納米CaCO的製作方法
2023-08-13 15:54:16
專利名稱：納米CaCO的製作方法
技術領域：
本發明屬於以無機材料納米CaCO3為載體固定蛋白質等生物分子製備生物傳感器的方法。
背景技術：
生物傳感器是由固定化的生物材料(包括酶，抗體，微生物等生物活性物質)與適當的轉換器件密切接觸而構成的分析工具或系統。它利用的是生物活性物質的親和性，如酶-底物，酶-輔基，抗原-抗體，激素-受體等的分子識別功能，可以有選擇地測量另一方，這種敏感元件又稱分子識別元件。由於生物活性物質具有專一識別功能，使得生物傳感器具有較高的選擇性，能直接應用於複雜樣品進行檢測。生物傳感器以靈敏度高，選擇性高，分離過程和檢測技術合為一體，不需要樣品製備等特點而受到廣泛重視，目前發展很快，已應用於臨床醫學檢測、工業過程控制、環境檢測、化學物質安全性評價以及食品、製藥等許多領域。
現有的固定酶等生物活性分子的方法主要有吸附、交聯、共價鍵合、包埋等，固定材料有無機材料、高分子材料、各種複合材料等，這些方法和固定材料都各有其優缺點。因此尋找新的載體材料來提高生物傳感器測量的準確度、靈敏度、操作穩定性、使用壽命、選擇性等是科研工作者的主要目標之一。
納米CaCO3是一種非常重要的無機材料，也是納米材料的一種，因其具有原料易得、價格便宜成本低、優良的化學和物理性質等眾多優點，而被廣泛應用於橡膠、塑料、醫藥等工業應用中，而且納米CaCO3表現出遠勝於普通碳酸鈣的特性，已經引起了廣泛的研究興趣。納米CaCO3在工業上的廣泛應用，表現出較好的補強性、優異的分散性及特殊的透明性。同時納米CaCO3具有較好的生物相容性和很高的比表面積，這對生物分子的固定有著非常有利的條件，但至今納米CaCO3還從來沒有在生物傳感器方面有過實驗和應用，若將納米CaCO3用於生物傳感器的製備中可望構築性能優良的生物活性膜和高穩定、高靈敏度的生物傳感器。
發明內容
本發明的目的是提供一種穩定性好、靈敏度高的無機納米材料納米CaCO3固定蛋白質等生物分子製備生物傳感器的新方法。
本發明的技術方案是將納米CaCO3用二次蒸餾水配成膠體溶液，再將生物分子加入到膠體溶液中形成混合液，然後將混合液滴塗於基底電極表面，待溶劑80～95％被蒸發後，用戊二醛蒸氣交聯方法製備出納米CaCO3-生物分子複合生物膜，即製得所述的生物傳感器。
採用本發明方法製備出的生物傳感器穩定性好、靈敏度高、重現性好，而所需的生物分子的量少。由於製作方法也較為簡單，所以投入市場的可能性較大。用同一固定材料可製備不同功能的生物傳感器，適合多種物質的檢測，可廣泛用於醫學、食品、環境等領域，具有較高的經濟效益。
本發明所採用的電極為本領域公知的各種基底電極。
上述膠體溶液的濃度為2～5mg/ml。合適的膠體濃度目的是有利於控制修飾膜厚度，使傳感器具有高靈敏度和快速響應。
混合液中，生物分子與納米CaCO3的質量比為1∶1～3∶1。合適的質量比目的是使傳感器具有最高的響應。
滴塗在電極表面的生物分子和納米CaCO3混合溶的體積為20～50μl。滴塗量過少傳感器的靈敏度將降低。滴塗量過大，傳感器響應時間將延長，膜的滲透性將降低。
為了使納米CaCO3既具有較大的比表面積，同時防止其團聚，本發明選用的納米CaCO3的粒徑為5～100nm。
所述生物分子為含有可變價金屬的蛋白質或酶。
酶可以為葡萄糖氧化酶、黃嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、過氧化物酶、膽鹼氧化酶、乙醯膽鹼脂酶、穀氨酸氧化酶、膽固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脫氫酶、乙醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、賴氨酸氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、漆酶、脂肪酶、異檸檬酸脫氫酶中的任何一種。
