一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統及遺傳分析方法

2023-08-13 13:24:06 2

專利名稱：一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統及遺傳分析方法
技術領域：
本發明涉及水產遺傳育種領域，具體說是一種三疣梭子蟹多元高通量 遺傳標記系統及遺傳分析方法。
背景技術：
隨著生物技術的發展，分子標記也在不斷更新，目前廣泛應用在海洋
動物遺傳學分析中的標記是線粒體序列和微衛星標記。線粒體序列(mtDNA) 作為核外遺傳物質，具有進化速度快、非重組變異和母系遺傳等特點，完 全相同的序列信息表明樣品來源於同一母本。常用作種內遺傳分析的mtDNA 片段有COI， 16S和CR。微衛星(SSRs)是在真核和原核生物基因組中存在的 由2-6個鹼基構成的串聯重複序列，具有高度多態性和共顯性特點。微衛 星標記能夠提供雙親的遺傳信息，尤其應用在揭示個體間和群體間的基因 交流、推測親權關係和雜交現象的分析中，能更全面的反映群體間的遺傳 關係。基因組微衛星標記常被用於瀕危珍貴保護動物以及海洋經濟物種的
遺傳多樣性評估及系譜認證。目前，三疣梭子蟹序列信息(國際共享數據 庫GenBank中公布112個核苷酸序列和494個EST序列)還沒有被系統的
開發並真正應用於遺傳育種所需的系譜認定和遺傳關係分析中。

發明內容
本發明的目的在於提供一種快速、有效的三疣梭子蟹多元高通量遺傳 標記及遺傳分析方法。
為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為
三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統所述多元高通量遺傳標記系統 為線粒體序列信息系統和微衛星分子標記系統，其中微衛星分子標記系統 為由7個SSR標記的系統1和6個SSR標記的系統2組成；
系統1由7個SSR標記組成，擴增7個SSR標記的7對引物分別是
E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統2由6個SSR標記組成，擴增6個SSR標記的6對引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC);E28(F : CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG);
C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA);
H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA);
E17 (F:ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
所述線粒體序列信息系統，擴增CO 1, 16S和CR序列的三對引物分別是 LCO1490 (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA); 16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT) 和CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統的遺傳分析方法首先，運用線 粒體的三對引物擴增COI, 16S和CR的序列的信息作為分子標記，將混養 家系中同一母本和不同母本所產的後代根據遺傳結構和遺傳多樣性分開，
然後再運用微衛星分子標記，將已區分母本的後代根據遺傳距離和遺傳多 樣性進行父本的區分，從而完成三疣梭子蟹遺傳育種過程中的系譜認證並 確認近交係數。所述擴增COI, 16S和CR序列的三對引物分別是 LCO14 9 0 (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA); 16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT) 和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
所述微衛星分子標記由系統1和系統2組成；
系統1由7個SSR標記組成，擴增7個SSR標記的7對引物分別是 E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT) ，■
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統2由6個SSR標記組成，擴增6個SSR標記的6對引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC); E28(F :CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG); C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA); H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA); E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。 所有引物方向為5'—3'方向。所述三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統 遺傳分析的方法可同時檢測成百上千個樣品。 本發明所具有的優點1. 育種的遺傳背景清晰，避免了傳統育種的盲目性。本發明利用線粒 體序列和微衛星作為分子標記，解析了我國海域三疣梭子蟹野生群體的遺 傳多樣性，明確了育種基礎群、育種選擇群個體間的遺傳關係，使育種材 料的選擇具有更強的目的性。
2. 本發明線粒體序列和微衛星分子標記的結合，既避免了僅用線粒體 序列無法明確父系信息的缺點，也減少了僅用微衛星標記的繁瑣，有利於 快速確認所研究個體的系譜發生。
3. 本發明應用多元高通量遺傳標記系統對育種群體遺傳多樣性的實時 監測，可以有效避免遺傳育種過程中的近交衰退，保障育種的科學性和可 持續性。


