三維dna納米結構、電化學生物傳感器及其製備方法和應用的製作方法
2023-08-13 15:14:31 2
三維dna納米結構、電化學生物傳感器及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及三維DNA納米結構、電化學生物傳感器及其製備方法和應用。所述三維DNA納米結構為六面體結構，且所述六面體結構可通過與不同目標分子相結合而發生結構轉變並導致電化學信號轉變。所述三維DNA納米結構單元底面四個頂點通過自組裝作用固載在金電極表面。本發明將該DNA納米結構組裝在電極表面構置了新型電化學生物傳感器，六面體結構的DNA具有高特異性識別目標分子和高穩定性的特性，提高了電化學生物傳感器的分析性能；本發明所構置的電化學生物傳感器可通過替換DNA鏈實現凝血酶、溶菌酶等不同待測物的檢測，應用範圍廣泛。
【專利說明】三維DNA納米結構、電化學生物傳感器及其製備方法和應 用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於電化學【技術領域】，具體涉及一種三維DNA納米結構、基於所述三維DNA 納米結構的電化學生物傳感器及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002] DNA電化學生物傳感器是一種利用DNA分子卓越的自組裝和識別能力，由固定化 的生物敏感材料核酸作識別元件與電極及信號放大裝置構成的分析工具或系統。由於其具 有靈敏度高、成本低、易於微型化等特點已成為目前分析化學研究中最活躍的領域之一。然 而，採用一維（單鏈DNA)或二維結構（如髮夾結構）DNA作為識別元件，其傳感界面的均一 性在製備過程中難以得到有效控制，尤其是其穩定性仍不高，因而影響了傳感器分析特性 的提高以及在實際檢測中的應用前景。三維結構DNA探針由於具有高結構穩定性和剛性， 能在電極表面實現精確的納米構築，因而可以有效提1? DNA探針在表面分布排列的均一 性，精確調控探針之間的距離，為具有優異分析特性的新型生物傳感平臺的功能設計注入 了新的活力，並成為電分析發展的最前沿。
[0003] 為了實現基於三維DNA納米結構的生物傳感界面的構築，首先需要建立高特異 性、高穩定性的三維DNA納米結構，而組裝效率和結構穩定性是該研究中的關鍵因素之一。
[0004] 研究發現，組裝效率會隨著目標結構的尺寸降低而增加，四面體結構的組裝效率 可達90 %，而十二面體的組裝效率降低為76 %，對於巴克球結構其組裝效率僅69 %，表明 形成三維DNA的結構越複雜就需要越多的結節，且組裝效率也相應降低。若利用一條由286 個核苷酸組成的DNA鏈在體組裝成為具有四面體結構的DNA納米結構，可簡化組裝過程並 消除了配比影響，從而提高了三維DNA的組裝效率，並具有易擴增、易製備、穩定性高等特 點。
[0005] 最近，人們發現利用DNA組裝形成的機械強度與結構穩定性高的"金字塔"狀DNA 四面體結構非常適用於將生物分子固定在電極表面，從而構建新型生物傳感界面，並且組 裝效率也提高至85%。
[0006] 然而，一個理想的分析體系，不僅應該具有高靈敏的優點，還應該具有可控的功能 以實現複雜體系中高選擇性檢測、高穩定性的優點。與基於一維和二維DNA納米結構的生 物傳感器相比，雖然一維和二維DNA納米結構DNA序列在識別目標物時具有很高的特異性， 但仍非常容易受到剩餘序列部分的背景幹擾、核酸降解以及非特異性建合等幹擾，尤其是 針對複雜生物環境下的基因檢測。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術的缺陷或不足，本發明的目的之一是提供一種三維DNA納米結構。
[0008] 為此，本發明的三維DNA納米結構，其P1、P2、P3和P4四條鏈，其中：
[0009] 5'端到3'端Pl鏈的組成為：Pl標記碳鏈、Pl骨架DNA序列、Pl非目標識別DNA 序列、Pl轉角DNA序列、目標一識別DNA序列、Pl電化學標記DNA序列；
