膽汁酸測定試劑的製作方法

2023-09-11 13:22:50

專利名稱：膽汁酸測定試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物診斷試劑，具體涉及一種膽汁酸測定試劑。
背景技術：
1974年挪威科明公司採用純制的3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)成功地生產出第一代酶法膽汁酸試劑，使膽汁酸的測定真正進入到臨床領域。總膽汁酸測定方法較快，到目前為止已經發展到第五代。
肝細胞損傷、肝流血量減少，和肝內外門脈分流等，皆影響肝臟對膽汁酸的清除作用，從而使周圍中膽汁酸鹽含量增加膽管梗阻和膽汁淤滯時，膽汁酸鹽反流入血，使膽汁酸鹽濃度顯著升高。隱私，檢查血、尿中膽汁酸鹽能反映肝臟德攝取，合成及排洩功能。很多證據表明，膽汁酸的生成和代謝與肝臟有十分密切的關係，血清膽汁酸水平是反映肝實際損傷的一個重要指標。
膽酸是在肝臟從膽固醇生成的24-碳類固醇化合物。在體液中被發現的以下四個膽酸形式佔99％以上，四種膽酸形式分別為脫氧膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨膽酸，其中甘氨膽酸又是膽酸主要的存在形式。檢測甘氨膽酸又具有十分重要的臨床意義，如肝細胞損傷程度，急性肝炎的病情觀察，判斷肝硬化等(詳見張宋英、候振江、王英文「甘氨膽酸診斷肝病的價值」《新消化病學雜誌》1996.4(7)395-396)已有詳細報導。
目前，臨床上應用的是第五代酶法測定膽汁酸試劑，該第五代酶法測定與原有的方法相比具有靈敏度高、對分析儀器汙染弱等特點，但其試劑的穩定性較差，測臨床低值樣本不夠準確等，同時對血清中甘氨膽酸的反應也不夠靈敏。因而，在應用上存在一定局限.

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，設計一種新的膽汁酸測定試劑，提高檢測中的靈敏度和試劑穩定性。
本發明提供了一種膽汁酸測定試劑，該試劑包括兩個試劑組份試劑1甘氨酸 1.5g/L～3.75g/LThio-NAD 0.95g/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 0.1g/L～150g/L亞鐵氰化鉀 0.1g/L～100g/L試劑2二乙醇胺 6.0g/L～16.2g/L苯或烷基二醇 10ml/L～100ml/L硼氫化物 0.8g/L～10g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/LTritoNX-100 1ml/Lα-糊精 5g/L～20g/LNADH 6g/L
本發明提供的膽汁酸測定試劑是發明人通過改進試劑組份而實現了克服已有技術存在的缺陷。本發明人為提高試劑對甘氨酸的親和能力，在試劑1的組份中，添加了丙酮酸鈉和亞鐵氰化鉀；為提高試劑的穩定性，在試劑2的組份中，添加了硼氫化物和烷基或苯基二醇作為穩定劑，保護NADH的穩定；為提高試劑對測低值標本的準確性，同時在試劑2的組份中，增加了α-糊精，有效地提高了試劑對樣本反應的靈敏度。
上述添加試劑的濃度範圍為烷基二醇或苯二醇0.01％-10％硼氫化物0.01％-25％丙酮酸鈉0.01％-15％亞鐵氰化鉀0.01％-10％α-糊精0.01％-10％本發明人對本發明試劑的靈敏度、穩定性和對甘氨膽酸的親和能力分別進行了檢測，其結果如下一、提高試劑的靈敏度配製試劑1含有甘氨酸1.5g/L，Thio-NAD 0.95g/L，NaN31g/L，TritonX-100 1ml/L，丙酮酸鈉10g/L，亞鐵氰化鉀10g/L配製試劑2含有二乙醇胺16.2g/L，苯二醇10ml/L，硼氫化鈉10g/L，3αHSD 12.5ku/L，NaN31g/L，Triton X-100 1ml/L，NADH 6.0g/L


膽汁酸濃度(umol/L)＝ΔA樣本管/ΔA標準管*標準濃度按圖1測50μmol/l樣本，測得ΔA＝0.0500A/min在試劑2中添加α-糊精(分子量5000)18g/l後，按圖1測50μmol/l樣本，測得ΔA＝0.2000A/min靈敏度提高了300％，這樣對測低值樣本時更具有準確性。
結果表明在試劑中添加α-糊精能有效提高試劑對樣本反應的靈敏度。
二、檢測試劑的穩定性配製試劑二乙醇胺16.2g/L，3αHSD 12.5ku/L，NaN31g/L，Triton X-1001ml/L，α-糊精(分子量5000)18g/L，NADH 6.0g得A溶液在405nm處檢測溶液A的吸光度，得下列結果

