複合脂質用作消化酶混合物藥劑中的穩定化添加劑的用途的製作方法

2023-08-13 23:53:16 2

專利名稱：：複合脂質用作消化酶混合物藥劑中的穩定化添加劑的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及複合脂質作為消化酶混合物的水溶性藥劑中的穩定性添加劑的用途，用於對抗由於溼氣的作用而引起的脂水解活性的降低。該消化酶混合物含有蛋白酶/脂酶混合物，特別是胰酶，該藥劑適於製備水溶液，它藉助探針連續地注入到胃腸道內。此外，本發明涉及含有脂酶和蛋白酶消化酶混合物，尤其是含有胰酶的消化酶混合物的水溶性藥劑。該藥劑可經加入複合脂質，以對抗由於溼氣而使脂水解活性下降，使藥劑變得穩定化。該消化酶適於製備水溶液，它經探針注入到哺乳動物或人的胃腸道中。哺乳動物、尤其是人由於慢性胰腺炎而引起的胰腺病變，胃手術後和肝或膽疾患引起的消化不良，會出現消化酶的缺乏。皆知，這種缺乏現象可用加入非體內本身含有的胰酶的消化酶，例如胰酶、尤其是胰蛋白酶的混合物來治療，該胰蛋白酶可任選地含在脂酶添加物中。胰酶常規以固體劑型口服應用。口服時酶混合物發生不可逆地變性，是由於在胃中的胃酸和蛋白水解酶如胃蛋白酶的作用所致，因而需要用對胃液耐受的外殼包住酶混合物。這樣的包封可使酶混合物原封不動地經過胃而到達作用部位十二指腸，在十二指腸處，由於中性或弱鹼性環境，使保護層破裂，酶釋放出來。口服這樣的酶如同健康人體內固有的胰酶那樣，可發揮酶促作用，尤其是澱粉酶、脂水解酶以及蛋白水解酶。在德國專利DOS42273854中例如敘述了用對胃液耐受的包蓋膜製成固態的胰酶微粒。對於消化功能不全、尤其是長時間處於消化功能不全的臥床患者，例如慢性胰腺病患者，希望在長時間內服用液體劑型，例如經探針連續用藥的方式，以代替固體劑型。含有胰酶的消化酶混合液的劑型迄今尚沒有供應，系因這樣的酶混合液長時間放置是不穩定的。尤其是在混合物中含有的脂酶由於混合物中含有的蛋白酶如胰蛋白酯或糜蛋白酶在水的存在下被水解而破壞，使脂酶活性迅速下降。因此，根據外界條件(溫度、pH值)，水性胰酶製劑在較短時間內嚴重喪失了脂酶活性。為了適於經探針連續向患者胃腸道給藥，含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的、尤其是含胰酶製劑的消化酶混合物的水溶液在較長時間例如8小時內應是穩定的。特別是在溶液中不能生成或含有會堵塞針頭的顆粒。對這樣的溶液的重要要求是，在消化酶中含有的全部酶要在用藥的過程中儘可能保持高的和不變的活性。此外，為了胃腸道內連續用藥，必需用這樣適宜的溶液，它不得有細菌生長，例如在防止細菌生長的環境下保存，優選用滅菌方法。因此，本發明的目的是，提供含有脂酶和蛋白酶的水溶性消化酶混合物的藥劑，它在潮溼的影響下是穩定的，不會喪失脂質水解的活性。這種藥劑在水性介質中可溶，並長時間放置是穩定的。本發明涉及複合脂質作為穩定化添加劑的應用，用於在含有脂酶和蛋白酶的、特別是含胰酶的消化酶混合物的水溶性藥劑中對抗在潮溼影響下脂水解活性的降低，消化酶混合物適用於製成可藉助探針連續灌入胃腸道中的水性藥劑。本發明還涉及穩定化了的消化酶混合物的水溶性藥劑。本
發明內容還有為製備適於探針連續給藥的消化酶混合物水溶液的藥盒。本發明適於作為穩定化添加劑的複合脂質一般不溶於丙酮。尤其是含磷的和無碳水化合物的磷脂以及含碳水化合物的且不含磷的糖脂，以及它們的混合物。磷脂或含有磷酸和糖脂的混合物有利地適用於此。可用作按本發明對含有脂酶和蛋白酶的、特別是胰酶製劑的消化酶混合物進行穩定化的添加劑的磷脂，尤其宜用具有藥用陽離子的、通式I的陰離子鹽式中R1為氫或具有10-25個碳原子的烷醯基，其烷基鏈可任選含有1-4個雙鍵；R2為氫或具有10-25個碳原子的烷醯基，其烷基鏈可任選含有1-4個雙鍵；或當R1不是氫時，R2也可是氫；R3是氫或低碳烷基，烷基可被氨基、低碳三烷銨基、在帶有氨基的碳原子上結合的羧基或者被羥基取代的環烷基等取代；R4是氫或具有10-25個碳原子的烷基，烷基上可任選地含有1-4個雙鍵；A為氧或NH。