圖1為本發明遺傳分析三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統(其中數 字代表每個標記的等位基因數，橫軸所示標記名稱，縱軸所示等位基因的 大小。)。
圖2a和圖2b為運用本發明方法模擬檢測圖(其中在雙親信息未知的 情況下，運用軟體Cervus Version2. G的Simulation功能，區分400個家 系的準確率為100%;由線粒體信息確定母本後、在一個親本信息已知的情 況下，區分1000個家系的準確率為100%。)。
圖3為運用本發明家系鑑定圖(其三個家系，每個家系個體數分別為 10、 14和16。運用本發明檢測，運用軟體populations1.2. 30,釆用DAS 法計算遺傳距離，UPGMA圖顯示，正確率為100%。)。
具體實施例方式
實施例
1)三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統為線粒體序列信息系統和微衛 星分子標記系統，其中微衛星分子標記為由7個SSR標記的系統1和6個 SSR標記的系統2組成(參見圖1);
系統l由7個SSR標記組成，擴增7個SSR標記的7對引物分別是
E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統2由6個SSR標記組成，擴增6個SSR標記的6對引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC); E28(F : CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG);C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA); H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA); E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。 以上引物參見序列表。
2)三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統遺傳分析的方法首先，運用 線粒體的三對引物擴增COI， 16S和CR的序列的信息作為分子標記，將混
養家系中同一母本和不同母本所產的後代根據遺傳結構和遺傳多樣性分 開，然後再運用微衛星分子標記，將已區分母本的後代根據遺傳距離和遺 傳多樣性進行父本的區分，從而完成三疣梭子蟹遺傳育種過程中的系譜認 證並確認近交係數。
(1) 運用線粒體的三對引物擴增COI, 16S和CR的序列的信息
a. 提取三疣梭子蟹樣品的DNA;
b. 以步驟 a 的 DNA 為模板，用引物 LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)擴增 COI 片段，用引物 16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)擴 增 16S 片段，用引物 12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和 CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)擴增CR片段。上述PCR擴增產物回收、 純化並測序。PCR擴增條件為95。C變性2分鐘，32-35個循環包括95"C變 性30秒、54-56。C退火45秒、72。C延伸60秒，最後72。C延伸5分鐘.
(2) 運用微衛星分子標記
c. 以步驟a的DM為模板，分別用引物
E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT)
擴增系統1的全部微衛星標記共計7個。分別用引物E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG);
E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC);
E28(F : CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG);
C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA);
H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA);
E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)擴增系 統2的全部微衛星標記共計6個。PCR擴增條件為95。C變性2分鐘，28-32個循環包括95。C變性30秒、54-58。C退火45秒、72。C延伸60秒，最後72°(3延伸5分鐘。
將上述PCR擴增產物經8%聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，並應用Cervus Version2. G軟體進行數據處理。 應用例1
運行Cervus的模擬分析功能得到使用本發明三疣梭子蟹多元高通量遺 傳標記系統遺傳分析的方法，區分混養家系的數目與家系鑑別成功率之間 的關係，見圖2。從圖2a中紅線所示，完全使用本發明方法，由線粒體信息 確定母本後、在一個親本信息已知的情況下，再運用SSR標記系統1和系統2 可成功區分1000個家系(準確率100%);從圖2a中黑線所示，若不先使用線 粒體信息確定母本、在雙親信息未知情況下，應用SSR標記系統1和系統2僅 能區分400個家系(準確率100%);從圖2b中紅線所示，由線粒體信息確定 母本後、在一個親本信息已知的情況下，單獨應用SSR標記系統1或系統2可 成功區分300個家系(準確率100%);從圖中黑線所示，若不先使用線粒體 信息確定母本、在雙親信息未知情況下，單獨應用SSR標記系統1或系統2可 成功區分20個家系(準確率100%)。
應用例2
三個家系的樣品於2008年8月21日取自浙江省寧海縣振海水產有限公
司，每個家系都為一雌、 一雄所產的全同胞家系。分別從每個家系中隨機 取IO、 14和16隻幼蟹個體，分別編號明確其親緣關係組成樣本I 。從另一個 養殖群體中隨機選6隻雌蟹和6隻雄蟹分別編號後與真正的3對親本一起共 同作為候選親本組成樣本II。進行混養家系的分析時假定樣本I 、 II之間 的親緣關係未知，將樣本I與樣本II 一起應用本發明方法進行遺傳分析，具
體為先測定所有樣本的線粒體信息，明確母本信息並將不同母親的個體分 開；再應用SSR系統1和系統2檢測所有樣本的基因型，明確父本信息，並根 據樣本I中40個個體基因型的數據，用Populations軟體計算出個體之間 的遺傳距離，用UPGMA的方法根據個體間遺傳距離將三個家系的40個個體
分別聚成三類，同一家系的個體均被單獨聚成一類，分析的結果與記錄編號 比對，正確率100% (圖3)。
<120〉
<130〉 〈160〉


<220〉 <223〉
SEQUENCE LISTING 中國科學院海洋研究所
一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統及遺傳分析方法 32
Patentln version 3.1 1
20 DNA
人工設計
satellite (l).. (20)
<400〉 1
aaggaggagg ctttgatatg 20
〈210〉 2
20
〈212〉 脆
<213〉 人工設計
〈220〉
<221〉 satellite
(l)..咖
〈400> 2
gtcttccact cccttactgt 20
3
22
DNA
〈213〉 人工設計

satellite
<222〉 (l).. (22) 〈223〉
〈400〉 3
gccactatct tgctgaggtt ga 22
〈210〉4
22
DNA
〈213〉人工設計

satellite
〈222〉(l).. (22)

