一種Gα基因過表達慢病毒載體、慢病毒及其構建方法與流程

2023-09-11 18:47:15 2

本發明屬於分子生物學技術領域，具體涉及一種Gα基因過表達慢病毒載體、Gα慢病毒及其構建方法。

背景技術：

味覺功能學研究表明，甜味主要由味覺細胞的G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptors，GPCRs)家族所介導，即味覺受體第1家族(taste receptor family 1 members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受體，它們以T1R2+ T1R3異二聚體的形式發揮作用，共同對甜味進行識別。甜味受體在結合配體後，下遊G蛋白被激活，其α亞基與β、γ亞基分離，Gα亞基進入胞漿進而激活下遊效應器，最終導致細胞內鈣離子濃度升高。因此，通過構建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質進行識別。

構建共表達人T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，需要使用到帶有人Gα基因的過表達載體。現有的方法採用的是將整合有Gα基因的質粒載體通過脂質體對宿主細胞進行轉染，但是脂質體轉染質粒載體的轉染效率較低，要構建能穩定共表達T1R2、T1R3和Gα三種基因的細胞系成功率也較低。因此，如何提高Gα基因過表達載體的轉染效率是目前亟需解決的問題。

技術實現要素：

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種Gα基因過表達慢病毒載體、Gα慢病毒及其構建方法，該方法所構建的慢病毒載體，轉染效率高，並能將Gα基因整合到宿主細胞的基因組中，因此能特異、持續、高效地促進Gα基因在宿主細胞中的穩定表達。

為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下：

一種Gα基因過表達慢病毒載體，以慢病毒pLVX-IRES-mCherry慢病毒表達載體為基礎進行構建，並整合有Gα基因，得到Gα基因過表達慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry-Gα。

本發明還提供pLVX-IRES-mCherry-Gα慢病毒表達載體的構建方法，包括如下步驟：

步驟（1），人工合成Gα基因；

步驟（2），以下列PCR擴增引物進行Gα基因的PCR 擴增：

所述的PCR擴增引物為：

Gα-F：agattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg；

Gα-R：agatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc；

步驟（3），用限制性內切酶EcoRI和BamHI分別對Gα基因的PCR 產物和慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry進行雙酶切；

步驟（4），用T4 DNA連接酶將酶切的得到的線性化的Gα基因和慢病毒載體連接，將得到的連接液轉化DH5α感受態細胞，並進行PCR鑑定，對PCR鑑定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構建成功的Gα基因過表達慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry-Gα；

其中，步驟（4）PCR鑑定採用的PCR擴增引物與步驟（2）所採用的PCR擴增引物相同。

步驟（4）測序所用引物為：

CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；

IRES-R：cctcacattgccaaaagacg。

本發明另外提供一種Gα慢病毒的構建方法，採用上述Gα基因過表達慢病毒載體，方法是：使用慢病毒包裝質粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G對Gα基因過表達慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry-Gα進行包裝。，通過轉染HEK293細胞，得到Gα慢病毒。

本發明還要求保護上述Gα慢病毒的構建方法構建得到的Gα慢病毒。

本發明與現有技術相比，其有益效果為：

本發明所構建的Gα基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉染效率高達80%~90%，比起現有的質粒轉染法轉染效率提高了1倍以上。此外由於慢病毒能將Gα基因整合到宿主細胞的基因組中，因此使用該方法能特異、持續、高效地促進基因Gα在宿主細胞中的穩定表達。過表達Gα基因的細胞可用於構建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質進行識別。

附圖說明

圖1是pLVX-IRES-mCherry慢病毒表達載體圖譜；

圖2是pRSV-Rev慢病毒包裝質粒圖譜；

圖3是pMDLg-pRRE慢病毒包裝質粒圖譜；

圖4是pMD2.G慢病毒包裝質粒圖譜。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。

本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規產品。

主要實驗試劑及廠家：

大腸桿菌菌株DH5α（Invitrogen）

胎牛血清FBS（Invitrogen）

胰蛋白酶（Invitrogen）

DMEM完全培養基（含10%FBS、100U/mL青黴素和100µg/mL鏈黴素）（Invitrogen）

限制性內切酶（Fermentas）

T4 DNA連接酶（NEB公司）

質粒DNA提取試劑盒（Axygen公司）

製備感受態試劑盒（BIOSCIENCES）

PrimeSTAR Max Premix(2X) （Takara）

逆轉錄酶MuLV（NEB）

RNase 抑制劑（NEB）

Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2X) （Thermo Scientific）

pLVX-IRES-mCherry、pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G，均可商購於上海比昂生物醫藥科技有限公司。