作為藥用陽離子，宜用銨離子、鹼金屬-或鹼土金屬陽離子，優選用鈉、鉀或鈣，以及其它生理相容的一價或多價陽離子。若R3含有氮原子，則可形成季銨離子，後者也可作為陽離子，以致形成外部不帶電荷的內鹽。若式I化合物中R1和/或R2是烷醯基，則可為直鏈或支鏈，並且通常是直鏈的、含有10-25個、優選為16-20個碳原子的醯基。烷醯基必要時可含有至多4個雙鍵。烷醯基尤其是長鏈脂肪酸如神經酸、木蠟酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸或花生四烯酸的基團。若取代基R3代表或含有低碳烷基，低碳烷基可為直鏈或支鏈的，含1-4個、優選1-2個碳原子。若R3為羥基取代的環烷基，則它可為含3-6個碳原子的環，其上可被1個或多個羥基取代。優選的是該環烷基含5-6個碳原子的環烷基，它常可被羥基取代。基團R3O優選為羥基或被磷酸根酯化的一元或多元醇所產生的烷氧基，該一元或多元醇選自氨基乙醇，膽鹼，絲氨酸，甘油和肌醇。若基團R4為烷基，它可為直鏈或支鏈的，通常為含有10-25個、優選為12-20個，尤其是15個碳原子的直鏈烷基。該烷基鏈還任選地含有最多4個、優選2個、尤其是1個雙鍵。基團A為氧或NH-基。用作磷脂的優選為磷脂酸(1，2-二醯基-sn-丙三醇-3-磷脂酸，磷脂醯膽鹼(1，2-二醯基-sn-丙三醇-3-磷醯膽鹼)，磷脂醯乙醇胺(1，2-二醯基-sn-丙三醇乙醇胺)，磷脂醯絲氨酸(1，2-二醯基-sn-丙三醇-3-磷醯絲氨酸)和磷脂醯肌醇(1，2-二醯基-sn-丙三醇-3-磷醯肌醇)，且當這些磷脂來源於動物例如雞蛋時，還為鞘磷脂和這些化合物的混合物。所提及的1，2-二醯基磷脂在一定的條件下、如磷脂酶的酶促影響下，可部分地水解。根據磷脂酶的性質，可使1，2-二醯基磷脂中的R1、R2、R3或[R3OPO2]-被氫置換。當磷脂分子中上述至少一個基團被水解後，則生成所謂的溶血磷脂，尤其是溶血磷脂醯膽鹼，溶血磷脂醯乙醇胺，溶血磷脂醯肌醇，溶血磷脂醯絲氨酸和溶血磷脂酸。這些溶血磷酸也適用作為本發明的添加劑，用來穩定含有脂酶和蛋白酶、特別是胰酶製劑的消化酶混合物。用作糖脂的可以是植物中存在的式II的所謂植物糖脂及其混合物式中R5和R6各自獨立地為具有10-25個碳原子的烷醯基，烷基鏈上可任選含有1-4個雙鍵；或者R5和R6是氫，但R5和R6不能同時都是氫；R7是單-或雙糖基，糖選自D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖。若式II化合物中R5和R6為烷醯基時，可為直鏈或支鏈的，通常是含10-25個碳原子、優選為16-20個碳原子的直鏈烷醯基。烷醯基可任選地含有至多4個雙鍵。用作烷醯基的尤其是長鏈脂肪酸，如棕櫚酸，棕櫚油酸，硬脂酸，油酸，亞油酸，亞麻酸或花生酸。R7基為單糖或雙糖基，是由D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或D-果糖等糖分子組成，R7尤其優選為D-半乳糖(即單半乳糖基-甘油二酯，MGDG)或二半乳糖(即二半乳糖基-甘油二酯，DGDG；1，2-二醯基-〔α-D-半乳糖基(1→6)-β-D-半乳糖基(1→3)〕-sn-丙三醇)。通式I的磷脂和通式II的糖脂分子中丙三醇主鏈的中間碳原子可為手性中心，可呈R-或S-構型。本發明的式I和/或式II的化合物可以以其單個的立體異構形式及其相應的混合物形式應用。按本發明，為了對含有脂酶和蛋白酶、特別是含有胰酶的消化酶混合物的藥劑進行穩定化，宜於用這樣的脂質混合物它們可以從自然界獲得，是不同磷脂的混合物，並任選地有各種糖酯。天然磷脂混合物的優選實例可提及卵磷脂。這些天然卵磷脂可來源於植物如大豆，向日葵，油菜籽，玉米或花生，也可來源於動物或動物製品，如蛋黃或腦組織，還可來源於微生物。天然來源的卵磷脂通常可由不同的供貨源買到。植物中獲得的卵磷酯、特別是大豆卵磷酯、尤其是富含磷脂的大豆卵磷脂，例如膦脂含量大約98％的大豆磷脂適於本發明的應用目的。未經處理的、植物中非富含磷脂的卵磷脂通常含有一定量的植物糖脂。自天然獲得的卵磷脂是各種磷脂的混合物，並且若來源於植物，也會含有糖脂，其組成不是單一的，而是取決於其來源的不同而改變。