4
gccatagcac gaacactttt〈210〉 5
〈211〉 19
DNA
〈213〉 人工設計
<220〉
satellite
(1)..(19) 〈223〉〈400> 5
cctcagggca gctctggat 19
6
<211〉 20
〈212> DNA 人工設計

<221〉 satellite
<222〉 (l)..咖 〈223〉
<400〉 6
cccggactag gtgacaggtt 20
〈210〉7
21
<212〉腿
〈213〉人工設計
<220〉
〈221>satellite
(21)
〈223〉
7
aactatgggt cctgagtatt<210〉 8
18
<212〉 DNA
〈213〉 人工設計
〈220〉
<221〉 satellite
〈222〉 (1)..(18) 〈223〉
<400〉 8
ctcggtttct gtccactt 18
〈210〉 9
〈211〉 21
<212〉 DNA
人工設計
〈220>
satellite
<222〉 (1)..(21) <223〉
<400〉 9
ctgtctgatg agtgaggcta c 21
10
<211〉 18
〈212〉 腿
人工設計

〈221〉 satellite
(1)..(18)
〈400〉 10
tgaccacgag gaaaggag 18
<210〉 11 <211〉 20 〈212〉 DNA<213〉 人工設計
satellite
<222〉 (l)..咖 <223〉
〈400〉 11
tataagggct taagtgtacg 20
〈210〉12
<211〉20
廳
〈213〉人工設計

<221〉satellite
(l).. (20)

12
gatctaaact C33ggcaaaa13
<211〉21
<212〉DNA
<213〉人工設計
〈220>
〈221>satellite
(l).. (21)
<223〉
<400〉13
aatcacttca ctacaccttt21
<210〉14
〈211〉18
脆
人工設計
〈220〉
〈221>satellite
〈222〉(l).. (18)
<223〉
<■〉14
cttgatgggt ggcagtct 15
20
〈212> 腿 〈2L3〉人工設計
〈220>
<221〉 satellite
(l)..咖
<400〉 15
tactg卿cg ccgctggtta 20
〈210> 16
<211〉 20
〈212〉 腿
〈213〉 人工設計
〈220〉
<221〉 satellite
<222〉 (1)..(20) 〈223〉16
acaagatcct tcgtggtggg〈210>17
<211〉18
<212〉DNA
人工設計
<220〉
<221〉satellite
〈222〉(1). (18)〈223>
17
ccacaactgc aaacacct18
20
DNA
〈213〉人工設計

<221〉satellite
(l)..咖

〈400〉18
ttggcatttt catcacttac 19
〈211〉 21
<212〉 腿 <213〉人工設計

satellite
〈222> (1)..(21)
〈400> 19
cgttactgaa agagtggtga a 21
20
<211〉18
<212〉腿
<213〉人工設計

satellite
(l).. (18)
<223〉
20
gcagaggttg taccaccg21
18
腿
人工設計

<221〉satellite
<222〉(l).. (18)

21
agtgagatta acgcaact<210〉 22
18
〈212〉 腿
<213〉 人工設計
satellite <222〉 (1).. (18)
22
catctttcat tacaggga 18
23
<211〉 20
<212〉 腿
人工設計
〈220〉
<221〉 satellite

<400〉 23
atgggcaagc ctcttaatgt 20
<210〉 24
<211〉 20
<212〉 DNA <213〉人工設計

satellite
<222〉 (1)..(20)
<400〉 24
ggatcttcgg gt鄉actga 20
25
22
<212〉DNA
<213〉人工設計
〈220〉
<221〉satellite
(l).. (22)
<223〉
<400〉25
ataaatatct tggaagccct26
22
<212〉DNA
人工設計

satellite
〈222〉(l).. (22)
〈223〉
26
acgccacata gaacactcac<210〉27
<211〉25
〈212〉醒
avertebrate
〈220〉
<221〉gene
<222〉 (l).. (25)
<400〉27ggtcaacaaa tcataaagat attgg
25
〈210〉28
26
腿
avertebrate
〈220〉

〈222〉(l).. (26)
〈223>
<400〉28
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca
26
29
<211〉20
〈212〉腿
avertebrate
<220〉
〈221〉
〈222〉(l)..咖

29
cgcctgttta tcaaaaacat30
22
醒
〈213〉avertebrate

<221〉gsne
(l).. (22)

