檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法
2023-09-11 12:16:45 1
專利名稱：檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法
技術領域：
本發明涉及一種快速診斷試劑盒及其應用方法，尤其涉及一種檢測四種/四種以上侵襲 性念珠菌的螢光定量PCR快速診斷試劑盒及其應用方法。屬於真菌核酸檢測技術領域，適 用於臨床及科研中對白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌及其他侵襲性念 珠菌的快速檢測。
背景技術：
近年來，隨著器官移植、骨髓移植的廣泛開展，愛滋病和腫瘤患者的增多以及皮質類 固醇激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑的大量應用，侵襲性念珠菌感染的發病率明顯增高。 美國的一項前瞻性研究顯示，真菌感染佔醫院血行感染的9.5%。念珠菌感染對免疫抑制和 免疫缺陷病人的危害性大，死亡率高達45%,已成為威脅患者生命最嚴重的併發症之一。研 究表明，儘管白色念珠菌仍是侵襲性念珠菌感染最主要的病原菌，但其在臨床分離菌中所 佔的比例逐年下降，而熱帶念珠菌等非白色念珠菌(non-albicans Candida, NAC)感染比例 呈上升趨勢，且克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥，光滑念珠菌對此藥不敏感，給臨床的治療 帶來一定的困難。既往研究發現，早期有效的抗念珠萬治療可以顯著改善預後。因此，早 期確診侵襲性感染念珠菌菌種，對其實施針對性治療，及時救治生命具有重要意義。
然而，侵襲性念珠菌感染的臨床表現缺乏特異性，不同病原菌之間在毒力、感染部位、 藥物敏感性以及臨床預後等方面均有差異，對其做出診斷常需結合實驗室診斷結果。目前 侵襲性念珠菌的實驗室診斷方法包括真菌'培養和表型檢測法、血清學檢測法、組織病理切 片鑑定法與分子生物學鑑定技術等。真菌培養受取材時間、取材部位、樣本因素、培養條 件等因素的影響，陽性率一直很低，且費時費力，常規培養需要3天，不能發揮指導臨床 早期針對性治療的作用。血清學方法雖然因操作過程簡便而廣受實驗室歡迎，但該方法應 用範圍窄，又存在交叉抗原，易出現假陽性或假陰性，且無法鑑定到種，無法滿足診斷需 要。組織病理鑑定法是臨床侵襲性念珠菌病的確診方法，但因該法是有創性檢查，患者較 難接受，且重症侵襲性真菌感染患者，常常伴有血小板減少，凝血功能差， 一般不宜採用 組織活檢方法。該方法陽性率低。因此，前述的實驗室'診斷方法限制了其在臨床診斷中的 運用。
由於分子生物學方法特異性和敏感性高，並且可快速診斷，是目前真菌感染診斷研究 中最活躍的一種方法；螢光定量PCR(fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR)技術具有自 動化程度高、操作過程全封閉、無汙染、實時性、能實現多重反應等優點，已廣泛用於病 毒、細菌等病原體的檢測；因此，本發明基於分子生物學方法，研究一種檢測侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法。
發明內容
本發明的第一個目的，是為了克服現有技術中的不足，提供一種檢測四種/四種以上侵 襲性念珠菌的快速診斷試劑盒。
本發明的第二個目的，是為了提供檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌快速診斷試劑盒的 應用方法。
本發明的第一個目的可以通過採取如下技術方案達到-
檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特徵是
1) 在所述試劑盒內設有螢光定量PCR反應液、至少四種念珠菌的陽性質控品和陰性質 控品；
2) 所述螢光定量PCR反應液含有特異性引物和四種念珠菌相對應的螢光探針，所述特 異性引物序列如序列表SEQ IDNe: l所示；
3) 所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱 帶念珠菌或由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌加上若干種其他侵襲性 念珠菌的標準菌株經"煮沸法"獲得的Dk樣品；所述陰性質控品為滅菌三蒸水。
本發明的第一個目的還以通過採取如下技術方案達到