[0010] 5'端到3'端P2鏈的組成為：P2標記碳鏈、P2骨架DNA序列、與目標二識別DNA 序列雜交的DNA序列、P2轉角DNA序列、與Pl非目標識別DNA序列雜交的DNA序列、P2電 化學標記DNA序列；
[0011] 5'端到3'端P3鏈的組成為：P3標記碳鏈、P3骨架DNA序列、與目標一識別DNA序 列雜交的DNA序列、P3轉角DNA序列、P3非目標識別DNA序列、P3電化學標記DNA序列；
[0012] 5'端到3'端P3鏈的組成為：P4標記碳鏈、P4骨架DNA序列、與P3非目標識別DNA 序列雜交的DNA序列、P4轉角DNA序列、目標二識別DNA序列、P3電化學標記DNA序列；
[0013] 所述P1、P2、P3和P4四條鏈之間匹配連接組成三維六面體DNA納米結構。
[0014] 優選的，所述Pl標記碳鏈、P2標記碳鏈、P3標記碳鏈、P4標記碳鏈均為HS-C6 ;
[0015] 所述P1、P2、P3和P4四條鏈的骨架DNA序列均為4?30個A或T鹼基，且四條鏈 的骨架DNA序列相同；
[0016] 所述目標一識別DNA序列為對待測物一具有特異性識別的適體鏈，其長度為15? 60個鹼基構成；
[0017] 所述目標二識別DNA序列為對待測物二具有特異性識別的適體鏈，其長度為15? 60個鹼基構成；
[0018] 所述Pl轉角DNA序列、P2轉角DNA序列、P3轉角DNA序列、P4轉角DNA序列均由 2?4個A或T鹼基構成，四條鏈的轉角DNA序列相同或不同；
[0019] 所述Pl非目標識別DNA序列為15?60個鹼基；
[0020] 所述P3非目標識別DNA序列為15?60個鹼基；
[0021] Pl非目標識別DNA序列與P3非目標識別DNA序列相同或不同；
[0022] 所述四條鏈的電化學標記DNA序列為二茂鐵DNA序列、聯吡啶釕DNA序列、亞甲基 藍DNA序列、過氧化物酶DNA序列或葡萄糖氧化酶DNA序列，且四條鏈的電化學標記DNA序 列相同或不同。
[0023] 上述三維DNA納米結構的製備方法，該製備方法包括：
[0024] 將含有Pl鏈、P2鏈、P3鏈、P4鏈、氯化鎂和氯化鈉的混合溶液置於75?95°C條 件下處理適當時間後，再在4°C條件下處理適宜的時間得到六面體DNA納米結構。
[0025] 優選的，混合溶液中Pl鏈的濃度均為0. IX KT6mol · I/1?5. OX KT6mol · I/1 ; P2鏈的濃度均為0· lXl(T6mol · I/1?5. 0Xl(T6mol · I/1 ;P3鏈的濃度均為 0· lXl(T6mol · I/1 ?5. 0Xl(T6mol · I/1 ;P4 鏈的濃度均為 0· lXl(T6mol · I/1 ? 5. OX l(T6m〇l · L - 1 ;四條鏈的濃度相同或不同，氯化鎂的濃度為10?50. OmM ;氯化鈉的濃 度為0. 1?0. 5M75?95°C條件下處理30秒?2分鐘，4°C條件下處理5秒?30秒。
[0026] 針對現有技術的缺陷或不足，本發明的又一目的是提供一種基於三維DNA納米結 構的電化學生物傳感器的製備方法。
[0027] 為此，本發明提供的基於三維DNA納米結構的電化學生物傳感器的製備方法包 括：將金電極置於權利要求1-2中任一權利要求所述六面體DNA納米結構的溶液中，避光條 件下反應後得到電化學生物傳感器。
[0028] 優選的，將金電極置於上述含有0. IX 10_6mol · I/1?5. OX 10_6mol · I/1的六面 體DNA納米結構的溶液中，避光震蕩條件下反應一段0. 5-10小時，用含有0. 1?0. 5M NaCl 的10. OmM、pH 7. 4的TE緩衝液淋洗後即得到電化學生物傳感器。
[0029] 本發明所使用的金電極為內徑Imm的金盤電極，電極表觀面積約為0. 785mm2。
[0030] 具體的，所述四條P1、P2、P3和P4DNA鏈分別為：
[0031] Pl ：