實施例1：Gα基因過表達慢病毒載體構建。

1、人工合成Gα基因，其DNA如SEQ ID NO.1所示。

2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的Gα基因為模板，通過如表1所示引物進行的PCR 擴增：

表1

PCR反應體系與條件如表2：

表2

PCR程序如表3：

表3

3、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物大小是否與預期一致，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的片段條帶，用DNA回收試劑盒回收純化；

4、用EcoRI和BamHI 限制性內切酶分別對Gα基因的PCR 產物和慢病毒表達載體pLVX-IRES-mCherry進行雙酶切（於37℃酶切3h），反應體系和反應條件如表4：

表4

5、瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的Gα基因片段條帶和線性化的慢病毒載體，用膠回收試劑盒回收DNA；

6、用T4 DNA連接酶於16℃水浴下，將兩種酶切產物進行連接，過夜。反應如表5：

表5

7、轉化感受態細胞：

從-80℃冰箱取出1管100μL DH5α感受態細胞，放冰上解凍（解凍至無冰狀態）後取10μL 上述步驟6中的連接產物加到感受態細胞中混勻，靜置30min，42℃水浴熱激1min，冰上靜置2min。加LB液體培養基500μL，37℃振蕩培養1小時。3000rpm 離心5min，留100μl左右上清液混勻細菌後塗到LB平板上，37℃倒置培養過夜。

8、挑取數個菌落，做菌落PCR檢測轉化子，反應體系和條件見步驟2；

9、將菌落PCR鑑定得到的陽性克隆進行測序驗證，測序引物如表6：

表6

實施例2：Gα慢病毒包裝

1、用胰蛋白酶消化對數生長期的HEK293細胞，細胞密度為5×106時；重新接種於含有25 mL 含10%（v/v）FBS的無抗生素DMEM培養基直徑為15cm的細胞培養皿中，37℃，50 mL/L CO2培養箱內培養；

2、製備慢病毒包裝系統中四種質粒DNA溶液：

pRSV-Rev 10μg，

pMDLg-pRRE 15μg，

pMD2G 7.5μg，

pLVX-IRES-mCherry-Gα 20μg；

將以上質粒加入無菌水定容至1800μL，再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液200μL，混勻，加入2×PBS緩衝鹽溶液2000μL，室溫放置20～30 min；

3、當細胞密度達60%～70%時進行轉染。此時將步驟2中製備的DNA溶液和磷酸鈣混合液轉移至步驟1得到的含單層細胞的細胞培養皿中，混勻，培養12 h後棄去培養液，細胞用15mL PBS溶液衝洗，共洗3次。

4、向上述細胞培養皿中加入含100 mL/L FBS的DMEM細胞培養液15 mL，繼續培養48h；

5、收集轉染72h的HEK293細胞上清液；

6、將收集的上清液於4℃，4000 g離心10 min，再次收集上清液；

7、將再次收集得到的上清液以0.45 μm濾器過濾；

8、將濾液於40 mL超速離心管中，4℃，25000 r/min離心20 min，棄上清液；

9、而後以冰500ul PBS重旋病毒沉澱於4℃溶解過夜，得到慢病毒液，即Gα慢病毒。

實施例3：細胞轉染和篩選

1、在6孔細胞培養板中培養HEK293細胞，待細胞完全貼壁匯合度為40%-50%後，即可進行細胞轉染；轉染前，每孔細胞換成500μL新鮮的DMEM完全培養基，並且每孔加入1μL的聚凝胺（polybrene），放置於培養箱孵育1h。

2、在上述6孔細胞培養板的2個孔中，分別加入5μL 實施例2得到的Gα慢病毒液，其中一孔細胞加10μL的空載慢病毒液（空載慢病毒液與Gα慢病毒液的唯一區別是不含有Gα基因，其餘製備方法都相同），另一孔做空白細胞對照，充分的搖勻後放入37℃、5％（v/v）CO2、95%相對溼度的培養箱中培養

3、轉染6小時後，吸走孔內的培養基，並用PBS洗兩次；換成新鮮的DMEM完全培養基，放入37℃、5％（v/v）CO2、95%相對溼度的培養箱中培養。

4、感染48小時後，與對照組相比較，於螢光顯微鏡下觀察感染效果。若觀察到明顯的紅色螢光，說明已轉染成功。此時將得到的HEK293- Gα細胞移至10cm細胞培養皿擴大培養。