本發明的一種實施方式是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念 珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的標準菌株經"煮沸法"獲得的DNA樣品；與白色念珠菌、 克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌相對應的螢光探針序列如序列表SEQ IDNS: 2所示。
本發明的一種實施方式是所述其他侵襲性念珠菌,可以是近平滑念珠菌、季也蒙念珠
菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念珠菌中的一種或二種以上組合。
本發明的一種實施方式是所述螢光定量PCR反應液包括25Ul反應體系包括
Brilliant QPCR Master mixl112. 5ul，通用引物(0.1,1/1)各O. 5ul，四條探針
(0. lmmol/1)各0. 25 u 1， DNA模板1 1，補DEPC (力'et/ jp;^rocar力o朋te，焦碳酸二乙 酯)水至25u 1。
本發明的第二個目的可以通過採取以下技術方案實現
檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法，其特徵在於包括以下 步驟
1)用"煮沸法"從待測標本中提取DNA;2) 分別取第l)步中待測標本的DNA和與所述DNA同樣量的陽性質控品，加入到含有 螢光定量反應液的PCR反應體系中；
3) 用螢光定量PCR檢測儀進行檢測，根據反應結果的Ct值，對檢測結果進行判斷。
4) 所述結果判斷方法是檢測樣品Ct值《35.0者，且出現典型的擴增曲線判為陽性； 無Ct值，且無典型的擴增曲線者判為陰性；若Ct值〉35.0，且出現典型的擴增曲線的樣 本，按前述步驟重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
本發明的第二個目的還可以通過採取如下技術方案達到
所述螢光定量PCR反應體系的反應條件是95。C變娃l(Mn, 95。C30s， 59。Clmin， 59°C lmin，擴增50個循環。
所述Ct值指螢光信號在每次循環的延伸階段收集，螢光信號閾值以剛好超過正常陰性 對照擴增曲線的最高點為準，擴增產物的螢光信號達到閾值時所需的擴增循環次數。
本發明的作用原理利用Taq酶的5' —3'外切酶活性，在PCR反應系統中加入不同 螢光(例如F屈、HEX、 CY5、 ROX)標記的四條探針，分別和四種念珠菌的保守基因序列相 對應，四條探針的5'端標以螢光發射基團FAM(或HEX、 CY5、 ROX)，靠近3，端標以螢光 淬滅基團BHQ1 (或BHQ3)。反應體系中的每種探針可以與引物包含序列內的DNA模板發生 特異性雜交，每種探針對應每種鹼基序列。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發射基團的 螢光發射。發射基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，檢測波長處光密度增加 而被螢光探測系統檢測到。復性期探針與模板DNA發生i雜交，延伸期T叫酶隨引物延伸沿 著DNA模板移動，當移動到探針結合處切斷探針，淬滅作用被解除，螢光信號釋放出來。 模板每複製一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個螢光信號的釋放，結果中被檢測到的熒 光信號所標記的探針，對應於檢測區域的基因類型。
本發明具有的有益效果如下
1、 本發明結合螢光定量PCR技術，採用通用引物和白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念 珠菌、熱帶念珠菌的種特異探針，開發研製出用於檢測四種對氟康唑等臨床一線抗真菌藥 敏感性不同的侵襲性念珠菌的試劑盒，可同步對四種侵襲性念珠菌進行檢測，能夠為臨床 侵襲性念珠菌病的早期病原體診斷提供依據，以便早期及時制定治療方案，'減少死亡率和 後遺症。
2、 本發明的試劑盒的特異性好，通過引物高特異擴增和螢光探針的高特異雜交雙重控 制，具有很高的準確性，假陽性低；能簡便、快速、特異、靈敏地同時檢測四種對氟康唑 等臨床一線抗真菌藥敏感性不同的侵襲性念珠菌，為臨床侵襲性念珠菌病的早期病原體診 斷提供依據。3、本發明試劑盒具有靈敏度高，反應過程由螢光檢測系統實時監控，螢光檢測系統對 螢光信號具有很高的檢測靈敏度；檢測速度快，僅2.5小時，加上樣品DNA的提取製備， 共需3小時；步驟簡單，可重複性高；所有試劑均是一次性擴增，沒有後處理，毋需開蓋， 不產生汙染。