在A溶液基礎上添加苯二醇10ml/L和硼氫化鈉10gL後，在405nm處檢測試劑A的吸光度，得下列結果

試劑穩定效果明顯結果顯示在試劑中添加了苯二醇和硼氫化鈉，使試劑穩定性明顯得到了提高。
三、試劑對甘氨膽酸的親和能力的檢測配製試劑1甘氨酸15g/L，Thio-NAD 0.95g/L，NaN31g/L，TritoN X-1001ml/L配製試劑2二乙醇胺16.2g/L，苯二醇10ml/L，硼氫化鈉10g/L，3αHSD12.5ku/L，NaN31g/L，TritoN X-100 1ml/L，NADH 6.0g/L按圖1分別檢測40μmol/l的脫氧膽酸，石膽酸，鵝去氧膽酸，甘氨膽酸的樣本，得下列結果

在試劑1中添加入亞鐵氰化鉀10g/L和丙酮酸鈉10g/L後，依上法分別檢測40μmol/l的脫氧膽酸，石膽酸，鵝去氧膽酸，甘氨膽酸的樣本，得下列結果

通過實驗表示，在試劑1中添加亞鐵氰化鉀和丙酮酸鈉，能使試劑對甘氨膽酸的結合能力得到明顯提高。
本發明所述的試劑中，硼氫化物可以為硼氫化鈉或硼氫化鉀；烷基或苯基二醇可以為乙二醇、丙二醇、丁二醇或苯二醇；α-糊精的分子量為1000～2000。
本發明試劑與酶循環法測定試劑同時對30例臨床樣本進行了檢測，說明本發明的試劑是符合臨床檢測要求，與日本產品相符。
本發明提供的膽汁酸測定試劑具有穩定性好，靈敏度高的優點，並增加了試劑對甘氨膽酸的親和能力強，因此，在臨床上有較好的應用前景。


圖1本發明試劑與日本第一化學株式會社制的試劑對30例臨床樣本檢測應。其中X橫座標表示日本試劑Y縱座標表示本發明試劑回歸方程Y＝1.001X+0.680；相關係數r＝0.998
具體實施例方式實例例1試劑1甘氨酸 1.5g/LThio-NAD0.95g/LNaN31g/LTriton X-1001ml/L丙酮酸鈉10g/L亞鐵氰化鉀 10g/L試劑2二乙醇胺16.2g/L苯二醇 10ml/L硼氫化鈉10g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/LTriton X-1001ml/Lα-糊精(分子量5000) 18g/LNADH6.0g/L例2試劑1甘氨酸 3.75g/LThio-NAD0.95g/LNaN31g/L
Triton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 5.7g/L亞鐵氰化鉀 105g/L試劑2二乙醇胺6g/L乙二醇 10ml/L硼氫化鉀5g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/L吐溫20 0.5g/Lα-糊精(分子量3000) 20g/LNADH6.0g/L例3試劑1甘氨酸 1.5g/LThio-NAD0.95g/LNaN31g/LTriton X-1001ml/L丙酮酸鈉1g/L亞鐵氰化鉀 1g/L試劑2
二乙醇胺 16.2g/L丙二醇 50ml/L硼氫化鈉 1g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/Lα-糊精(分子量20000) 18g/LNADH 6.0g/L例4試劑1甘氨酸 3.75g/LThio-NSD 0.95g/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 60g/L亞鐵氰化鉀 15g/LNacl 1g/L試劑2二乙醇胺 6.0g/L丁二醇 100ml/l硼氫化鉀 0.8g/L3αHSD 12.5ku/L
NaN31g/L吐溫200.5g/Lα-糊精(分子量1000) 5g/LNADH 6.0g/L
權利要求
1.一種膽汁酸測定試劑，其特徵在於該試劑包括下列兩個試劑組份試劑1甘氨酸1.5g/L～3.75g/LThio-NAD 0.95g/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 0.1g/L～150g/L亞鐵氰化鉀0.1g/L～100g/L試劑2二乙醇胺 6.0g/L～16.2g/L苯基或烷基二醇10ml/L～100ml/L硼氫化物 0.8g/L～10g/L3αHSD12.5ku/LTritoNX-100 1ml/Lα-糊精 5g/L～20NADH 6g/L
2.根據權利要求1所述的一種膽汁酸測定試劑，其特徵在於其中所述試劑2中的硼氫化物為硼氫化鈉或硼氫化鉀；烷基或苯基二醇為乙二醇、丙二醇、丁二醇或苯二醇；α-糊精的分子量為1000～20000。
3.根據權利要求1所述的一種膽汁酸測定試劑，其特徵在於所述下列組份在試劑中的添加範圍為烷基或苯二醇為0.01％～10％；硼氫化物為0.01％～25％；丙酮酸鈉為0.01％～15％；亞鐵氰化鉀為0.01％～10％；α-糊精為0.01％～10％。
全文摘要
本發明公開了一種膽汁酸測定試劑。本發明的測定試劑包括試劑1和試劑2兩個組成部分，在本發明的試劑中添加了丙酮酸鈉和亞鐵氰化鉀等試劑，提高了試劑的穩定性和靈敏度，並增加了試劑對甘氨酸的親和能力。
文檔編號G01N33/50GK1632578SQ20041009355
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月24日 優先權日2004年12月24日
發明者孫衛兵 申請人:上海復星長徵醫學科學有限公司