[0032] 5'-HS-C6-TTTTTTTTTTTTTATCACCAGGCAGTTGATTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-Fc-3' ；
[0033] P2 ：
[0034] 5'-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCTAAGTAACTCTGCACTCTTTAGCCCTGATTTTCAACTGCCTGGTGAT ATTT-Fc-3,；
[0035] P3 ：
[0036] 5'-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCCAACCACACCAACCTTTTCAGACTTAGGAATGTTTT-Ru(bp y) 32+-3,；
[0037] P4 ：
[0038] 5'-HS-C6-TTTTTTTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAATTATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTA GTTT-Ru (bpy) 32+-3 ' ；
[0039] 本發明的另一目的是提供上述方法製備的電化學生物傳感器用於檢測凝血酶和 溶菌酶的應用，該應用包括：
[0040] 電解液為0. IM的PBS溶液，循環伏安圖的測量設定掃速為50mV · s_ \電化學微 分脈衝伏安圖譜的測量設定脈衝寬度〇. 〇2s，脈衝高度0. 04V，脈衝周期0. Is。電位範圍 為-0· 2 ?I. 3V。
[0041] 與現有技術相比，本發明的優點在於：
[0042] (1)本發明構置了具有剛性結構的六面體形狀DNA納米結構，且DNA納米結構通過 四個巰基固載在電極表面，大大提高了所製備的傳感器的穩定性，識別層結構有序以及空 間可控的特點還提高了傳感器的靈敏度和選擇性；同時與傳統DNA傳感器相比，本發明基 於三維DNA納米結構所構置的傳感器具有靈敏度高、選擇性好和穩定性高的特點。
[0043] (2)本發明製備的DNA納米結構可通過對凝血酶、溶菌酶等目標物的識別，進行六 面體結構的轉變，因而所構置的傳感器具有高特異性的特點；還可通過將製備的DNA納米 結構組裝在納米金、石墨烯等納米材料表面，有利於修飾分子在電極表面的大量固定，有效 增加信號分子與工作電極之間的電子傳遞速率，從而構置出高性能電化學生物傳感器。
[0044] (3)本發明應用範圍廣泛，可通過替換與不同目標分析物識別的DNA鏈、標記分子 以及酶等標記物，構置出不同傳感器，可用於凝血酶、溶菌酶等不同被分析物的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045] 圖1為四條鏈P1、P2、P3和P4的組裝圖；
[0046] 圖2為六面體DNA納米結構和電化學生物傳感器的組裝圖；
[0047] 圖3為實施例1的六面體DNA納米結構TEM圖；
[0048] 圖4為實施例2的六面體DNA納米結構在金電極表面組裝AFM圖；
[0049] 圖5為實施例3的電化學傳感器對應於凝血酶、溶菌酶傳感過程的循環伏安對照 圖；
[0050] 圖6為實施例3的電化學傳感器對應於凝血酶傳感過程的微分脈衝伏安圖；
[0051] 圖7為實施例3的電化學傳感器對應於溶菌酶傳感過程的微分脈衝伏安圖；
[0052] 圖8為實施例3的電化學傳感器對應於凝血酶、溶菌酶傳感過程的微分脈衝伏安 圖；
[0053] 圖9為實施例3的電化學生物傳感器用於凝血酶、溶菌酶測定的線性關係圖；
[0054] 圖10為實施例4的電化學生物傳感器用於實際樣品中凝血酶測定的柱狀圖；
[0055] 圖11為實施例4的電化學生物傳感器用於實際樣品中溶菌酶測定的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0056] 本發明的六面體DNA納米結構的構成由四條DNA鏈通過鹼基互補配對作用結合而 成，每條DNA鏈的組成結構單元均由六部分構成：