因而，除了上述的成分之外，還含有少量其它的磷脂。表1列出了一些未經處理的、未富集的天然來源的市售卵磷脂的平均組成。表1一些卵磷脂的組成(％)本發明的穩定化了的藥劑含有優選含胰酶製劑的消化酶混合物。自哺乳動物胰臟中分離的胰酶製劑可認為是本發明範圍內的胰酶，它的活性蛋白水解酶的含量可任選地通過對原來含有的蛋白酶-酶原的自動裂解作用而提高。在本發明的穩定化藥物製劑中含有胰酶製劑的消化酶混合物可優選自哺乳動物胰臟得到的胰酶製劑，尤其是豬胰酶製劑，它是各種消化酶的混合物。適於作為助消化劑而有益於人的營養的哺乳動物的胰酶製劑。含有人類所必需的、並非永遠足夠量的脂酶。因而這樣的胰酶製劑例如可添加入由微生物獲得的脂酶。這樣得到的胰酶-脂酶混合物是適宜的酶混合物。在從哺乳動物中分離的胰酶中，存在有蛋白酶，當胰酶不被進一步預處理時，通常大部分是以可被裂解的、非活性的前體，即以酶原形式存在。因而為藥用目的，由本身已知的、適宜的沉澱方法自胰臟得到的粗胰酶製劑還要經過一個水解處理(自溶作用)。在此處理過程中，酶原轉變成活性的蛋白酶。在該自溶地預處理過的胰酶(後面簡寫為F-胰酶製劑)中，存在特別高含量的活性蛋白酶，以致使該F-胰酶的脂解活性受到特別大的損害。本發明應用的複合脂質特別適宜於將含有F-胰酶的藥劑的脂水解活性穩定化。意外地發現，脂酶活性的穩定化不是通過使含在混合物中活性的蛋白酶失活實現的，用這樣的方式穩定的酶混合物既有澱粉水解和脂質水解活性，也有蛋白水解活性。在本發明保護性藥劑中含有的、含有胰酶的消化酶混合物除含有胰酶外，還含有這樣的脂酶，如在植物或微生物中所含有的脂酶、來自微生物的脂酶是由例如細菌或真菌發酵液而來，如黴菌類的根黴菌屬。在本發明保護性藥劑中的、含胰酶製劑的消化酶混合物中，另外的蛋白酶成分還可以是其它的動物和植物蛋白酶。以及尤其是自微生物如細菌或真菌的蛋白酶，如黴菌中的麴黴屬中獲得的那些。無胰酶的消化酶混合物可含有作為脂酶的、可由植物或微生物中得到的那些。由微生物中得到脂酶可以是可自細菌或真菌如黴菌中的根黴菌屬得到的那些。在無胰酶的消化酶混合物中含有的蛋白酶可考慮用動物或植物的蛋白酶，特別是來自微生物如細菌或真菌、例如由黴菌麴黴屬得到的蛋白酶。本發明的藥劑除含有消化酶混合物和複合的脂質外，還含有其它的水溶性藥用助劑和/或添加劑。例如可含有載體物質如碳水化合物如甘露糖醇，或可溶性蛋白以及防腐劑。本發明的消化酶混合物藥劑可以是水溶性粉劑，它除了含有胰酶(尤其是F-胰酶)外，還含有足夠量的複合脂質，以穩定因潮溼的影響所導致的脂水解活性下降，並且還任選地含有另外的已知的水溶性助劑和/或添加劑。為了製備水溶性粉劑，可將水不溶性成分去除。為此，將F-胰酯的水溶性成分用適當的已知固體分離方法與不溶性的固體物質分開，例如用離心或過濾法分開；得到的溶液任選地加入助劑和/或添加劑後，按照已知的方法進行滅菌。然後將得到的澄清的、任選滅菌的溶液中的成分用已知方法進行乾燥例如冷凍乾燥而得到固體。這樣得到的製劑適宜製備在數小時(例如至多8小時)內穩定的無細菌生長的溶液，後者可用例如探針的方法給患者連續地經胃腸道給藥。連續給藥是指不間斷地給以含有本發明藥劑的、必要時是滅菌的水溶液，給藥時間是一兩小時到數小時，至多8小時，大約過夜給藥。溶液的連續給藥可方便地經探針給到消化道中，例如胃或小腸中。添加卵磷脂的作用主要取決於酶混合物中脂酶/蛋白酶的相對比例。例如這樣的酶混合物是適宜的脂酶/總蛋白酶的比例大約為5∶1到30∶1，測定各自的活性是按照「國際藥學聯盟」(以下簡稱FIP)規定的方法(參見R.瑞森和A.洛維斯藥物酶，科學出版公司，根特，1978，74-82頁，以後簡寫為「洛維斯」)，相對活性單位簡寫為FIP-E/g。按本發明，在含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的、特別是含胰酶的消化酶混合物的藥劑中使用的複合脂質添加劑的基本作用是使該藥劑穩定化，以防止在溼氣的影響下脂水解酶活性的降低。溼氣主要指水性溼氣。它可為從消化酶混合物粉劑中含有的極少量的溼氣直至將此粉劑變成水性劑型的溼量。