具體實施例方式
本發明所用試劑Brilliant QPCR Master mixII ，購自美國Stratagene公司;PCR通 用引物和螢光探針，購自上海超世生物技術有限公司。
具體實施例1
本實施例1構成檢測四種侵襲性念珠菌的螢光定量PCR快速診斷試劑盒及其應用方法。 包括盒體和設置在盒體內的螢光定量PCR反應液、四種念珠菌的陽性質控品和陰性質控品； 所述螢光定量PCR反應液含有特異性引物和四種念珠菌相對應的螢光探針；所述侵襲性念
珠菌的陽性質控品由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌的標準菌株經"煮
沸法"獲得的DNA樣品，所述陰性質控品為滅菌三蒸水。
所述三種物質的製備方法如下
1)螢光定量PCR反應液的配製Brilliant QPCR Master mixl112. 5nl，通用引物
(0. l咖o1/1)各O. 5ul， 4條探針(0. lmmol/1)各0.25ul, DNA模板lpl，補DEPC水至25 1。
其中通用引物包括正向引物、反向引物兩種，分別是 正向引物(P1): 5'~ GGC ATGCCTGTTTGAGCGT ~ 3'; 反向引物(P2) : 5' ~ TCCTCCGCTTATTGATATGC — 3'; 所述4條探針如表1所述
表1種特異性螢光定量PCR探針序列及螢光標記
白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGATCCCG-B叫1
克柔念珠菌腿-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-B即
光滑念珠菌CY5-TTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGA-BHQ3
熱帶念珠菌ROX-.CGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACA-BHQ1
2)白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌陽性質控品四種念珠菌經"煮沸法"獲得的DNA樣品，一2(TC保存。 3)陰性質控品滅菌三蒸水。
本發明特異檢測四種念珠菌的快速診斷試劑盒的使用方法如下
1) 模板DNA的製備
取含菌懸液]ml， 13，000rpm離心10min。棄上清，沉澱中加入lmL滅菌生理鹽水，振蕩懸
浮，13， 000rpm離心lOmin。棄上清，向沉澱加入滅菌三蒸水100 n 1，再放入100'C水浴18min， 13， OOOrptn離心10min,取上清，置-20。C冰箱中保存備用。
2) 螢光定量PCR反應 ，
取螢光定量PCR反應液M.5u 1，加入第一步所取得的DNA模板In 1，補DEPC水至25n 1。 循環條件為95'C變性10min， 95'C30s， 59'Clmin， 59。Clmin，擴增50個循環。螢光信號在每 次循環的延伸階段收集。
3) 結果判斷
循環結束後，運用儀器自帶軟體分析檢測結果。循環域值(Ct值)設定原則根據儀器噪聲
情況調整，以Ct值剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準；陰性結果判定無Ct值，且 無典型的擴增曲線；陽性結果判定Ct值《35.0，且出現典型的擴增曲線；實驗灰區Ct值〉 35.0,且出現典型的擴增曲線的樣本建議重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，
否則為陰性。
本實施例提供檢測四種侵襲性念珠菌的多重螢光定i PCR試劑盒，主要針對四種念珠 菌檢測中的特殊性，對不同的靶片斷進行反應體系，如引物和探針濃度、退火溫度等的優 化，建立了多重螢光定量PCR檢測四種侵襲性念珠菌的方法，是一種特異檢測四種侵襲性 念珠菌的螢光定量PCR快速診斷試劑盒。，
具體實施例2
本實施例2構成檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的螢光定量PCR快速診斷試劑盒及其 應用方法。
本具體實施例2的特點是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品由白色念珠菌、克柔念珠 菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌加上若干種其他侵襲性念珠菌的標準菌株經"煮沸法"獲得 的DNA樣品，所述侵襲性念珠菌的陰性質控品為滅菌三蒸水。所述其他侵襲性念珠菌可以 是近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念珠菌中的一種或二種以上組合。 其餘與具體實施例l相同。