本發明所述戊二醛交聯方法是將電極置於戊二醛的飽和蒸氣中交聯15分鐘，再放在冰箱中冷藏。
具體實施例方式
實施例一固定血紅蛋白製備H2O2傳感器步驟1將基底電極在蘸有三氧化二鋁水溶液的紗布上打磨至鏡面，再用二次蒸餾水超聲洗滌5分鐘，烘乾。
步驟2用二次蒸餾水配製濃度為5mg/ml的納米CaCO3膠體溶液。納米CaCO3粒徑為5～100nm。
步驟3用0.01mol/l的磷酸緩衝溶液配製15mg/ml的血紅蛋白溶液。
步驟4將膠體溶液和血紅蛋白溶液等體積混合(血紅蛋白與納米CaCO3的質量比為3∶1)，輕輕搖勻，形成混合液。
步驟5在混合液中加入濃度為2mg/ml殼聚糖溶液，殼聚糖溶液與混合液體積比為1∶6。取15μl該混合溶液均勻滴塗於面積為10mm2的玻碳電極表面，在室溫下乾燥約3小時，測定溶劑80～95％已被蒸發，將電極置於戊二醛的飽和蒸氣中交聯15分鐘，然後放入4℃的冰箱中冷藏待用。
固定的血紅蛋白體現了其直接電化學行為，並具有較好的可逆性。該生物電極對過氧化氫的還原具有電催化作用，可用於過氧化氫的檢測。該生物傳感器檢測過氧化氫的下限為8.3μM；測量過氧化氫的線性範圍為8.3μM～2.08mM，電極使用壽命為兩個月。
實施例二製備葡萄糖氧化酶傳感器步驟1將圓盤鉑電極(面積為3mm2)在蘸有三氧化二鋁水溶液的紗布上打磨至鏡面，再用二次蒸餾水超聲洗滌5分鐘，烘乾。
步驟2用二次蒸餾水配製濃度為2mg/ml的納米CaCO3膠體溶液。納米CaCO3粒徑為5～100nm。
步驟3製備濃度為2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液。
步驟4以葡萄糖氧化酶和納米CaCO3的質量比為2∶1混合，形成混合液。
步驟5取45μl該混合液均勻滴塗於圓盤鉑電極表面，待溶劑約90％被蒸發後，將電極置於戊二醛的飽和蒸氣中交聯15分鐘，然後放在冰箱中冷藏，即形成了基於納米CaCO3-葡萄糖氧化酶複合物生物膜的葡萄糖傳感器。
該生物傳感器對葡萄糖溶液的響應時間小於6秒；測量葡萄糖溶液的線性範圍為1μM～12mM；使用壽命為四個多月；檢測下限為0.1μM；電極製備的重現性好(7支酶電極同時製備，用於同一測量的相對標準偏差為5.56％)；傳感器具有較高的操作穩定性，傳感器在1mM葡萄糖溶液中連續測量140次後，響應電流基本保持不變，相對標準偏差(RSD)僅為3.0％。
實施例三製備多酚氧化酶傳感器步驟1用二次蒸餾水配製2mg/ml的納米CaCO3膠體溶液。納米CaCO3粒徑為5～100nm。
步驟2製備濃度為4mg/ml的多酚氧化酶溶液。
步驟3將圓盤玻碳電極(面積為7mm2)在蘸有三氧化二鋁水溶液的紗布上打磨至鏡面，再用二次蒸餾水超聲洗滌5分鐘，烘乾。
步驟4以多酚氧化酶和納米CaCO3的質量比為1∶1混合，形成混合液。
步驟5取20μl混合液均勻滴塗於圓盤玻碳電極表面，待溶劑約85％被蒸發後，將電極置於戊二醛的飽和蒸氣中交聯15分鐘，然後放在冰箱中冷藏，即形成了基於納米CaCO3-多酚氧化酶複合物生物膜的酚傳感器。
該生物傳感器可測定兒茶酚、苯酚等物質，生物傳感器對兒茶酚溶液的響應時間為8秒；測量兒茶酚溶液的線性範圍為6～20000nM；使用壽命為兩個多月；檢測下限為0.6nM。電極製備的重現性好(7支酶電極同時製備，用於同一測量的相對標準偏差為5.63％)；傳感器具有好的操作穩定性，傳感器在5μM兒茶酚溶液中連續測量44次後，響應電流基本保持不變。
實施例四製備黃嘌呤氧化酶傳感器步驟1用二次蒸餾水配製2mg/ml的納米CaCO3膠體溶液。納米CaCO3粒徑為5～100nm。
步驟2製備濃度為4mg/ml的黃嘌呤氧化酶溶液。
步驟3將圓盤鉑電極(面積為20mm2)在蘸有三氧化二鋁水溶液的紗布上打磨至鏡面，再用二次蒸餾水超聲洗滌5分鐘，烘乾。
步驟4以黃嘌呤氧化酶和納米CaCO3的質量比為1∶1混合，形成混合液。