在製備和加工藥劑中所用的含胰酶的消化酶混合物時，按本發明的複合脂質添加劑已被證明可在製備或獲得工藝步驟中有利地使脂水解活性穩定化，因為在處理過程中，它會導致脂酶發生失活。例如溼氣引起酶混合物活性的失活。在含有消化酶混合物的藥劑水溶液中，加入的複合脂質尤其是卵磷脂的穩定化作用還取決於製劑的pH值，本發明藥劑的pH範圍為3.5-9.0，優選為4.0-7.0，尤其優選的pH範圍是5.0-6.5。為了使消化酶混合物的水溶性藥劑中的脂水解活性達到明顯的穩定化，並且為了用探針應用此水溶液劑型的目的，要加入一定的起碼量的複合脂質。本發明藥劑所用的消化酶混合物中應具有的、以活性單位表示的脂酶含量通常是，當只含有哺乳動物胰臟分泌的脂酶時，例如為2000-200000FIP-E/g，而來自微生物的脂酶單獨應用或與胰臟的酯酶合成時，則為2000-500000FIP-E/g。以固體的含胰酶製劑的消化酶混合物計，加入的複合脂質的量至少為1％(重量)，例如為1-10％(重量)時，則可呈現顯著的穩定化作用。加入較大量的複合脂質也是可行的，但不會對脂水解活性有進一步的穩定性改善。因此，為了使胰酶或胰酶與外加的脂酶的混合物穩定，加入的複合脂質、尤其是卵磷脂宜加入至少1％(重量)、優選為2-5％(重量)，尤其優選為大約3％(重量)的卵磷脂。使用本發明的複合脂質，可以使容易迅速降低脂酶活性的、含有消化酶混合物的藥劑水溶液穩定化，以致使混合物中含有的脂酶的脂水解活性在較長時間內只有微小的下降。這樣，在水溶液中經加入卵磷脂而穩定化的F-胰酶，在室溫下溫孵8小時，其脂水解活性是開始活性值的85％。用複合脂質穩定的水性F-胰酶溶液在24小時溫孵後，脂水解活性仍有開始值的50％。但沒有穩定化的對照液在同樣條件下8小時後脂水解活性只有開始活性的20％以下。經本發明對其水溶性藥劑的穩定化，含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物可對抗在水性介質中脂水解活性的降低，從而開闢了這樣的可能性即給患者的胃腸道中連續地輸入該消化酶混合物的水溶液。這樣的水溶液自然應無細菌生長，最好是滅菌的。無菌生長的溶液例如可以加入防腐劑，以阻止細菌的繁殖。按本發明，將用來製備適宜於以探針的方法連續輸入到胃腸道中的水溶液，製成藥盒的形式，為對抗該水溶液中的脂水解酶活性下降而使之穩定化，它是無細菌生長的水溶液，其特徵在於，該藥盒含有以下成份a)水溶性固體的和無細菌生長的藥劑，藥劑為含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物，並可任選地含有足以使製成的水溶液穩定化的複合脂質、以防止脂水解酶活性的下降；和b)為了製備該水溶液所需的足夠量的無細菌生長的水性溶劑，後者除水外，還可含有生理可容性鹽和助劑，並且，若在a)項所列的固體藥劑中沒有足夠量的、用於使待製成的水溶液穩定化、以防止脂水解活性下降的複合脂質，則此處含有上述所需足夠量的複合脂質。特別地，在藥盒中所用的固體配方a)為一種凍幹的、含有脂酶和蛋白酶、並任選含有複合脂質的消化酶混合物。該消化酶混合物優選為含胰酶的消化酶混合物。沒有細菌生長的水溶液可通過添加本身已知的防腐劑例如對羥基苯甲酸酯而得到。無細菌生長的滅菌溶液可通過已知的滅菌方法獲得。在藥盒中含有的脂質可優選地作為在消化酶混合物(成分a))中已經含有的添加劑形式存在。為了製備已含有複合脂質的消化酶混合物的粉劑，例如可將複合脂質的任選無菌的溶液與消化酶混合物的任選無菌的溶液相混合，隨後再按照已知的方法如冷凍乾燥使其乾燥。為了能夠得到用探針應用的溶液，須將含有複合脂質和消化酶混合物的粉劑與藥盒中含有的溶劑。並任選地在乏菌或無菌條件下進行混合。然而複合脂質也可以已經存在於溶劑(成分b))中，例如作為膠體而溶解。為了得到可用探針給藥的溶液，在這種情況下必須將含有複合脂質的水溶液或膠體溶液與消化酶混合物(成分a))任選在無菌的條件下加以混合。實施例1.用大豆卵磷脂穩定水性胰酶溶液的脂水解活性為了確定在胰酶製劑的水溶液中加入或不加入複合脂質時脂水解活性的不同變化，進行相應的試驗，並於30℃溫孵。