結合表2、表3所示，用本發明試劑盒擴增13種94株臨床上常見的致病性真菌、5種細菌和人全血細胞DNA，白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌的Ct值均《35.0，鑑 定結果為陽性，而其它念珠菌、細菌、麴黴菌、新生隱球菌、人類基因組DNA等Ct值無讀數， 呈陰性結果。
由表2、表3數據結果充分證明本發明試劑盒具有很好的特異性。 具體實施例3
將白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌懸液按IO倍倍比稀釋為5X108、 5 X107、 5Xl(f、 5X105、 5X101、 5X10'、 5X102、 5X 10'CFU/ml。按上述方法提取腿後進行熒 光定量PCR擴增，結果在5X 10'CFU/ml均仍能觀察到"S"型曲線，表明螢光定量PCR法最低可 檢出5X10'CFU/ml的上述四種念珠菌，苯發明的試劑盒具有很強的靈敏性。
具體實施例4
隨機抽取的10份樣品，經多重螢光定量PCR法進行4次重複實驗，結果均與常規真菌培養 結果相符，證明本發明試劑盒具有很好的重複性。
表2多重螢光定量PCR法檢測標準菌株結果
標準菌株編號白色念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌熱帶念珠菌
白色念珠菌ATCC64548+一—一
白色念珠菌ATCC90028+—一—
克柔念珠菌ATCC5258，一+一—
克柔念珠菌ATCC6258一+一一
光滑念珠菌ATCC2001一—+—
熱帶念珠菌ATCC750——一+
乳酒念珠菌ATCC10022———一
近平滑念珠菌ATCC22019一t—一
季也蒙念珠菌ATCC6260一——一
葡萄牙念珠菌ATCC38533一—一—
黑麴黴菌ATCC16404一—一
煙麴黴菌ATCC10894—一一一
土麴黴菌ATCC10020一一一一標準菌株 編號
白色念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌熱帶念珠菌
黃麴黴菌 ATCC 16870
大腸埃希菌 ATCC 35218 肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 陰溝腸桿菌 ATCC 700323 流感嗜血桿菌 ATCC 49247 銅綠假單胞杆f ATCC 27853
表3多重螢光定量PCR法檢測fe床分離菌株結果
菌株種類 多重螢光定量PCR法結果
白色念珠菌(n=18)白色念珠菌18/18
克柔念珠菌(n=10)10/10
光滑念珠菌(n=16)光滑念珠菌16/16
熱帶念珠菌(n=16)熱帶念珠菌16/16
乳酒念珠菌(n=2)陰性2/2
季也蒙念珠菌(n=2)陰性 t2/2
近平滑念珠菌(n=8)陰性8/8
葡萄牙念珠菌(n=6)陰性6/6
新生隱球菌(n=2) ,陰性2/2
通過上述具體實施例可知，念珠菌核糖體RNA基因(rDNA)為串連重複序列，由編碼 18S rRNA、 5. 8S rRNA、 28SrRNA的基因和相互之間的轉錄間隔區(internally transcribed spacers ，ITS)構成。編碼rRNA的基因在生物進化過程中相對保守， 一定程度上反映了各 物種間的進化關係和種間差異，可作為研究生物系統進化和分類的可靠參照物，設計通用 引物。ITS區進化速率較快，具有一定的種間變異性和種內保守性，可用於區分同屬不同種 乃至種內水平的變異。其中，ITSII區有較高的種間變異性和種內特異性，可用來設計種特 異核酸探針。根據保守區設計的通用引物和針對可變區'設計的種特異核酸探針，不僅可以 把真菌跟其他病原菌區分開來，而且可將其鑑定到種。序列表
廣州醫學院第一附屬醫院、廣州呼吸疾病研究所、呼吸疾病國家重點實驗室
檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法
<160〉 2
<210〉1
<211〉
〈212〉DNA ,
人工序列
<220〉
為了用於病毒、細菌等病原體的檢測而設計的引物，用作螢光定量PCR擴增 <400〉1
正向引物(P1): ggcatgcctg tttgagcgt 19 反向引物(P2): tcctccgctt attgatatgc 20
2
<211〉
DNA
人工序列
<220〉
