門速度和任意光學過濾等。為確保對每個測 試區域每張照片的正確對焦，顯微鏡上裝配有雷射對焦系統用以保證快 速可靠地、與晶片尺寸無關地對焦整個晶片。控制單元1406還包括圖 像處理單元1408,其適於接收記錄的圖像並執行對已接收圖像的分析。 例如，圖像分析可包括檢測不同螢光顏色的細胞和計算不同螢光顏色細胞數量的比率。作為替代或除此之外，圖像分析過程可包括測量給定熒 光顏色細胞覆蓋的測試區域的總面積，或類似的圖像分析步驟。圖像分 析程序可進一步執行對測試區域的分選，例如根據在此區域中具有預定 特性的細胞(比如表達黃色螢光蛋白的細胞)的最高百分比進行分類。
在各自測試區域上細胞的通常形態也可以用差異幹涉對比(DIC)成像 來評價。
控制單元的執行可通過含有數個不同元件的硬體、利用適當配置和 編程的計算機如個人計算機、或作為它們的組合來實現。
顯微鏡以及控制顯微鏡和執行圖像分析的軟體改造為自動處理一 個或多個不同大小的晶片，例如具有高達至少6000個2x2mm尺寸的測 試方形的晶片。對於每個測試方形獲得一至數張照片。顯微鏡、樣品保 持器和控制單元被進一步改造為以自動方式處理不同尺寸的晶片，如4 英寸晶片、6英寸晶片、8英寸晶片和/或12英寸晶片。
圖15舉例說明基因誘導測試的一個實例。該基因誘導測試的實例 使用來自基因敲入小鼠(Knock-in mice)的原代細胞。對於活細胞，使 用EGFP的報告系統或其他表達螢光蛋白的報告系統都能用於構造報 告基因構建物以替代天然基因。在ES細胞中同源重組後，產生了基因 敲入小鼠，如"Dmd(mdx-beta geo): a new allele for the mouse dystrophin gene" by K. Wertz and EM. Fuchtbauer, Dev Dyn. 1998 Jun;212(2):229-41" +所述。從這些小鼠分離出相關的原代細胞。當目 標基因被誘導時，來自這種小鼠的細胞表達EGFP構建物。圖15顯示 作為這種骨誘導性表面篩選的實例，BSSA晶片的4個測試區域。測試 區域1501作為骨誘導表面而測試區域1502包含非骨誘導表面。可以理 解的是許多其他報告系統也可用於這種方案。 一個例子是表達Betagal 的基因敲入小鼠。已經存在超過6000個不同的使用這一表達系統的基 因敲入小鼠，i口"A large-scale, gene-driven mutagenesis approach for the functional analysis of the mouse genome" by Hansen J, Floss T， Van Sloun P, Fuchtbauer EM, Vauti F, Arnold HH, Schnutgen F， Wurst W, von Melchner H, Ruiz P, Proc Natl Acad Sci USA, 2003 Aug 19;100(17):9918-22. Epub 2003 Aug 6"中所述。
實施例2
用於細胞篩選的包含BSSA晶片的試劑盒
用於篩選產胰島素細胞的試劑盒包含不同的BSSA晶片，並可另外 包括標準細胞培養基和無菌容器以及來自胰島素敲入小鼠的多種原代 細胞。通過使用這樣的細胞可以測定各表面促進分化的能力，例如從間 充質幹細胞分化成P-細胞(產胰島素細胞)，其可用於測定p-細胞等的 優先附著和擴增。對於人原代細胞，可以用相關基因的抗體對其固定和 染色。上述試劑盒可以與本發明所述的顯微鏡合用。作為替代或除此之 外，該試劑盒包括這樣的顯微鏡和/或用於自動或半自動篩選晶片的具 有控制軟體和/或分析軟體的軟體包。
本文所述的BSSA可用於篩選與多種疾病有關的生物相容表面。
例如，能夠將細胞類型導向至形成多巴胺能神經元的任何結構都是 令人感興趣的，因其可作為帕金森病的直接治療以及潛在地受關注用於 多種其他的神經相關疾病如阿爾茨海默病。維持在這種分化狀態的細胞 更令人感興趣，因為它們可用於藥物的篩選和初步測試目的。細胞類型 對不同表面結構的附著效率可用使用商品抗體的免疫染色技術測量，這 些商品抗體能識別細胞類型特異性蛋白質標記，如突觸蛋白I(synapsin I)(神經元)、GFAP (星形細胞)和PLP (少突膠質細胞)以及具有不 同顏色螢光標籤的神經膠質，並能通過雙重免疫染色和螢光顯微技術鑑 定不同細胞類型。不同細胞類型的存在可在不同時間區間測量，其也允 許鑑定支持神經元細胞群擴增的表面微米和/或納米尺度結構。