步驟5取50μl混合液均勻滴塗於圓盤鉑電極表面，待溶劑約90％被蒸發後，將電極置於戊二醛的飽和蒸氣中交聯15分鐘，然後放在冰箱中冷藏，即形成了基於納米CaCO3-黃嘌呤氧化酶複合物生物膜的黃嘌呤氧化酶傳感器。
該生物傳感器可測定黃嘌呤、次黃嘌呤等物質，生物傳感器對黃嘌呤溶液的響應時間為6秒；測量黃嘌呤溶液的線性範圍為1～200μM；使用壽命為一個多月；檢測下限為0.1μM。電極製備的重現性好(9支酶電極同時製備，用於同一測量的相對標準偏差為3.38％)；傳感器具有較好的操作穩定性，傳感器在200μM黃嘌呤溶液中連續測量70次後，響應電流基本保持不變。
採用類同的方法，可分別製備成酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、過氧化物酶、膽鹼氧化酶、穀氨酸氧化酶、膽固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脫氫酶、乙醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、賴氨酸氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、漆酶、脂肪酶、異檸檬酸脫氫酶傳感器，用於相應底物的測定。
權利要求
1.納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於將納米CaCO3用二次蒸餾水配成膠體溶液，再將生物分子溶液加入到膠體溶液中形成混合液，然後將混合液滴塗於基底電極表面，待溶劑80～95％被蒸發後，用戊二醛蒸氣交聯方法製備生物傳感器。
2.根據權利要求1所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於膠體溶液的濃度為2～5mg/ml。
3.根據權利要求1所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於生物分子與納米CaCO3的質量比為1∶1～3∶1。
4.根據權利要求1所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於滴塗在電極表面的生物分子和納米CaCO3混合液的體積為20～50μl。
5.根據權利要求1所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於所述納米CaCO3的粒徑為5～100nm。
6.根據權利要求1所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於所述生物分子為含有可變價金屬的蛋白質或酶。
7.根據權利要求7所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於所述酶為葡萄糖氧化酶、黃嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、過氧化物酶、膽鹼氧化酶、乙醯膽鹼脂酶、穀氨酸氧化酶、膽固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脫氫酶、乙醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、賴氨酸氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、漆酶、脂肪酶、異檸檬酸脫氫酶中的任何一種。
8.根據權利要求1所述納米CaCO3固定生物分子製備生物傳感器的方法，其特徵在於所述戊二醛交聯方法是將電極置於戊二醛的飽和蒸氣中交聯15分鐘，再放在冰箱中冷藏。
全文摘要
納米CaCO
文檔編號G01N27/30GK1945327SQ200610096189
公開日2007年4月11日 申請日期2006年9月25日 優先權日2006年9月25日
發明者薛懷國, 朱明娟, 單丹, 王善霞 申請人:揚州大學