按照「國際藥學聯盟/歐洲藥典」的方法(以後簡稱FIP/ph.Eur，參見Lauwers，第74-82頁)，由溫孵試樣來確定脂酶活性隨時間的變化。這個標準測定方法可測定受試樣品在水解條件下對橄欖油甘油三酯水解的脂酶活性，並且在pH9條件下用氫氧化鈉滴定游離出的羧酸。這樣，試樣的脂酶活性可以用比較速度加以測定，即用該試樣水解橄欖油的速度與胰臟-對照粉末和同樣底物的懸浮液在同樣條件下的水解速度進行比較。1.1.無卵磷脂添加物的脂酶穩定性的研究79.35mg水溶性的、脂水解活性為50473FIP-E/g的凍幹F-胰酶製劑溶解於4.0ml冰冷的純水(Nanopur巴恩司臺德廠出品)，用1NHCl調節pH為6.2，然後用純水稀釋到5.0ml。立即測定該起始的脂水解活性(「零分鐘試驗」)其餘的物料於30℃水浴中溫孵。採樣時要很好地混合該物料，用適宜的吸液管吸取，立刻與冰冷的脂酶溶劑稀釋，以使用於脂酶測定的體積為0.5～1.5ml、脂水解活性為8-16FIP-E/ml的試樣溶液可隨時供用。根據FIP/PhEru.的規定，脂酶溶劑是一種由10.0gNaCl，6.06g三-(羥甲基)-胺甲烷(簡寫為「Tris」)和4.9g馬來酸酐於900ml純水中組成的溶液，用4N氫氧化鈉調節其pH為7，然後用純水定容成1000ml。為了評價脂酶活性的時間過程，在15，30，60，120和180分鐘後，從該絕熱的物料中取樣，每個檢樣要在30分鐘以內按照FIP/ph.Eur.(Lauwers，78頁)的方法測定其脂酶活性。「零分鐘試驗」得到的、以FIP-E/ml單位表示的脂酶活性表示為100％，進一步溫孵時間測定的活性值以該值的百分數計，結果列於表2。1.2.有卵磷脂添加物的脂酶穩定性的研究為了製備卵磷脂溶液，於室溫下將100mg大豆卵磷脂(Roth公司出品，磷脂含量大約為98％)與少量純水分散，然後稀釋成20.0ml。該混合物超聲攪拌大約2分鐘，直到成均勻的膠體溶液。然後將80.0mg水溶性的凍幹的、脂水解活性為54694FIP-E/g的F-胰酶溶解於4.0ml的純水中，用1NHCl調節該溶液的pH至6.2，再加入0.4ml卵磷脂溶液(以使用的F-胰酶粉劑計，含卵磷脂2.0％)，在良好的混合下用冰冷卻的純水將該物料稀釋到5.0ml.按照1.1項所述，在各個溫孵時間取樣並測定脂水解活性，結果列於表2。表2.加或不加卵磷脂的胰酶水溶液的脂水解活性的變化2.胰酶的水製劑的脂水解活性在8小時後的穩定性胰酶水製劑的脂水解活性的喪失取決於多種因素，如溫度、pH值、所含蛋白酶的蛋白水解的活性。經加入複合脂質如卵磷脂，經25℃下8小時溫孵，可穩定其脂酶活性。在下面的試驗中，對於加或沒加複合脂質的F-胰酶的水性懸浮液和水溶液在8小時內的脂水解活性作了比較。2.1.溫孵物料的製備為了進行對比研究了在加或不加入卵磷脂的情況下F-胰酶的澄清溶液和懸浮液。製備如下的水性製劑a)不加卵磷脂的胰酶溶液按照1.1項所述，將77.5mg水溶性的凍幹的F-胰酶粉劑溶解於冰冷的純水中，用1N鹽酸調節pH為6.2。b)加入卵磷脂的胰酶溶液按照1.2項所述，將81.0mg水溶性的凍幹的F-胰酶粉劑溶於水中，調節至pH為6.2之後，與0.94ml卵磷脂溶液混合，用冰冷的純水定容成5.0ml。c)無卵磷脂的胰酶懸浮液2.0gF-胰酶與100ml冰冷的純水中攪拌30分鐘，得到渾濁的懸浮液。d)有卵磷脂的胰酶懸浮液2.0gF-胰酶與100mg大豆卵磷脂(ROTH公司)混合，並在100ml冰冷的純水中攪拌30分鐘，得到渾濁的懸浮液。2.2實驗過程從2.1項製備的冰冷的溶液或懸浮液中、在製備後立即取出用於測定脂水解初始活性的試樣(「0分鐘試樣」)然後其餘的物料在試劑瓶中、在25℃溫孵8小時。在這個時間內，30分鐘後取樣，然後每小時取樣。原則上按1.1項所述取樣、稀釋並測定脂酶的活性。實驗溫度與前述過程有偏差，現在為25℃。溫孵物料的「0分鐘試樣」的脂酶活性(以FIP-E/ml表示)作為100％，對其餘溫孵時間取樣所測定的活性值表示為該值的百分數，結果列於表3和4內。表3.