使用酪氨酸羥化酶(TH )和多巴胺轉運蛋白(DAT )特異性抗體可 鑑定多巴胺能神經元(DAergic neurons )。因此可測量表面結構，相對 於其他細胞類型如其他神經元類型和星形細胞，支持多巴胺能神經元存 在和分化的能力。
此外，有利於(5-細胞擴增或誘導幹細胞(間充質細胞)分化成為 產胰島素p-細胞的任何結構在糖尿病中都是令人感興趣的。這些細胞可 用於治療因生活方式和/或老齡化而發展為I型糖尿病的日益增長的人 群。生長在這種表面上的產胰島素細胞可用於藥物測試/驗證分析。
對於能實現和/或有利於來自骨髓抽出物的細胞的分離、擴增、啟 動或分化的結構，使用BSSA可鑑定其骨形成能力。生長在這種結構上 的細胞可與矯形手術結合使用。生長在這種結構上的原代細胞可在多種 藥物測試中使用。
在多種醫學應用中還期望能夠在原代細胞轉染時不使用病毒轉
導。本文所述的BSSA可用於篩選納米和/或微米尺度的結構，該結構單 獨地或與不同塗層(如PLA、 PLG、 PAGA、和聚(D,L-丙交酯-共-乙交 酯)(PLGA)聚合物)聯用，將增加DNA在多種細胞類型中的吸收。 例如，所述報告系統可由哺乳動物DNA表達栽體組成，該載體編碼增 強的綠色螢光蛋白(EGFP)。這種質粒可用於BSSA，並且通過螢光顯 微鏡鑑定令人感興趣的結構。
這樣的結構在siRNA技術中以及在用於瞬時表達效應物基因(如 用於矯形研究的骨形成細胞中的BMP-2 )的原代細胞基因轉導中將是主 要的興趣點。
實施例3
篩選具有胚胎成纖維細胞和成骨MG3T3細胞的表面
圖16-19顯示了在BSSA晶片的測試區域上胚胎成纖維細胞的篩 選結果。圖16顯示在BSSA晶片的參考表面上的胚胎成纖維細胞。圖 17顯示在測試區域上的胚胎成纖維細胞，該測試區域具有特徵高度為 1600納米的"D2/4"表面結構。圖18顯示在具有特徵高度1600納米的 "D2/4"表面結構的測試區域上的胚胎成纖維細胞的另一些實例。圖19 顯示在測試區域上的胚胎成纖維細胞，該測試區域具有特徵高度為1600 納米的"D2/10"表面結構。
胚胎成纖維細胞是高度伸展的細胞，具有長和厚的應力纖維(肌 動蛋白纖維束)。此外，胚胎成纖維細胞還是活動細胞。如圖16-19所 示，通過沿著它們選擇性結構化，應力纖維具有與D2/4而不是D2/10 反應的傾向。在較少活動的細胞中，發現在該結構周圍有F-肌動蛋白的 沉積。
圖20-22顯示了在BSSA晶片的測試區域上成骨MC3T3細胞的 篩選結果。圖20a顯示在玻璃上的MC3T3細胞，並且圖20a顯示在BSSA 晶片的參考表面上的MC3T3細胞。圖21顯示在具有"D2/4"表面結構 (1600納米)的測試區域上的MC3T3細胞。圖22顯示在具有"D2/10" 表面結構(1600納米)的測試區域上的MC3T3細胞。
MC3T3是具有較細應力纖維的較小細胞。此外，MC3T3還是較 少活動的細胞。如圖20-22所示，在D2/4上而非在D2/10結構上有較 少應力纖維。此外，許多F-肌纖蛋白沉積在D2/4結構周圍。最後，細
胞形狀是^f艮據它們所在的結構。
在圖16-22中，所有的染色都是在細胞接種48小時後用羅丹明標記 的鬼筆環肽進行的。
權利要求
1、一種用於測試用於細胞或生物培養的不同微環境的生物表面結構陣列，所述生物表面結構陣列包含多個測試區域，其中每個測試區域具有a)至少0.0625mm2的表面積，其中每個線性尺寸是至少250μm，以及b)待暴露於所述細胞或生物的表面，其中所述表面具有預定的規則的納米或微米尺度的拓撲結構。
2、 根據權利要求1的生物表面結構陣列，其中所述規則的結構是 周期性結構。
3、 一種用於篩選細胞的生物表面結構陣列，所述生物表面結構陣 列包含多個測試區域，其中每個測試區域具有待暴露於所述細胞的表 面，其中所述表面具有預定的表面積和預定的周期性拓樸結構。
4、 根據權利要求1-3中任一項的生物表面結構陣列，其中所述表 面積是至少0.09 mm2,並且其中每個線性尺寸是至少300 nm。
5、 根據權利要求1-3中任一項的生物表面結構陣列，其中所述表 面積是至少0.1225 mm2，並且其中每個線性尺寸是至少350 nm。
6、 根據權利要求1-3中任一項的生物表面結構陣列，其中所述表 面積是至少4 mm2,並且其中每個線性尺寸是至少2 mm。