[0057] 序列（1)標記碳鏈；
[0058] 序列⑵骨架DNA序列；
[0059] 序列（3)目標識別適體DNA序列（或適體匹配DNA序列）；
[0060] 序列⑷轉角DNA序列；
[0061] 序列（5)非目標識別DNA序列（或非目標識別匹配DNA序列）；
[0062] 序列（6)電化學標記DNA序列。
[0063] 其中：
[0064] 序列（1)優選HS-C6 ;巰基標記碳鏈是DNA進行修飾的一種方法，可由生物公司合 成；將DNA進行巰基標記可使DNA能通過-SH (巰基）與金電極（Au)之間形成Au-S鍵，從 而將DNA組裝在電極表面。
[0065] 序列⑵可由4?30個A或T鹼基作為構成六面體DNA的骨架序列，設計原則是 與其它DNA序列發生雜交的比率要低；
[0066] 序列（3)要選擇對待測物具有高特異性識別的適體鏈，其長度由待測物決定，可 由15?60個鹼基構成（適體DNA序列確定後，其匹配序列即可確定）；
[0067] 序列⑷轉角DNA序列可由2?4個A或T鹼基構成；
[0068] 序列（5)非目標識別DNA序列可隨機選擇，設計原則是與其它DNA序列發生雜交 的比率要低，其長度可為15?60個鹼基（非目標識別匹配DNA序列確定後，其匹配序列即 可確定）；
[0069] 序列出）電化學標記可選擇具有良好電化學響應的物質作為標記物，例如二茂 鐵、聯吡啶釕、亞甲基藍、過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等，DNA序列通常可由2?4個A或T鹼 基構成，電化學標記DNA是使DNA結構的變化能通過電化學方法進行檢測的一種方法，標記 的物質本身具有氧化還原活性，從而通過標記物質的電化學響應實現檢測。
[0070] 本發明四條鏈中的巰基標記碳鏈保持一致是為了防止鏈與鏈之間形成雜交而影 響結構準確性的一種方式，一般都設計成一致的。
[0071] 本發明四條鏈中骨架DNA序列也是為了防止鏈與鏈之間形成雜交而影響結構準 確性。
[0072] 本發明四條鏈中電化學標記DNA序列保持一致是為了降低非特異性雜交的發生。
[0073] 將按上述原則設計的四條DNA鏈按合適的比例混合時，例如1:1:1:1的摩爾比例， 每條DNA鏈中的適體DNA序列和非目標識別DNA序列就會與DNA鏈中的適體匹配DNA序列 和非目標識別匹配DNA序列發生雜交，形成三維DNA納米結構。
[0074] 在製備生物傳感器時，4個標記末端同時與金電極通過金-標記末端結合在電極 表面時，即形成六面體DNA納米結構。
[0075] 以可用於識別凝血酶和溶菌酶的電化學生物傳感器構置為例，DNA序列為PI、P2、 P3和P4,其中Pl和P2兩條核苷酸鏈為釕聯吡啶標記，另兩條P3和P4為二茂鐵標記。四 條鏈的序列構成參見表1。
[0076] 以下是發明人提供的具體實施例，以幫助公眾對本發明的技術方案作詳細理解。
[0077] 實施例1 :
[0078] 該實施例為六面體納米結構的製備：
[0079] 將等摩爾質量的四條DNA鏈（P1、P2、P3和P4,四條鏈的序列如表1所示），四條鏈 的濃度為 5. OX KT6mol ?Ι/1，加入到含有 IOmM MgCl2 和 0· IM NaCl 的 20. OmM TE (pH 8. 0) 緩衝液中，混合均勻後置於95°C水浴中30秒，然後轉入到4°C水浴中30秒，即得到六面體 DNA納米結構。
[0080] 如圖1和2所示，六個面中各個邊分別由表1中的1-9序列構成，其中，a，b，c，d 邊相同，對應於表1中1，2序列；e邊對應於表1中3和3'序列；f邊對應於表1中5和5' 序列；g邊對應於表1中7和7'序列；h邊對應於表1中8和8'序列。
[0081] 將得到的DNA納米結構用TEM表徵，所製得的六面體結構DNA如圖3中A圖所示； 當電鏡照射時間延長，如圖3中B圖所示，DNA納米結構由於被分解而逐漸消失，從而在電 鏡圖中形成空白斑點。