加和不加卵磷脂時胰酶溶液在8小時內脂酶穩定性的變化樣品卵磷脂含量(％)pHt小時後脂水解的活性(％)00.512345678a)-6.2100726447363027242119b)5.86.2100979896989492898585表4.有和沒有卵磷脂加入時胰酶懸浮液在8小時內脂酶穩定性的變化樣品卵磷脂含量(％)pHt小時後脂水解的活性(％)00.512345678c)-7.1100725643342925211816d)57.11009797928477726964603.加入複合脂質後微生物的脂酶對抗微生物的蛋白酶的穩定化下面的試驗表示，在加入了複合脂質後，在有活性微生物蛋白酶的存在下，微生物脂酶的活性也會被穩定。為此製備3種試驗溶液，它們分別含有微生物脂酶，微生物脂酶加微生物蛋白酶，以及加有卵磷脂的微生物脂酶加微生物蛋白酶。然後測定這些試驗溶液的脂水解活性並列表加以比較。3.1試驗溶液的準備製備如下的溶液a)脂酶溶液245mg其活性為170000FIP-E/g的米根黴的脂酶(脂酶7-AP15，阿瑪諾製藥公司(株)，名古屋，日本)溶解於50ml冰冷的1％氯化鈉溶液。b)蛋白酶溶液390mg活性為7600FIP-E/g的麴黴屬蛋白酶(原酶6，阿瑪諾製藥公司(株)，名古屋，日本)溶解於25ml冰冷的1％氯化鈉溶液。c)卵磷脂溶液1g卵磷脂(ROTH廠出品，大豆純卵磷脂，磷脂含量約98％)用40ml純水(Nanopure，Barnstea公司出品)超聲振蕩約2分鐘成膠體溶液。於冰浴中由這個溶液製成總體積各為5ml的如下溫孵溶液。所有製得的溫孵溶液的pH值於37℃為6.5。表5.測定米根黴脂酶活性的溫孵溶液3.2試驗過程製成後，由冰冷的溫孵液I、II、III立即取出用於測定起始活性(0分鐘試驗樣品)。3個物料的其餘部分於37℃水浴中保溫。取樣時物料要很好地混和，用適宜的移液管量取樣品液，立即按照1.1項所述用冰冷的脂酶溶劑稀釋。該樣品液製成一定量(如表6中「X」所示)並用1％氯化鈉溶液稀釋成5ml。由這樣的試驗溶液中各使用0.5ml進行脂酶活性試驗。表6.製備試驗溶液所取出的樣品量.3米根黴-脂酶活性的測定米根黴-脂酶的催化活性是用測定游離脂肪酸量確定的，脂肪酸是於pH7.0、37℃和一定的時間內，在0.025％牛磺膽酸鈉的存在下，由橄欖油乳劑生成。為了保證能測定所有的脂肪酸，最後測定到pH9.0。用底物-乳劑滴定作空白試驗。測定可以被滴定的、但不具有脂酶活性的物質。受試物質的米根黴-脂酶活性是通過對在同樣的水解條件下橄欖油乳劑被受試物質懸浮液的水解速度與橄纜油乳劑被米根黴-脂酶對照品懸浮液水解的速度相比較而確定的。試劑1.水純水用Barnstead公司出品的「Nanopure」純水，以後用「純水」表示。2.阿拉伯膠溶液110g阿拉伯膠和12.5g氯化鈣於純水中攪拌(大約3小時)溶解，定容到1000ml，離心。溶液裝入250ml塑料容器內，-20℃保存。阿拉伯膠的規格德國藥典第10版/歐洲藥典，氯化鈣，分析純。3.底物乳劑130ml橄欖油與400ml阿拉伯膠溶液(2)用適當的攪拌器高速攪拌15分鐘，使之乳化，溫度保持在30℃以下。乳劑中至少90％的油滴直徑小於3μm，且沒有大於10μm的油滴。該乳劑當日用現制。橄欖油為德國藥典規格，冰櫃中保存。4.0.5％(m/v)牛磺膽酸鈉溶液0.5g牛磺膽酸鈉(脂酶活化混合物，為共軛的沒食子酸與牛磺膽酸鈉的混合物)溶解於100ml純水中，該溶液當天用現制。牛磺膽酸鈉(脂酶活化混合物)，規格FIP。5.1％(m/v)氯化鈉的純水溶液6.pH4.5緩衝液2g氯化鈉和9.2g磷酸二氫鈉溶解於大約950ml純水中，用鹽酸調節pH為4.5，用純水定容成1000ml。氯化鈉為分析純，磷酸二氫鈉NaH2PO4×H2O7.0.1N氫氧化鈉溶液對照懸浮液米根黴-脂酶對照樣品在緩衝液(6)中攪拌，用氯化鈉溶液(5)稀釋，直到該米根黴-脂酶溶液的活性為12-18單位(FIP-E/ml)。將一個標準樣(55000FIP-E/g)63mg於15分鐘內於冰浴中溶解於20ml緩衝液(6)中。取該溶液10ml，於冰浴中用氯化鈉溶液(5)稀釋到100ml。取稀釋液0.5ml為試驗液。米根黴-脂酶對照樣FIP(真菌-脂酶，FIP標準)。受試液受試液用I、II和III。