實施例4：使用實時螢光定量PCR進行Gα基因的表達檢測。

1、HEK293-Gα細胞總RNA提取：

1）將10cm細胞培養皿中匯合度達80%的篩選得到的HEK293-Gα細胞用預冷PBS緩衝液洗2遍，加1ml Trizol裂解液重懸。

2）接著加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置3分鐘。

3）4℃，12000 rpm離心20min。

4）將上清水相轉移至另一新的無RNA酶離心管中，並加入等體積的異丙醇，混勻，-80℃放置1h。

5）4℃，12000rpm離心10min，去上清。

6）加入1ml體積濃度為75%乙醇洗滌沉澱。

7）4℃，5000rpm離心3min，去上清，室溫晾乾。

8）加入40μL RNase-free水溶解RNA。

2、去基因組DNA和cDNA的合成

將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。

cDNA合成條件：

RNA 1μg

dNTP(10mM) 1μl

oligo dT（40μM）1μl

隨機引物（40μM）1μl

加RNas-free水至34.5μl；

至於75℃ 5min，冰上5min。

向上述反應後的溶液中添加反轉錄試劑：

MuLV 1μl

10X buffer 4μl

RNase 抑制劑0.5ul

42℃反應1h，75℃滅活酶10min，備用

3、cDNA的實時螢光定量PCR

將Gα基因和內參基因actin的cDNA樣本分別取樣在螢光定量PCR儀上進行反應，每個樣本設置3個平行實驗。PCR反應體系為20μL，反應體系如表7：

表7

螢光定量PCR使用的引物如表8：

表8

反應條件為：

循環結束後從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。

本發明所構建的Gα基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉染效率高達80%~90%。

實驗以actin為內參基因，採用2-△△Ct法進行分析，經所構建的pLVX-IRES-mCherry-Gα慢病毒載體轉染的HEK293細胞中Gα基因的相對表達量是未轉入Gα基因的HEK293細胞的2.42倍。

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.1

atggcccgct cgctgacctg gcgctgctgc ccctggtgcc tgacggagga tgagaaggcc 60

gccgcccggg tggaccagga gatcaacagg atcctcttgg agcagaagaa gcaggaccgc 120

ggggagctga agctgctgct tttgggccca ggcgagagcg ggaagagcac cttcatcaag 180

cagatgcgga tcatccacgg cgccggctac tcggaggagg agcgcaaggg cttccggccc 240

ctggtctacc agaacatctt cgtgtccatg cgggccatga tcgaggccat ggagcggctg 300

cagattccat tcagcaggcc cgagagcaag caccacgcta gcctggtcat gagccaggac 360

ccctataaag tgaccacgtt tgagaagcgc tacgctgcgg ccatgcagtg gctgtggagg 420

gatgccggca tccgggcctg ctatgagcgt cggcgggaat tccacctgct cgattcagcc 480

gtgtactacc tgtcccacct ggagcgcatc accgaggagg gctacgtccc cacagctcag 540

gacgtgctcc gcagccgcat gcccaccact ggcatcaacg agtactgctt ctccgtgcag 600

aaaaccaacc tgcggatcgt ggacgtcggg ggccagaagt cagagcgtaa gaaatggatc 660

cattgtttcg agaacgtgat cgccctcatc tacctggcct cactgagtga atacgaccag 720

tgcctggagg agaacaacca ggagaaccgc atgaaggaga gcctcgcatt gtttgggact 780

atcctggaac taccctggtt caaaagcaca tccgtcatcc tctttctcaa caaaaccgac 840

atcctggagg agaaaatccc cacctcccac ctggctacct atttccccag tttccagggc 900

cctaagcagg atgctgaggc agccaagagg ttcatcctgg acatgtacac gaggatgtac 960

accgggtgcg tggatggccc cgagggcagc aacttaaaaa aagaagataa ggaaatctat 1020

tctcacatga cctgcgctac tgacacacaa aacgtcaaat tcgtgtttga tgccgtgaca 1080

gatataataa taaaagagaa cctcaaagac tgtgggctct tctga 1125

SEQ ID NO.2

agattctaga gctagcacca ccatggatgg cccgctcgct g 41

SEQ ID NO.3

agatccttgc ggccgctcag aagagcccac agtc 34

SEQ ID NO.4

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

SEQ ID NO.5

cctcacattg ccaaaagacg 20

SEQ ID NO.6

tgacgtggac atccgcaaag 20

SEQ ID NO.7

ctggaaggtg gacagcgagg 20

SEQ ID NO.8

gctcgattca gccgtgtact 20

SEQ ID NO.9

tttctgcacg gagaagcagt 20。