[0082] 實施例2 ：
[0083] 該實施例為生物傳感器的製備：
[0084] (1)將金電極分別用0. 3μπι和0.05μπιγ-Α1203粉將其打磨至光滑鏡面，用去離 子水仔細衝洗乾淨後，將電極置於H 2S04/H202 (3:1)的混合液中，超聲洗滌5分鐘，再依次用 乙醇和去離子水各超聲洗滌5分鐘，最後用氮氣吹乾備用。
[0085] (2)如圖2所示，將處理後的金電極置於實施例1製得的含有六面體DNA納米結 構的溶液中，避光震蕩條件下反應10小時，通過-SH(巰基）與金電極（Au)之間形成Au-S 鍵，從而將DNA組裝在電極表面，用緩衝液淋洗後即得到電化學生物傳感器。
[0086] 電極表面採用AFM進行形貌表徵，如圖4所示，DNA納米結構均勻的組裝在金電極 表面。
[0087] 實施例3 ：
[0088] 該實施例是利用實施例2得到的電化學生物傳感器檢測凝血酶、溶菌酶：
[0089] 圖2下方所示的三個金電極分別表示：六面體結構DNA修飾金電極對應於待測溶 液中僅含有凝血酶、同時含有凝血酶和溶菌酶、僅含有溶菌酶時，DNA納米結構在電極表面 結構的變化。
[0090] 檢測1 :將實施例2製得的電極置於含有5. OX I(TicW)I ?廠1的待測物凝血酶的溶 液中，反應一段時間後，將電極轉移至空白緩衝溶液中，記錄其電化學信號。電化學循環伏 安圖譜的測量在含有〇. IM的PBS溶液中進行，掃速50mV · s_\電位範圍為-0. 2?I. 3V， 當體系中未加入待測物質時，循環伏安曲線出現兩對氧化還原峰（圖5曲線a)，一對峰電位 為0. 25V，另一對峰電位為I. 03V。
[0091] 檢測2 :將實施例2製得的電極置於含有5. 0X10_1(lmol ?Ι/1的待測物溶菌酶的溶 液中，反應一段時間後，將電極轉移至空白緩衝溶液中，記錄其電化學信號；當向體系中加 入凝血酶時，循環伏安曲線中峰電位為0. 25V的峰消失，峰電位為I. 03V的峰保持不變（圖 5曲線b);當向體系中加入溶菌酶時，循環伏安曲線中峰電位為I. 03V的峰消失，峰電位為 0· 25V的峰保持不變（圖5曲線c);
[0092] 檢測3 :將實施例2製得的電極置於含有5.0X10_1(lm〇l · I/1的溶菌酶和 δ.ΟΧΚΓΜπιοΙ ?Ι/1的凝血酶的待測溶液中，反應一段時間後，將電極轉移至空白緩衝溶 液中，記錄其電化學信號。若同時將凝血酶、溶菌酶加入到體系中，兩對氧化還原峰均消失 (圖5曲線d)。
[0093] 電化學微分脈衝伏安圖譜的測量在含有0. IM的PBS溶液中進行，脈衝寬度0. 02s， 脈衝高度〇. 04V，脈衝周期0. Is。
[0094] 檢測4 :圖6所示為實施例2製得的傳感器在含有5. 0X10_ 12mol · I/1凝 血酶的 Omol *L \5.0X10 13mol *L \5.0X10 12mol *L \5.0X10 nmol · L 工、 5.0X10_1(lm〇l · Ι/^δ.ΟΧΚΓ^ιοΙ · I/1溶菌酶溶液中反應後獲得的微分脈衝伏安圖（按 該段所述濃度順序依次為圖6曲線a?g)。
[0095] 檢測5:圖7所示為實施例2製得的傳感器在含有5.0X10_12mol ?Ι/1溶 菌酶的 Omol *L \l.0X10 13mol *L \5.0X10 13mol *L \8.0X10 13mol · L 工、 I. OX 10 12mol *L \5.0X10 12mol *L \l.0X10 nmol *L \5.0X10 nmol · L \ 5.0X10_1Qm〇l · Ι/^δ.ΟΧΚΓ^ιοΙ · I/1凝血酶溶液中的微分脈衝伏安圖（按該段所述濃 度順序依次為圖7曲線a?j)。