7、 根據權利要求l-6中任一項的生物表面結構陣列，其中所述拓 樸結構包含多個特徵，所述特徵的側向(間距)尺寸在約lnm和約 1000,000 nm之間。
8、 根據權利要求7的生物表面結構陣列，其中所述尺寸選自以下 區間之一約lnm和約2nm之間、約2nm和約4nm之間、約4nm和 約10nm之間、約10nm和約100nm之間、約100nm和約1000nm之 間、約lnm和約2jim之間、約2jim和約4pm之間、約4nm和約lOpm 之間、約10jim和約100nm之間。
9、 根據權利要求1-8中任一項的生物表面結構陣列，其中所述陣 列的基底層包含矽。
10、 根據權利要求l-8中任一項的生物表面結構陣列，其中所述陣 列的基底層包含半導體、單種金屬、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、復 合物、藥物遞送系統、生物活性化合物中的至少一種。
11、 根據權利要求1-10中任一項的生物表面結構陣列，其中所述 陣列的表面層包含金屬，如鉭、鈦、Ti-Al-V合金、金、鉻、金屬氧化 物、半導體氧化物、金屬氮化物、半導體氮化物、聚合物、生物聚合物、 合金。
12、 根據權利要求l-ll中任一項的生物表面結構陣列，其中在所 述陣列的表面層上沉積了一種或多種生物活性化合物。
13、 根據權利要求12的生物表面結構陣列，其中所述生物活性化 合物是包含多肽的聚合物。
14、 根據權利要求13的生物表面結構陣列，其中所述聚合物包括 抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、 RNA、多糖、脂質、有機化合物、 無機化合物中的至少 一種。
15、 根據權利要求1-14中任一項的生物表面結構陣列，其中每個 測試區域具有最大的和最小的線性尺寸，並且所述最大和最小的線性尺 寸的比小於IO,優選地小於5，更優選地小於2。
16、 一種包含根據權利要求1-15中任一項的生物表面結構陣列的 試劑盒。
17、 根據權利要求16的試劑盒，其用於細胞附著測試、細胞分化 測試、細胞運動性測試、細胞增殖測試中的至少一種。
18、 一種篩選生物相容表面結構的方法，其包括以下步驟a) 將根據權利要求l-15任一項的生物表面結構與分離的細胞或 生物在適合所迷細胞或生物維持和/或生長的條件下相組合。
19、 根據權利要求18的方法，其還包括培養步驟，所述培養是(a) 在適合所述細胞或生物維持和/或生長和/或分化/去分化的條件下進行 的。
20、 根據權利要求18或19的方法，其中測試區域的每個線性尺寸 大到足夠容納一排至少5個細胞，優選地至少IO個細胞或生物，更優 選地至少20個細胞或生物。
21、 根據權利要求18-20中任一項的方法，其還包括比較所述細胞 或生物附著至所述生物表面結構陣列的任一測試區域的頻率的步驟。
22、 根據權利要求18-20中任一項的方法，其還包括比較所述細胞 或生物在所述生物表面結構陣列的任一測試區域上鋪展的步驟。
23、 根據權利要求18-20中任一項的方法，其還包括比較附著在所 述生物表面結構陣列任一測試區域上的細胞或生物的分化的步驟。
24、 根據權利要求18-23中任一項的方法，其中所述細胞或生物包 括動物細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、真核或原核細胞或 者生物中的至少一種。
25、 一種具有表面的生物相容材料，其中至少一部分所述表面的特 徵在於預定的規則的納米或微米尺度的拓樸結構，所述表面通過根據權 利要求18-24中任一項的方法獲得。
26、 一種包含根據權利要求l-15任一項的生物表面結構陣列的晶片。
27、 根據權利要求29的晶片在體外細胞生物測試中的用途。
28、 一種用於執行體外細胞生物測試的包含根據權利要求29之晶 片的試劑盒。
全文摘要
本發明涉及一種生物表面結構陣列(BSSA)，該陣列包含多個測試區域，由此每個區域都具有表面拓撲，而該表面拓撲的特徵是在微米或納米尺度下定義的。本發明的BSSA還可包含吸附在一個或多個所述測試區域的化合物，如活性生物化合物或聚合物。
文檔編號G01N33/50GK101180538SQ200680017763
公開日2008年5月14日 申請日期2006年4月25日 優先權日2005年4月26日
發明者弗萊明·貝森巴赫, 芬恩·斯科·彼得森, 莫恩斯·呂特高·杜赫, 莫藤·福斯 申請人:奧胡斯大學