試驗步驟在Radiometer公司的「pH-Stat」滴定系統的自動滴定儀上，將pH-Stat-滴定的滴定終點調節在pH為7.0。向該反應容器中加入12.0ml橄欖油乳劑，FIP(3)6.5ml純水(1)1.0ml牛磺膽酸鈉溶液(4)將混合物調節到37.0℃，用0.1N氫氧化鈉溶液(7)調節到pH7.0，然後將滴定管設定為「0」。當要測定對照值時，加入0.5ml對照懸浮液，以使反應開始，或當要測定受試液中的脂酶活性時，則加入0.5ml受試液。10分鐘後，調節pH-Stat-滴定的終點至pH為9.0。當pH值達到9.0(此過程的時間少於30秒鐘)時，滴定被中斷，記錄消耗的0.1N氫氧化鈉量。為了確定空白值，將對照懸浮液和受試液的滴定終點立即設定為pH9.0。用手操作法將反應物料的pH值調節為pH7.0、然後加入0.5ml對照懸浮液或受試液後，立即滴定到pH為9.0。根據0.1N氫氧化鈉的消耗量，計算受試液的米根黴-脂酶活性的FIP-E/ml單位。以受試液I、II和III測得的脂酶起始活性的FIP-E/ml單位定為100％。繼續溫育1小時期間測定的活性值以基於起始值的百分計，列於表7中。表7.大豆卵磷脂對米根黴-脂酶活性的穩定化4.藥物製劑的實施例A)20.0gF-胰酶溶於400ml水，加入1N鹽酸，以迅速調節pH到6.2。於此條件下、4℃萃取1小時。離心(53000g)澄清的、含有胰酶萃取液的上清液，過濾，濾液經2μm孔徑濾器無菌過濾。B)1.0g大豆卵磷脂(磷脂醯膽鹼含量98％)溶於50ml水，置於磨口玻璃安瓿中，140℃滅菌45分鐘。C)A)項製備的胰酶萃取液400ml與B)項製備的卵磷脂溶液25ml，無冷卻和無菌條件下混和，混和液凍幹，得到16g粉劑，該粉劑在無菌條件下以每份2.5g的量裝入100ml灌注瓶內。5.作為藥用試劑盒的實施例5.1藥盒1A)40.0gF-胰酶溶解於400ml水，用1N鹽酸迅速調節pH至6.2，於此條件下、4℃萃取1小時。離心(53000g)該胰酶萃取液，過濾，濾液經2μm孔徑濾器無菌過濾。萃取液於無菌條件下以每份25ml的量灌裝入100ml灌注瓶內，凍幹。B)2.0g大豆卵磷脂(磷脂醯膽鹼含量98％)溶解於20ml水，超聲均勻化。該膠體溶液於磨口玻璃安瓿中、140℃滅菌45分鐘。取12.5ml與1600ml無菌水混和後，以每份100ml的量裝入灌注瓶內。應用時，將A)項瓶內的固體物質溶解於B)項瓶中的溶液。5.2藥盒2A)40.0gF-胰酶溶解於800ml水，用1N鹽酸迅速調節pH至6.2。於此條件下、4℃萃取1小時，離心(53000g)澄清的胰酶萃取液，棄去沉澱。B)32.0g甘露糖醇溶解於200ml水中，與800mlA)項得到的胰酶萃取液混和，合併的溶液滅菌。C)5.0g大豆卵磷脂(磷脂醯膽鹼含量98％)溶解於50ml水，超聲均勻化。該膠體溶液於磨口玻璃安瓿中、140℃滅菌45分鐘。D)1000mlB)項得到的胰酶萃取液與16mlC)項得到的卵磷脂溶液在無菌條件下混和並凍幹。得到的粉劑以每份10.0g於無菌條件下裝入200ml瓶內。E)在無菌條件下將去離子和滅菌水200ml加到瓶內。使用時將D)項粉劑瓶中的內容物溶解於E項瓶中的水中。權利要求1.複合脂質的用途，用作為在含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的水溶性藥劑中對抗在溼氣的影響下脂水解活性降低的穩定化添加劑，該消化酶混合物適於製備用探針向胃腸道連續給藥的水溶液。2.權利要求1的複合脂質的用途，其中，含脂酶和蛋白酶的消化酶混合物是含胰酶的消化酶混合物。3.權利要求2的複合脂質的用途，其特徵是，複合脂質作為穩定化添加劑加到含有胰酶的消化酶混合物的藥劑中，該消化酶複合物除含有胰酶外，還另含有脂酶，該脂酶選自植物脂酶，細菌脂酶，和來自真菌培養物的脂酶。4.上述權利要求中一項的複合脂質的用途，其特徵是，磷脂，糖脂或它們的混合物被用作為複合脂質。5.權利要求4的複合脂質的用途，其特徵是，磷脂或含有它的脂質混合物被用作為複合脂質。6.