[0096] 檢測6:圖8為實施例2製得的傳感器對於含有Omol 0ΧΚΓ 13mol ?Ι/1、 5. OX 10 13mol *L \l.0X10 12mol *L \5.0X10 12mol *L \l.0X10 nmol · L \ 5. 0XKTnmol · L'l. OXlO^mol · L'5. OXlO^mol · I/1 凝血酶、溶菌酶同時檢測的 微分脈衝伏安圖（按該段所述濃度順序依次為圖8曲線a?i)。
[0097] 圖9為傳感器對於凝血酶、溶菌酶檢測的線性關係圖，線性範圍均為2. 0 X KT13? 5. 0X10_lclmol · L - 1，檢出限為 7X10_14mol · L - HS/N = 3)。
[0098] 實施例4 ：
[0099] 將實施例1製得的傳感器應用於實際樣品中凝血酶、溶菌酶的測定，見圖10和圖 11，分別將古柯鹼加入到20%、50%的血樣中，採用電化學法進行了測定。結果表明，實際樣 品中的複雜組分不會干擾凝血酶、溶菌酶的測定，可應用於血樣中凝血酶、溶菌酶的檢測。 [0100]
【權利要求】
1. 一種三維DNA納米結構，其特徵在於，其包括P1、P2、P3和P4四條鏈，其中： 5'端到3'端P1鏈的組成為：P1標記碳鏈、P1骨架DNA序列、P1非目標識別DNA序 列、P1轉角DNA序列、目標一識別DNA序列、P1電化學標記DNA序列； 5'端到3'端P2鏈的組成為：P2標記碳鏈、P2骨架DNA序列、與目標二識別DNA序列 雜交的DNA序列、P2轉角DNA序列、與P1非目標識別DNA序列雜交的DNA序列、P2電化學 標記DNA序列； 5'端到3'端P3鏈的組成為：P3標記碳鏈、P3骨架DNA序列、與目標一識別DNA序列 雜交的DNA序列、P3轉角DNA序列、P3非目標識別DNA序列、P3電化學標記DNA序列； 5'端到3'端P3鏈的組成為：P4標記碳鏈、P4骨架DNA序列、與P3非目標識別DNA 序列雜交的DNA序列、P4轉角DNA序列、目標二識別DNA序列、P3電化學標記DNA序列； 所述PI、P2、P3和P4四條鏈之間匹配連接組成三維六面體DNA納米結構。
2. 如權利要求1所述的三維DNA納米結構，其特徵在於， 所述P1標記碳鏈、P2標記碳鏈、P3標記碳鏈、P4標記碳鏈均為HS-C6 ; 所述P1、P2、P3和P4四條鏈的骨架DNA序列均為4?30個A或T鹼基，且四條鏈的骨 架DNA序列相同； 所述目標一識別DNA序列為對待測物一具有特異性識別的適體鏈，其長度為15?60 個鹼基構成； 所述目標二識別DNA序列為對待測物二具有特異性識別的適體鏈，其長度為15?60 個鹼基構成； 所述P1轉角DNA序列、P2轉角DNA序列、P3轉角DNA序列、P4轉角DNA序列均由2? 4個A或T鹼基構成，且四條鏈的轉角DNA序列相同； 所述P1非目標識別DNA序列為15?60個鹼基； 所述P3非目標識別DNA序列為15?60個鹼基； P1非目標識別DNA序列與P3非目標識別DNA序列相同； 所述四條鏈的電化學標記DNA序列為二茂鐵DNA序列、聯吡啶釕DNA序列、亞甲基藍 DNA序列、過氧化物酶DNA序列或葡萄糖氧化酶DNA序列，且四條鏈的電化學標記DNA序列 相同。
3. 如權利要求1所述的三維DNA納米結構，其特徵在於： 所述四條P1鏈、P2鏈、P3鏈和P4鏈序列分別為： P1 ： 5' -HS-C6-TTTTTTTTTTTTTATCACCAGGCAGTTGATTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-Fc-3,； P2 ： 5' -HS-C6-TTTTTTTTTTTTCTAAGTAACTCTGCACTCTTTAGCCCTGATTTTCAACTGCCTGGTGATATT T-Fc-3,； P3 ： 5，-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCCAACCACACCAACCTTTTCAGACTTAGGAATGTTTT-Ru(bpy) 32+-3，； P4 ： 5' -HS-C6-TTTTTTTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAATTATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAGTT T_Ru (bpy) 32+_3'。