〈223〉為了用於病毒、細菌等病原體的檢測而設計的四種特異性螢光定量PCR探針序列及 螢光標記序列，用作螢光定量PCR擴增 ' 2
白色念珠菌 FAM_ cctaagccattgtcaaagcgatcccg-BHQ1 克柔念珠菌 HEX- tcggagctgcgactcgcctga-BHQ1 光滑念珠菌 CY5- ttaatctgctgctcgtttgcgcga-BHQ3 熱帶念珠菌麗-cgcttattttgc"gtggccaccaca-BHQ權利要求
1、檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特徵是1)在所述試劑盒內設有螢光定量PCR反應液、至少四種念珠菌的陽性質控品和陰性質控品；2)所述螢光定量PCR反應液含有特異性引物和至少四種念珠菌相對應的螢光探針，所述特異性引物序列如序列表SEQ ID №1所示；3)所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌或由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌加上若干種其他侵襲性念珠菌的標準菌株經「煮沸法」獲得的DNA樣品，所述陰性質控品為滅菌三蒸水。
2、 如權利要求l所述的檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，其特徵 是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念 珠菌的標準菌株經"煮沸法"獲得的DNA,樣品；與白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、 熱帶念珠菌相對應的螢光探針序列如序列表SEQ IDNs: 2所示。
3、 如權利要求l所述的檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，其特徵 是所述其他侵襲性念珠菌可以是近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念 珠菌中的一種或任意二種以上組合。
4、 檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法，其特徵在於包括以下步驟1) 用"煮沸法"從待測標本中提取DNA;2) 分別取第l)步中待測標本的DNA和與所述DNA同樣量的陽性質控品，加入到含有 螢光定量反應液的PCR反應體系中；3) 用螢光定量PCR檢測儀進行檢測，'根據反應結果的Ct值，對檢測結果進行判斷。4) 所述結果判斷方法是檢測樣品Ct值《35.0者，且出現典型的擴增曲線判為陽性； 無Ct值，且無典型的擴增曲線者判為陰性；若Ct值〉35.0,且出現典型的擴增曲線的樣 本，按前述步驟重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
5、 如權利要求4所述檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法， 其特徵在於螢光定量PCR反應體系的反應條件是95。C變性10rain， 95。C30s， 59。Clmin， 59'Clmin，擴增50個循環。
6、 如權利要求4所述檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法， 其特徵在於所述Ct值指螢光信號在每次循環的延伸階段收集，螢光信號閾值以剛好超過 正常陰性對照擴增曲線的最高點為準，擴增產物的螢光信號達到閾值時所需的擴增循環次 數。
全文摘要
本發明涉及檢測四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法，其特徵是在試劑盒內設有含有特異性引物和至少四種念珠菌相對應的螢光探針的螢光定量PCR反應液、至少四種念珠菌的陽性質控品和陰性質控品，根據螢光定量PCR檢測儀檢測的Ct值進行判斷。本發明試劑盒具有特異性好，靈敏度高的特點；通過引物高特異擴增和螢光探針的高特異雜交雙重控制，假陽性低；能簡便、快速、特異、靈敏地同時檢測四種對氟康唑等臨床一線抗真菌藥敏感性不同的侵襲性念珠菌。
文檔編號G01N21/64GK101509037SQ20091003818
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者何為群, 劉曉青, 張彥峰, 淳 楊, 靈 楊, 袁錦屏, 邱桂霞, 黃紅川, 黎毅敏 申請人:廣州醫學院第一附屬醫院;廣州呼吸疾病研究所;呼吸疾病國家重點實驗室