20
〈400〉 30
ccggtctgaa ctcagatcac gt
22
〈210〉 <212〉
31 25 腿
人工設計
〈221〉
gene
(l).. (25)
<400〉 31
aggaattaag aaacaatcaa acttt
25
<210〉32
〈211〉27
<212〉DNA
〈213〉人工設計
<220〉
<221〉
〈222>(l).. (27)
〈223>
〈400〉32
gccgttgagt gaagagtgtt cagatag
27
1權利要求
1.一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統，其特徵在於所述多元高通量遺傳標記系統為線粒體序列信息系統和微衛星分子標記系統，其中微衛星分子標記系統為由7個SSR標記的系統1和6個SSR標記的系統2組成；系統1由7個SSR標記組成，擴增7個SSR標記的7對引物分別是E13(FAAGGAGGAGGCTTTGATATG；RGTCTTCCACTCCCTTACTGT)；P04(FGCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；RGCCATAGCACGAACACTTTTGA)；E20(FCCTCAGGGCAGCTCTGGAT；RCCCGGACTAGGTGACAGGTT)；E24(FAACTATGGGTCCTGAGTATTA；RCTCGGTTTCTGTCCACTT)；C13(FCTGTCTGATGAGTGAGGCTAC；RTGACCACGAGGAAAGGAG)；C31(FTATAAGGGCTTAAGTGTACG；RGATCTAAACTCAAGGCAAAA)；H4(FAATCACTTCACTACACCTTTT；RCTTGATGGGTGGCAGTCT)；系統2由6個SSR標記組成，擴增6個SSR標記的6對引物分別是E9(FTACTGAGACGCCGCTGGTTA；RACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；E18(FCCACAACTGCAAACACCT；RTTGGCATTTTCATCACTTAC)；E28(FCGTTACTGAAAGAGTGGTGAA；RGCAGAGGTTGTACCACCG)；C14(FAGTGAGATTAACGCAACT；RCATCTTTCATTACAGGGA)；H13(FATGGGCAAGCCTCTTAATGT；RGGATCTTCGGGTAGGACTGA)；E17(FATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；RACGCCACATAGAACACTCACTC)。
2. 按權利要求1所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統，其特徵 在於所述線粒體序列信息系統，擴增COI， 16S和CR序列的三對引物分別 是 LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA); 16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT) 和CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
3. —種按權利要求1所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統的遺 傳分析方法，其特徵在於首先，運用線粒體的三對引物擴增COI, 16S和 CR的序列的信息作為分子標記，將混養家系中同一母本和不同母本所產的 後代根據遺傳結構和遺傳多樣性分開，然後再運用微衛星分子標記，將已 區分母本的後代根據遺傳距離和遺傳多樣性進行父本的區分，從而完成三 疣梭子蟹遺傳育種過程中的系譜認證並確認近交係數。
4. 按權利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統的遺傳分 析方法，其特徵在於所述擴增COI， 16S和CR序列的三對引物分別是 LC01490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA);16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
5. 按權利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統的遺傳分 析方法，其特徵在於所述微衛星分子標記由系統1和系統2組成；系統l由7個SSR標記組成，擴增7個SSR標記的7對引物分別是E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統2由6個SSR標記組成，擴增6個SSR標記的6對引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC); E28(F :CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG); C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA); H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA); E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
6. 按權利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統的遺傳分 析方法，其特徵在於所有引物方向為5'—3'方向。'
7. 按權利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統的遺傳分 析方法，其特徵在於所述三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統遺傳分析 的方法可同時檢測成百上千個樣品。
全文摘要
本發明涉及水產遺傳育種領域，具體說是一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標記系統及遺傳分析方法。多元高通量遺傳標記系統為線粒體序列信息系統和微衛星分子標記系統，其中微衛星分子標記系統為由7個SSR標記的系統1和6個SSR標記的系統2組成；方法運用線粒體的三對引物擴增COI，16S和CR的序列的信息作為分子標記，將混養家系中同一母本和不同母本所產的後代根據遺傳結構和遺傳多樣性分開，再運用微衛星分子標記，將已區分母本的後代根據遺傳距離和遺傳多樣性進行父本的區分，從而完成三疣梭子蟹遺傳育種過程中的系譜認證並確認近交係數。本發明在有效利用物種遺傳信息的基礎上，使用多元高通量遺傳標記系統區分子代之間的親緣關係，同時有效避免近交衰退。
文檔編號C12Q1/68GK101565744SQ200910015428
公開日2009年10月28日 申請日期2009年5月15日 優先權日2009年5月15日
發明者媛 劉, 吳丹華, 崔朝霞, 王鴻霞, 烽 譚 申請人:中國科學院海洋研究所