權利要求5的複合脂質的用途，其特徵是，通式I的、陰離子與生理相容的陽離子形成的磷脂鹽或它們的混合物用作為複合脂質式中，R1為氫或具有10-25個碳原子的烷醯基，其烷基鏈可任選含有1-4個雙鍵；R2為氫或具有10-25個碳原子的烷醯基，其烷基鏈可任選含有1-4個雙鍵；或當R1不是氫時，R2也可是氫；R3是氫或低碳烷基，烷基可被氨基、低碳三烷銨基、在帶有氨基的碳原子上結合的羧基或者被羥基取代的環烷基等取代；R4是氫或具有10-25個碳原子的烷基，烷基上可任選地含有1-4個雙鍵；A為氧或NH。7.權利要求6的複合脂質的用途，其特徵是，在通式I的磷脂中，R3選自如下基團氫，氨基乙基，膽鹼基，絲氨酸基，丙三醇基或肌醇基。8.權利要求7的複合脂質的用途，其特徵是，所用的磷脂選自磷脂酸，磷脂醯膽鹼，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯肌醇，和鞘磷脂或它們的混合物。9.權利要求4的複合脂質的用途，其特徵是，卵磷脂被用作為複合脂質，它得自大豆，油菜籽，玉米，向日葵，花生，雞蛋或微生物。10.權利要求9的複合脂質的用途，其特徵是，大豆卵磷脂用作複合脂質。11.權利要求2-10中一項的複合脂質的用途，其特徵是，該脂質被加入到在藥劑中使用的胰酶中，胰酶是在其製取或在對抗由於潮溼使藥劑中脂水解的活性下降、並使藥劑穩定化的加工步驟中使用的胰酶。12.含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的水溶性藥劑，該藥劑適用於製備藉助探針向胃腸道連續注入的水溶液，其特徵是，它含有為對抗由於潮溼的影響而使脂水解活性下降、並使其穩定化的、足夠量的權利要求1-10中一項的複合脂質。13.權利要求12的藥劑，其特徵是，含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物是含有胰酶的消化酶混合物。14.權利要求13的藥劑，其特徵是，消化酶複合物除含有胰酶外，還另含有脂酶，脂酶選自植物脂酶，細菌脂酶，和來自真菌培養物的脂酶。15.權利要求12-14中一項的藥劑，其特徵是，它含有這樣數量的複合脂質，它可穩定製劑水溶液的脂水解活性，以致於在8小時內使該水溶液的初始脂水解活性降低至多20％。16.權利要求15的藥劑，其特徵是，它含有這樣數量的複合脂質，使得在24小時內製劑水溶液的脂水解初始活性至多降低50％。17.權利要求12-14中一項的藥劑，其特徵是，為了對抗脂水解活性的降低並使其穩定化，它含有濃度為1-10％(重量)、優選為2-5％(重量)的複合脂質，基於消化酶混合物計。18.權利要求12-17中一項的藥劑，其特徵是，它含有的胰酶是經自溶預處理的胰酶。19.用於製備消化酶混合物的水溶液的藥盒，該水溶液適用於藉助探針向胃腸道連續注入，並是已為對抗脂水解活性降低而使其穩定化了的、無細菌生長的，其特徵是，它含有如下組成成份a)水溶性固體的和無細菌生長的藥劑，藥劑為含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物，並可任選地含有足以使製成的水溶液穩定化的複合脂質，以防止脂水解酶活性的下降；和b)為了製備該水溶液所需的足夠量的無細菌生長的水性溶劑，後者除水外，還可含有生理可容性鹽和助劑，並且，若在a)項所列的固體藥劑中沒有足夠量的、用於使待製成的水溶液穩定化、以防止脂水解活性下降的複合脂質，則此處含有上述所需足夠量的、根據權利要求1-10中一項的複合脂質。20.權利要求19的藥盒，其特徵是，固體製劑a)是凍幹的、含有脂酶和蛋白酶並任選含有複合脂質的消化酶混合物。21.權利要求20的藥盒，其特徵是，凍幹的消化酶混合物含有胰酶。全文摘要本發明敘述了複合脂質、特別是卵磷脂的用途、它們用作為含有脂酶和蛋白酶、特別是含有胰酶的消化酶混合物的水溶性藥劑的穩定化添加劑,以用來對抗由於潮溼的影響使脂水解活性的下降,該消化酶混合物用來製備藉助於探針向胃腸道連續輸入的水溶液。文檔編號A61K38/46GK1174743SQ97117700公開日1998年3月4日申請日期1997年8月27日優先權日1996年8月28日發明者M·加勒申請人:索爾瓦藥物有限公司