4. 如權利要求1所述的三維DNA納米結構的製備方法，其特徵在於，該製備方法包括： 將含有P1鏈、P2鏈、P3鏈、P4鏈、氯化鎂和氯化鈉的混合溶液置於75?95°C條件下 處理適當時間後，再在4°C條件下處理適宜的時間得到六面體DNA納米結構。
5. 如權利要求4所述的三維DNA納米結構的製備方法，其特徵在於， 混合溶液中P1鏈的濃度均為〇. lXl(T6mol ? I/1?5. 0Xl(T6mol ? I/1 ;P2鏈的濃度 均為 0? lXl(T6mol ?廠1 ?5. 0Xl(T6mol ? I/1 ;P3 鏈的濃度均為 0? lXl(T6mol ?廠1 ? 5.0Xl(T6mol .1/1 ;P4 鏈的濃度均為 0? lXl(T6mol .I/1 ?5.0Xl(T6mol .I/1 ;四條鏈的 濃度相同或不同，氯化鎂的濃度為10?50. OmM ;氯化鈉的濃度為0. 1?0. 5M ; 75?95°C條件下處理30秒?2分鐘，4°C條件下處理5秒?30秒。
6. -種電化學生物傳感器的製備方法，其特徵在於，該製備方法包括： 將金電極置於權利要求1-3中任一權利要求所述六面體DNA納米結構的溶液中，避光 條件下反應後得到電化學生物傳感器。
7. 如權利要求6所述的電化學生物傳感器的製備方法，其特徵在於，該製備方法包括： 將金電極置於上述含有〇. lXl(T6mol ? I/1?5. 0Xl(T6mol ? I/1的六面體DNA納米結構 的溶液中，避光震蕩條件下反應一段〇. 5-10小時，用含有0. 1?0. 5M NaCl的10. OmM、pH 7. 4的TE緩衝液淋洗後即得到電化學生物傳感器。
8. 如權利要求7所述的電化學生物傳感器的製備方法，其特徵在於，所述金電極為內 徑是1mm的金盤電極，電極表觀面積為0. 785mm2。
9. 如權利要求6所述的電化學生物傳感器的製備方法，其特徵在於： 所述四條P1鏈、P2鏈、P3鏈和P4鏈序列分別為： P1 ： 5' -HS-C6-TTTTTTTTTTTTTATCACCAGGCAGTTGATTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-Fc-3,； P2 ： 5' -HS-C6-TTTTTTTTTTTTCTAAGTAACTCTGCACTCTTTAGCCCTGATTTTCAACTGCCTGGTGATATT T-Fc-3,； P3 ： 5，-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCCAACCACACCAACCTTTTCAGACTTAGGAATGTTTT-Ru(bpy) 32+-3，； P4 ： 5' -HS-C6-TTTTTTTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAATTATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAGTT T_Ru (bpy) 32+_3'。
10. 權利要求9所述製備方法製備的電化學生物傳感器用於檢測凝血酶和溶菌酶的應 用，其特徵在於，該應用包括： 電解液為〇. 1M的PBS溶液，循環伏安圖的測量設定掃速為50mV ? s '電化學微分脈衝 伏安圖譜的測量設定脈衝寬度〇. 〇2s，脈衝高度0. 04V，脈衝周期0. ls，電位範圍為-0. 2? 1. 3V。
【文檔編號】G01N27/48GK104391018SQ201410566537
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月22日 優先權日:2014年10月22日
【發明者】盛慶林, 劉江濤, 張賽, 武倩, 聶菲, 鄭建斌 申請人:西北大學